鸡传染性法氏囊病的病理学研究：I淋巴器官病理组织学变化的发展规律

鸡传染性法氏囊病的病理学研究：I淋巴器官病理组织学变化的发展规律 鸡传染性法氏囊病的病理学研究:I.淋巴器 官病理组织学变化的发展规律 的法氏囊,胸腺,脾, 盲肠扁桃体,哈德氏腺,肝,肾进行病理组织学检查.感染后48h,法氏囊淋巴组织最早出现坏死且长久 存在.其他淋巴器官的病变出现较迟,程度轻微且恢复较快.IBDV单抗免疫荧光检测,法氏囊及其他淋 巴器官中均检测到病毒,接种后12h法氏囊中即检出病毒,持续时间也最长(攻毒后12d),其次是盲肠 扁桃体(攻毒后8d).攻毒13d以后,上述器官均未检测到病毒.法氏囊粘膜上皮的扫描电镜观察,攻 毒后2d,上皮细胞肿胀,微绒毛减少或消失.攻毒后3d,局部上皮细胞坏死,脱落,并向整个粘膜层扩 展,攻毒后10d,上皮层基本修复. 关键词鸡传染性法氏囊病病理组织学免疫荧光病毒分布扫描电镜技术 鸡传染性法氏囊病(IBD)是由IBDV感染引起的 高度接触性传染病,本病以淋巴器官,特别是法氏囊淋 巴组织坏死和以后发生的免疫抑制为特征,成为严重 危害养鸡业的主要疫病之一.采用从扬州地区发病鸡 群中分离的IBDV毒侏,对易感日龄雏鸡进行人工感 染,详细研究了本病的病理形态学发展规律,同时用特 异性强的IBDV单克隆抗体对病原进行检测,找出病原 的分布规律以及与病变之间的关系,并t试验鸡感染 IBDV后法氏囊粘膜上皮超微结构变化进行_『观察. 1材料和方法 1.1试验动物12O只非免疫京白一1号雏鸡,17只 SPF雏鸡.雏鸡自由采食和饮水,饲养至28日龄供试 验用. 1.2病毒来自IBD自然发病鸡法氏囊,两次通过 SPF鸡后,接种9日龄鸡胚,收集36,56h死亡鸡胚的 尿囊液,保存备用.应用SPF鸡测得该毒侏的LD为 10”,0.2mL. 1.3IBDV单屯隆抗体由扬人农学院微生物教研组 提供,工作效价为1:1O0. t.4羊抗鼠荧光抗体Sigma公司产品.NO.F— C,257,工作效价为1:2O. 1.5动物分组将120只28口龄口一1号鸡分成 收稿日期:1997—11—19 — 6… 两组,试验组7O只,对照组5O只.SPF鸡分为试验组 13只,对照组4只.隔离饲养. 1.6病毒接种试验鸡于28d经眼,鼻和口腔同时接 种上述保存的病毒0.2mL(生理盐水1:100稀释).对 照组不作任何处理. 试验组京白一1号鸡分别于接毒后6,12和13h, 1,15,2和2.5d各一次,3,14d每天一次,每次随机 扑杀3只,对照组同步扑杀,每次2只. 试验组SPF鸡于接毒后1,5d,每天1次,7,10, 12d各一次,每次扑杀1只,对照组于1,3,7和12d各 扑杀1只. 试验过程中,自然死亡病鸡,立即剖检采取病料. 1.7法氏囊粘膜扫描电镜样品的制备将法氏囊剪 开,翻出粘膜面,生理盐水冲洗面悬浮物.用双面刀 片切成4>(4mm的小块,2.5戊二醛固定,48h后.厢 0.01M,pH7.2的PBS反复冲洗至无戊,醛气味.逐级 内酮脱水,醋酸异戊酯置换2h’HcP一2临界点f燥仪 干燥,在IB一3型离溅身喷镀仪上2mA喷镀75秒, H一300扫描电镜观察和摄影. 1.8病理组织标本的制备对不同时间扑杀的雏q 和病死鸡剖检.采集法氏囊,稗:胸腺,肖肠扁桃体,Il 德氏腺,肝和肾等器官组织,用1Ol{1性福尔马林同 定,石腊切片,厚度5llm,苏木素-_-伊红染色.显微镜 香 中国家禽1998年第20卷第2期ChinaPoultry1998;20(2) 1.9免疫荧光染色标本的制备将不同时间扑杀的 鸡分别采取法氏囊,胸腺,脾,盲肠扁桃体,肝,肾,立即 静J成6微米冰冻切片,一3O?丙酮固定30min,0.0l M,pH7.2PBS缓冲液冲洗,滴加IBDV单克隆抗体于 样本上,置37C水浴箱远离水面上方,孵育30min, PBS冲洗1O×2,再滴加羊抗鼠荧光抗体,同上进行孵 育和冲洗,蒸馏水洗5风干,95甘油封片.在0LYM— PUSBH一2荧光显微镜下观察和摄影. 2试验结果 2.1临诊症状接种IBDV后,约经48h,少数鸡羽毛 蓬松,精神萎摩和排淡黄色稀粪.以后整群发病,表现 为精神高度沉郁,呆立或蹲伏;嗜眠,泄殖腔松驰,排黄 绿色稀粪.攻毒后48~72laE亡2只,72.’v--96h死亡8 只,约102h死亡2只,攻毒后168h剩余鸡精神状态, 饮食及粪便均恢复正常., 2.2肉眼病理变化攻毒后36h,法氏囊轻度水肿, 粘膜面有少量针尖大出血点,68~90h自然死亡和扑 杀鸡的法氏囊均见明显肿大,粘膜表面有出血点或出 血斑,个别病鸡发生弥漫性出血,整个法氏囊壁变成紫 红色.攻毒后96h法氏囊体积开始缩小,出血消失.攻 毒后168h,法氏囊体积仅为对照鸡的1/3,秸旗l皱襞变 平,质地较坚韧.’一 攻毒后48~96h,脾,肝,肾均见程度不等的肿胀 和变性.非免疫鸡攻毒后36,72h,暇肌和腿肌少数有 出 肌 2. 病变明显,淋巴滤泡肿大,皮质层淋巴细胞明显减少或 完全消失,滤泡中央淋巴组织坏死,有红色蛋白性液体 渗出攻毒后35-d,病变范围泛,几乎看不到完整 的iHI_巴撼泡?恭泡的病理变’匕包括三种形蒜第一种是 滤泡盼大,薯囊f个滤泡发生凝固性坏死;变成’圃红染的 网状糍质,有些坏死的滤泡中形成囊腔,含肴均质缸桑 的渗出液(图1!~-Z-f,l’是滤泡皮质层纤维索样坏死, 中央区还留存坏死淋巴细胞核碎屑.,第查种是有些坏 死滤泡发生弥漫性出血(图2>,整个滤泡充满红细村. 滤泡l可问质水肿扩张,有少量嘻异性白细胞散茌浸润. 攻毒后第6dl开始,法氏囊的变化以淋巴滤泡萎缩和滤 泡间多量结缔组织增生为特征.淋巴滤泡体积缩小,淋 巴细胞消失.网状细胞发生水泡变性形成很多空泡,萎 缩的滤泡周围有增生的纤维组织包裹,出现纤维化景 象(图3).在有些区域不见纤维组织大量增生,但间质 中有明显炎性反应,可见大部分淋巴滤泡已经坏死消 失,间质明显增宽,其中有多量嗜异性白细胞,单核细 胞及浆细胞广泛浸润,夹杂一些增生的成纤维细胞.这 种变化在接毒后8d以上的法氏囊表现最明显,这在以 淋巴滤泡坏死为主的早期病例的切片中是看不到的. 在攻毒后13d的一例法氏囊切片中,在炎症区中看到 有再生的淋巴滤泡(图4). 脾攻毒后2d,白髓明显萎缩,数量减少,淋巴细 胞碎裂,有些萎缩自髓的周围有出血1.攻毒后3,4d, 切H-中不见完整的淋巴,网状纤维太都发生纤维 素样变性,白髓中央许多单核细胞发生凝固性坏死,形 成嗜伊红性的小团块.有些残留的中央动脉管壁肿胀, 发生纤维素样变性.攻毒后5d,目髓部分出现新生的 淋巴小结,动脉周围淋巴组织中出碗较多的巨噬细晦, 淋巴细胞和增生的网状细胞.攻毒后6d,脾脏结构逐 渐恢复,淋巴小结再生,d以后脾脏恢复正常.,. 胸腺攻毒2d内未熟明显变化.攻毒后3d’少数 小叶的皮质区,淋巴细胞减少,髓质结构疏松,轻度水 肿,网状支架断裂,其间存有坏死淋巴细胞的碎屑.此 后数天,上述变化变得轻至攻毒后6d胸腺恢复正 常,但有一只坡毒后10d剞杀的SPF鸡,胸腺发生弥? 漫性出血. 肓脑扁桃体攻毒后,2.5d,淋巴细胞数量轻度减 少.攻毒后3d,淋巴细胞数明显减少,网状支架变得清 晰,其问见有较多坏死的琳巴细胞.盲肠壁平滑肌层有 明显的水泡变性.攻毒后d,雠巴细胞成分增加并伴 有轻度结缔组织增生.璎毒后7d基本恢复正常. , 肾.主要表现实质变性从政毒后盘蕾开始,肾小 管土皮发生颗粒变性,部分青管融_tz.廉绷胞脱落和 坏死,管壁结构破坏,集合管上皮水泡变性,有的发生 破裂,间质部分小血管充血,攻毒后6d以后的肾切片 中,可见间质中散在分布较多淋巴细胞增生灶. 或 淋 细 光 细胞分布于整个视野的淋巴滤泡中.攻毒后7d,荧冼 细胞数减少且强度减弱.攻毒后8d,荧光细胞局限r 淋巴滤泡皮质区且数量减少.攻毒后12d,仅见数个发 生微弱荧光的细胞.攻毒13d及以后未见荧光细胞. 一 7一 中国家禽1998年第20卷第2期ChinaPoultry1998;20(2) 脾脏攻毒后1.5d开始出现数个散在荧光细胞. 攻毒3,4d,单个或数个融合的荧光细胞遍布整个视 野.攻毒5,6d,荧光细胞数量减少,零星分布.攻毒7 d后,未见荧光细胞. 胸腺攻毒后2.5d,见到多个细胞浆中充满针尖 大荧光颗粒,单个或多个聚集在一起.攻毒后3d,荧光 圈l接种后2d,法氏囊淋巴滤泡坏死. 中央形成囊腔.含有渗出液 圈2接种后3d,法氏囊淋巴滤泡坏死和出血 强度和荧光细胞数均有增加.攻毒后4d,荧光细胞数 减少.攻毒6d之后,未见到荧光细胞. 盲肠扁桃体攻毒后2d,出现少数荧光细胞.攻 毒后4d,多量荧光细胞融合成片状或网状.攻毒5,8 d,荧光细胞散在分布,偶见数个细胞组成的小荧光灶. 攻毒9d后未见荧光细胞. 圈4接种后13d,法氏囊炎症区中出现 再生的淋巴滤泡 函5接种后2d,怯氏囊牯l膜上皮细囊肿胀, 徽绒毛减少(扫描电镜) 圈篓!曼淋巴滤泡萎缩’问质圈6接种后3d,牯膜上皮细胞严重破坏(扫描电镜)结缔组织大量 增生 中国家禽1998年第2O卷第2期ChinaPoultry1998;20(2) 肝和肾肝脏在攻毒后2到5d仅见单个或数个 零星分布荧光细胞,5d后未见到.肾脏偶见单个荧光 细胞. 2.5扫描电镜观察攻毒后1d,怯氏囊粘膜上皮细 胞无明显变化.攻毒后2d,上皮细胞肿胀,细胞问连接 变得疏松,微绒毛减少(图5).攻毒后_3d,上皮细胞严 重破坏,失去正常结构,仅见少数肿胀,严重变形的上 皮细胞,其余坏死脱落,暴露出深层细胞(图6).该变化 持续到攻毒后7d,此后上皮细胞开始修复,攻毒后10 d,上皮细胞修复基本完整,但细胞层次较多,细胞体积 较小,表面微绒毛不发达,尚有上皮缺损的部分. 3小结与讨论 3.1本研究采用从扬州地区发病鸡群中分离的IBDV 野毒株人工感染非免疫鸡和SPF鸡.感染鸡的潜伏期 为,2d,发病率高达100,病程4-.~5d,感染7d后临诊 症状消失,病鸡耐过恢复.肉眼病变主要是法氏囊发生 水肿,坏死,出血和萎缩.SPF鸡常有明显的胸肌和腿 肌出血,而非免疫鸡则仅在疾病的症状明显期出现少 量出血点,程度很轻.其他器官在肉眼上,不见明显变 化. 3.2从病理组织学检查表明,IBDV主要损害鸡的淋 巴器官,法氏囊,脾脏,胸腺和盲肠扁桃体的淋巴组织 均有坏死变化,其中以法氏囊的病变发生最早和最严 重,持续时间也最长.法氏囊的病变发展很快,攻毒后1 d仅见部分滤泡髓质部轻度水肿但从攻毒后2d开 始,即见法氏囊淋巴滤泡几乎全部发生轻重不等的坏 死和渗出变化.攻毒6d后,在滤泡坏死的基础上,出现 修复性反应,滤泡间结缔组织大量增生,最后导致法氏 囊发生纤维化.与此同时,可见有些间质区域出现明显 的炎性细胞浸润现象,反映出机体的防御应答反应,这 种鸡都是临诊症状已经消失的康复鸡.Okoye(1984)在 研究感染后81d的法氏囊结构后认为,被破坏的法氏 囊滤泡不可能恢复到退化前的正常状态.我们在耐过 鸡的法氏囊病灶中,发现部分淋巴滤泡的再生.在攻毒 后13d临诊上已经康复的鸡的法氏囊炎症区中,就看 到个别再生的淋巴滤泡.脾在攻毒后2d也有淋巴小结 萎缩和坏死变化,但程度比法氏囊轻,持续时问也短. 胸腺和盲肠扁挑体的变化更轻,且都能很快恢复正常. IBDV对法氏囊的破坏程度远远超过其他淋巴器官. Nakai,Hirai(1981)从鸡胸腺和法氏囊中提纯分离出 T,B,N细胞进行体外培养感染试验,结果发现,B细胞 高度易感,而T细胞和N细胞对IBDV的感染不敏感. 进一步用有抗IgG和IgM层析柱对B细胞亚群SIgM 和SI~3B细胞分析发现,大量存在于法氏囊的SIgMB 细胞是IBDV的靶细胞,这又可作为哈德氏腺淋巴组织 无明显变化的依据,因为哈德氏腺中的淋巴细胞主要 是分化产生IgA浆细胞的淋巴细胞. 3.3本研究采用IB自单克隆抗体和羊抗鼠荧光抗体 进行病毒检测,其特异性应比高免血清为高.在法氏 囊脾,胸腺,盲肠扁桃体以及肝和肾中均检测到病毒. 以法氏囊检出的时间最早(为攻毒后12h),持续时间 最长(为攻毒后12d),荧光细胞的强度也最高.脾,胸 腺,盲肠扁桃体,肾等主要是在症状出现后,病毒才被 检测到.各个淋巴器官病毒荧光的数量和强度与相应 器官出现的病理组织学变化的程度也是相平行的. 疾病症状明显期(攻毒后2,7d),只有法氏囊和 盲肠扁桃体始终有效量多,荧光较强的荧光细胞.因 此,免疫荧光诊断最佳器官是法氏囊和盲肠扁桃体. 3.4攻毒13d后,在法氏囊,脾,胸腺,盲肠扁桃体,肝 和肾中均未检测到病毒,这说明此时体内的病毒含量 极少或已经消失.试验结束后一周,我们将试验组多余 的6只康复鸡(7周龄)移入剩余的12只对照组鸡群, 两者混和饲养至11局龄,对照组鸡未见感染发病,采 血分离血清用琼扩试验检测对照组IBDV抗体,结果阴 性.这也可以说明康复鸡(攻毒后3周)已不带毒或不 排毒. 3.5从各器官的病毒荧光检测结果和器官病变的严 重程度看,法氏囊很可能是IBDV的靶器官.病毒侵入 法氏囊,如果是经口感染,IBDV可以从消化道直接进 入法l氏囊通过枯膜上皮侵入淋巴组织;另外,IBDV也 可能经由血液循环到达法氏囊组织.病毒首先定位在 法氏囊淋巴组织,并在其中进行复制,大量病毒释放入 血流,随血流进入其他器官组织,从而引起全身性的病 变这与Muller等(1979)报道的口腔感染病毒,经血液 循环进入法氏囊并在此大量复制,导致明显的病毒血 症’.从而引起其它器官一系列的病变结果是一致的. 3.6SPF鸡接毒后,感染鸡的潜伏期,发病率,病程及 临诊症状与j}免疫鸡基本相同淋巴器官及肝,肾的病 理组织学变化也没有显着差异.唯一不同的是,SPF鸡 在攻毒后2d,胸肌和腿肌即出现严重出血,并持续到 试验结束,而非免疫鸡的骨骼肌仅在疾病症状明显期 出现少量出血点,比SPF鸡轻微,说明SPF鸡对IBDV 的血管反应较非免疫鸡更为敏感. 主要参考文献 1OkoyeJ()A.Vet.Bul1.1984;54:425,436 2NakaiTandKHirai.AvlanDis.1981;25(4):831,838 3MullerHeta1.J.Virol1979;31:584,589 . 0一f f 中国家禽1998年第20卷第2期ChinaPoultry1998;20(2) 黼 :摹 : ……一l|n. :嚣: 器:10 摧鳘策霾 “,……c…自 0:::: 0::嚣0: ……一…t . 毒,毒,,毒,喜, 重 麴 嚣 ?孽套劫霉垒 甾群一’’” 摘要采用”玉米源,对我区饲料工 业,养殖业的发展有着重要的意义.因含有棉酚等有毒 物质,肉仔鸡饲料中使用量通常不超过1O%.本试验旨 在研究:.玉米一豆粕一棉粕”型日粮的初步配方及饲 收稿日期:1997_08—02 铭b妆 喂肉仔鸡的效果;通过测定艾维茵肉仔鸡的生长规律, 建立起数学模型,确定体重与周龄,日增重与周龄,饲 养成本与周龄的关系.为.玉米一豆粕一棉粕型.日粮 的广泛应用奠定基础. 1’’材料与方法 1.1试验时问和地点1997年3月12日,4月3O 日,试验期为7周,前期O,4周,后期4,7周.试验在 塔农大鸡场进行. ?十0十0’十十0’一十十0十十0十0十0十一十0十一十十0十0十0十0十0’0十十0’0 十十’0’’0’’’’r0’坩0’rw’r’ StudiesonthePathogenesisofInfectiousBursalDiseaseintheChicken ? IHistoimthologicalDevelopmentofLymphoidOrgans IDistributionofInfectiousBursalDiseaseVirusinthechicken GaoYiming(NantongAnimalandplantQuarantineBureau226006) ZhuKunxiandWuLili(AgriculturalCollegeofYangzhouUniversity225009) AbstractHistopathologicalexaminationofthebursaofFabricius,thymus,spleen,cecaltonsils,glandof Harder,liverandkidneyfrom28.day--oldchickensinfectedwithIBDVconfirmedthatlymphoidnecrosisinthe bursawasseenasearlyas48hourspostinoculationandlastedthelongestlime.Lymphoidnecrosisinspleen,thy— rous,cecaltonsilswere$eenlaterandweremuchlessseverethanthatinbursa.Gland. ofHarderappearednorma1. IBDVwasvisualizedbyfluorescentantibodiesinthebursaofFabricius,cecaltonsils.spleen,thymus.1iverand kidney.At12hourspostinoculation.theviruswasfirstdetectfdinthebursaandpersistedf0rthelongesttime(up to12dayspostinoculation).Secondarylongesttimewasincecaltonsils(upto8dayspostinoculati0n).Thevirus wasnotdetectedfromtheseorgansbeyond13dayspostin0culation. TheepithelialsurfacesequentialmorphologicchangesinthebursaofFabriciuswerestudiedbyscanningelec— tronmicroscopy.Theearliestdetectablechangesonthebursalepitheliumwereevidentat48hourspostinoculation. Theywerecharacterizedbytheepithelialcellsswellingandreductionordisappearenceinnumbersandsizeofmi— crovilliontheepithelialcells.At96hourspostin0culationlocalizedsurfaceerosionswereseenbecauseoflossofep— ithelialcells.Upto10dayspostinoculation,thebursalepitheliumwasbasicalrecovery. Keywordschicken;infectiousbursaldisease;histopath0logy;immunofluorescence;distributionofIBDV;scan~ ningelectronmicroscopy一 :?’ 一 】O一 蓠鬻避一 : 警羹..举,?,一