烷基葡萄糖甙的酶催化合成

1996年11月 扭L Y＆ Ic工_s 第6期 一 烷基葡萄糖甙的酶催化合成 -一 垫主苎／承民联 (江苏石油化工学院 ，常州，21301 6) 舟绍了吸附法固定糖甙酶的方法及用此 固定化酶和 由的糖甙酶催化合成烷基葡萄糖甙的工 艺 在酶 催化合成烷基葡萄糖中，水的含量对反应起了关键性的影响，最佳的含水量在 8 ～1o 左右，反应物含水量 高 ，则开始时的反应速度大 ，但最终平衡的产物浓度却较低，反之亦然；烷基链 的长度既影响反应速度又影响 平衡产量，链越长，反应速度和平衡产量越低 ·用于固定酶的载体对固定酶的活性有较大的影响，使用不同的 载体酶活力可相差 3倍以上。用固定酶可以解决酶的重复使用问题 关舅词 筮苎塑童塑煎 ! 垦 塞 酲艟 合成 1 前 言 包 剂 在碳水化合物类的表面活性剂 中，糖类脂肪 酸酯和烷基葡萄糖甙是二大类用途最广的非离子 表面活性剂。它们无毒、对皮肤无刺激作用、生物 降解性好 ，在 日化、食品和医药行业得到了广泛的 应用。 化学合成这二类表面活性剂，需基团的保护 和去保护步骤 ，经多步反应方能合成“]。不仅如 此 ，反应产物纯度低 ，副产物多。Fregapane Gc 等 人曾分析过化学台成的失水三梨糖醇月桂酸酯的 组成 ，发现副产物多达 65种。化学台成的糖甙通 常纯度约 8o 。张剑 的分析图谱显示 ，产物组 成复杂，其中有烷 基单甙、多甙、残糖和缩聚的二 糖等副产物 作为食品添加剂使用时，这些副产物 的安全性是值得怀疑的。酶催化反应具有专一性， 不生成副产物 ，特别是具有立体专一性 ，只对立体 异构体的其中之一起催化作用的特点 ，加上反应 条件温和 ，能耗低。因此酶催化是制备高纯度产物 的一个重要方法。 但是长期以来人们把酶看作是一种十分精细 娇气的催化剂．只适用于水相反应 ，根本不适用于 非均相的反应混合物，尤其是在较高的温度和在 有机溶剂存在的情况下。然而 自Klibanov A M— 和 Dordick J Sf s?发现．在几乎无水的情况下，酶不 仅能生存，而且能很好的起催化作用以来，酶在表 T 3 ／ 合成中的催化作用得到了广泛重视。 在碱性条件下，烷基葡萄糖甙 比糖类脂肪酸 酯更为稳定，因而适用范围更广。酶催化台成糖脂 肪酸酯的研究工作早 已进入 中试阶段“。，相 比之 下，酶催化合成烷基葡萄糖甙的研究尚处于探索 阶段。 2 酶催化合成糖甙的工艺 2．1 自由酶催化反应 在几篇文 献中” ，合成烷 基葡萄糖 甙用的 是自由酶。典型的方法如下：反应混合物由用醇饱 和的 0．3 mL 、pH 5．5、浓度为 0．2 mol／L醋酸 盐 缓 冲液 (其 中葡萄糖 浓度 为 2．5 mol／L)，5 mL 一糖甙酶及 5 mL用醋酸盐缓冲液饱和的反 应醇。在此混合物中，有机相对水相的比为 16．7。 将该反应混合物在强烈的搅拌下反应 ．反应温度 60℃。如果反应时间较长 ，考虑到酶的失活要补 加一部分酶 。定时抽取 0．2 mL的有机相用高压 液相色谱分析组成。 2．2 固定酶催化反应 用 自由酶的反应 ，酶的回收利用比较麻烦。有 些研究者 ” 研究了用固定化酶作催化剂台成 烷基葡萄糖甙，用吸附法将酶 固定在多孔 的高分 子载体上。酶 的固定化工艺简述如下 ：10 g高分 收稿 日期 ：1996—06 28‘修改璃收到日期 1996一】n 24 维普资讯 http://www.cqvip.com 第6期 全易等．烷基葡萄糖甙的酶催化台成 子载体 XAD一4用 200 mL浓度为 10 mM、pH 5．5的醋酸钠缓冲液洗涤数次 ，随后用蒸馏水洗 涤、抽滤。洗净的载体 XAD一4用氮气流干燥，干 燥 的 XAD一4存放于用 P O 干燥的真空干燥器 中待用。将糖甙酶溶解于 10 mM 的醋酸钠缓冲液 中，然后加入载体XAD一4。用量为 20 mg酶／mL 缓冲液／1 gXAD一4。经充分混合吸附后 ，在氮气 流下干燥。 把上面制备的 0．75 g固定酶放入一反应瓶 中，井加入 20 mL醇和溶有 0．5 g葡萄糖的 1 6 mL、pH 5．5的 50mM 醋酸盐缓冲液。将反应瓶 密闭后置于恒温培养箱 内，反应温度 50℃，摇动 频 率 150次／mln。每隔一定时间间隔取样 0．2 mL，用高压液相色谱仪分析产物组成。 3 影响催化反应的主要因素 3．1 水含量的影响 水的含量是影响酶催化反应的最重要的因 素。糖甙酶既能催化醇和葡萄糖之间的缩合反应， 也能催化其逆反应——糖甙的水解反应。在水含 量较高时，催化水解反应是主要的i在水含量较少 时，催化缩合反应是主要的。但是在无水的情况 下，迄今还没有观察到酶的催化作用。对缩合反 应，最佳的含水量在 8 、10 。如图 1所示。 { 薹 鬻 水音量／ ·“ 1 zK舍 量对反应 速度 和产 量的影 响 i．反应 1 h 2反应 24 h 但是 Gudrun Ljunger_1 的研究结果表明 反 应物含水量高 ，则开始时的反应速度大，但最终平 衡的产物浓度较低。反之 ，含水量低时开始的反应 速度较低，但最终的平衡产物浓度却较高。实验结 果见图 2。 据此，研究者将反应开始时的水分含量提高， 随后逐渐减少系统水分含量 ，这样既使反应开始 时有较高的反应速度，又能得到较高的最终产物 浓度。结果示于图 3。 苫 E 略 {L 图 2 水分含量对反应速度和产量的影响 相对于醇的水分含量 l一 13．6 2一 lO．8 3— 6．8 4— 4．o 5— 4．o 时 闻，h 删 3 控 制球分 含量提 高反应 速度 和收率 1一开始时含水量 13．6 ，最蜂降到4．O 2一水含量 13．6 3一水含量 4 O 3．2 烷基链长度的影响 烷基链的长度既影响反应速度，也影响平衡 的产量。链越长 ，反应速度和平衡产量越低 。这可 能是由于烷基链越长，在水相 中的溶解度越低的 缘故。Chahid等 认为酶催化链长大于 7的高碳 醇和葡萄糖之间的反应就 比较困难了。但 Chaiya Panintrarux 的研究表明：链长大于 7的高碳醇 和葡萄糖之间的反应还是可以用酶催化的。链长 对反应速度的影响见图 4。 维普资讯 http://www.cqvip.com 精 细 石 油 化 工 圉 4 不同链长烷 基葡萄 慵甙浓 度和 反应时阃 的关 系 反应条件：温度 60 ct有机相／承相一16．7 图中数字为链长度 3．3 载体的影响 Vulfson Evgeni N等【”一在葡萄糖基交换反 应中曾研究过载体对催化反应速 度和产率 的影 响 表 1中数据表明，载体的类型对反应速度有较 大的影响。 表 】 载体类型对反应速度的影响 己醇基葡萄糖甙／ram 载性类型 1 h 6 h 24 h XAD 一2 4 2 8 7 1O．8 XAD 一4 4 8 9 0 9．8 XAD 一7 < 1．0 5 2 6 2 XAD一8 < 1．0 4 2 7．6 XAD 一18 6 2 9．8 12．2 CPG 3 4 8．D 8．4 Ce Lite < 1 0 2．0 3．0 SHA < 1．0 6．0 7．4 3 4 固定酶的重复使用性能 Gudyum Ljunger在合成辛基葡萄糖甙时试 验了固定酶的重复使用性能，结果见图 5。固定化 酶解决了酶的重复使用问题 。 4 结 论 用糖甙酶催化合成烷基葡萄糖甙是可行的， 工艺简单，一步反应就可完成，产物纯度好，这是 酶催化台成的特殊优点。但酶催化反应的转化率 较低，反应速度 较慢，这又是酶催化反应的致命 的弱点。 = E 甚 甚 霹 {L ／ l I ／ ／ 时 闻 ，d 图 5 固定爵 的重复 使用试 驻 但是通过工艺参数的优化，进一步提高反应 速度是可能的。注意到开始时的反应速度较大 ，如 果能开发一个快速而方便的分离方法 ，将产物及 时从反应物 中分离出去，如果能开发一种具有高 表面积的反应器，如象糖酯化反应所用的空心纤 维生物反应器 ，那么实现工业化是很有希望 的。 参 考 文 献 1 Pau Lsen H．Chem Soc Rev，1984，13：l5～ 45 2 Tv J H P Sur~actants in Lipid Chemistry：Recent Syn— thetiet Physical，and Biodegradative Studies UK ：Royal So eiety of Chemistry 1993t 22~ 24 3 张剑．日用化学工业 ，1998，(5)：31～32 4 KlihanovA M．h nds in Bioehem Sci．1989 14：141~ 144 5 Dordiek J S EnzymeMicrob Teehnol，1989，(¨ )：194～ 211 6 Bjorkling F，et at．TrendsBiotech，1991t(9)：360～963 7 Chaiya Panintrarux al Enz yme M icrob Technol，1995 17：32～ 40 8 Valerie Laroute，et a1．Biotech Letters，1992，14(3)：169～ 174 9 Chahid Z，et al BiotechLetters，1992，14(4)：281～ 284 10 Evgen[N Vulfson，et at．BioteehLetters，1990 (12)：397～ 402 11 Gudrum Ljunger．et a L_Ettzyme Microb Teehnol 1994． (】6)：751～ 758 12 Vulfson N Evger6，et a1．Enzyme M bcrob Technol，1990， (12) 950～ 984 13 HogM M ，et a1．JAm OilChem Soe，1984，(61)：776～ 781 维普资讯 http://www.cqvip.com 996年 11月 _FC细IALI石TY馥 尚Ic矗s 第6期 高 ，催化剂可套用回收 关键词：跫至王醒 氢合成 1一氨基一3，6，8一萘三磺酸 申凯华 墨皇 ／ 李树德 百_ 工大学精细化工系，116012) 纸色谱，高教渣相色谱和重氰化滴定方法可对产物进行定性、定量分析 。 ) Pd，C 一 堕 0 l 前 言 1一氨基一3，6，8一萘三磺酸 (简称 T酸)是制 备 H酸的原料。后者为合成染料的重要中间体。 由1一硝基一3，6，8一萘三磺酸(简称硝基 T酸)来 制备 T酸，主要方法有以下几种 I．I 在电解质存在下铁粉还原 铁粉为还原剂，电解质(FeCI：)为催化剂沸腾 温度下还原、离析。此为国内现行工艺。改进 电解 质、铁屑预活化或加入 Na SO 等均 可得高收率 产品 ’ 。该工艺简单 ，但废水废渣处理困难 ，国外 基本 已废弃此工艺 。 1．2 电化学还原 在电解液中，一定温度 ，一定电流密度，Pb或 Pb—Sb台金为阴极还原制得 T酸。该工艺虽然 收稿 13期 1995—05—09；修改稿收到日期 ：1996—1c一04 ENZYM ATIC SYNTHESIS OF ALKYLGLUCOSlDES Quan Yi，Zhao Chongmin and Cheng Minlian (Jiangsu Institute of Petrochemical Technology) Abstract The method of immobilization of glucosidase using absorption，the technology of enzymatic syn- thesis of alkylgluc0sides using free and immobilized glucosidase were introduced{In an enzymatic syn- thesis of alkylgluc0sides，the water content has important effect on reaction rate，the optimum water content is about 8 ～ 1O ．The higher the water content，the faster the reaction rate at the begin— ning of the reaction，but the end equilibrium yield is low．The length of the alkyl chain clearly affects both the equilibrium yield and reaction rate．The longer the alkyl chain，the lower both the yield and rate，The supporter used for immobilization of enzyme has large effect on enzym e activity．The differ ence of enzyme activities for different supporter used may be as high as three times；The reuse of an zyme can be resolved by immobilization． Keywords：alkylglucoside}glucosidase；immobilization{enzymatic；synthesis 维普资讯 http://www.cqvip.com