胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建立

胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建立 胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建 立 植物学通报2005,22(增刊):37~42 Chinese"BulletinofBotany 胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建立 张娅曾君祉周志勇陈毓荃黄华糅? (中国科学院遗传与发育生物学研究所北京100101)(西北农林科技大学生命科学 学院杨凌7121oo) 摘要为了建立高效的胡萝卜遗传转化体系,本实验选用3个胡萝 b(Daucuscarotavar.sativa)栽培品 种:'金笋五寸','Carol'和'改良黑田七寸',以它们的下胚轴和子叶为外植体,首先建立 了高频愈伤诱 导体系.在此基础上,以Carol的下胚轴和愈伤组织为受体,利用根癌农杆菌 LBA4404介导转化质 粒pBI121.经X.Gluc染色,证明GUS基因瞬间表达成功,经PCR鉴定,证明 GUS基因已整合到胡 萝卜的染色体中,从而建立了高效的胡萝卜遗传转化体系. 关键词胡萝卜,组织培养,遗传转化,GUS基因 CarrotTissueCultureandtheEstablishmentofanEffective GeneticTransformationSystem ZHANGYaZENGJun.ZhiZHOUZhi.YongCHENYu.QuanHUANGHua.Liang~ '(InstituteofGeneticsandDevelopmentalBiology,theChineseAcademyofSciences,Beijin g100101) (CollegeofLifeScience,NorthwestSci— TechUniversityofAgricultureandForestry,Yangling712100) AbstractInordertoestablishaneffectivegenetictransformationsystemofcarrot,wefirstly establishedaneffectivecallus— induciblesystemofcarrotbyusinghypocotylsandcotyledons asexplantsfrom3kindsofcarrot(Daucuscapotavar.sativa)breedinglines.Hypocotylsand calliofcarrotwereinfectedwithAgrobacteriumtumefaciensLBA4404harboringpBI121.By usingX— Glucstaining,weconfirmedthetransientexpressionoftheGUSgene.PCRanalysisof regeneratedplantsconfirmedthattheGUSgenehadbeenintroducedintotheplantgenome. Alloftheseresultsindicatedthattheeffectivegenetictransformationsystemhadbeen established. KeywordsCarrot,Tissueculture,Genetictransgenic,GUSgene 胡萝卜(Daucuscapotavar.sativa)作为 一 种最早的植物组织培养模式植物之一,其组 织培养和转化的研究已经取得了一定的成 果.目前,以胡萝卜块根,叶柄,子叶,下 胚轴等作为外植体,进行组织培养,悬浮培 养,原生质体培养,通过器官形成或体细胞 胚途径获得再生植株均有现成的方法可供 借鉴.胡萝卜的叶柄,子叶,下胚轴,根, 愈伤组织及悬浮细胞都能作为遗传转化受 体.Scott和Draper(1987)就指出胡萝卜的悬 ?通讯作者.Authorforcorrespondence.E-mail:hlhuang@genetics.ac.cn 收稿日期:2004—07—05接受日期:2004.12—30责任编辑:孙冬花,于昕 ?}}l}lll,,i?? 3822(增刊) 浮细胞是十分理想的研究外源基因表达的模 式系统.同年,刘稚等(1987)报道了农杆菌转 化胡萝卜悬浮培养细胞的研究结果,转化效率 约为10,.刘明志(1996)发现酚类化合物可 以促进农杆菌对胡萝卜悬浮细胞的转化,以乙 酰丁香酮的效果最显着;并且首次报道了GUS 基因在转化苗的各器官中的表达.赵秀英等 (2000)将乙肝病毒表面抗原基因通过电击法导 人胡萝卜悬浮细胞,并在转化的愈伤组织细胞 团中检测到GUS基因的表达:同时从转化的 愈伤组织中提取总蛋白,通过双夹心ELIsA检 测到HBsAg.王凌健等(2001)以胡萝卜无菌 苗的下胚轴和子叶为外植体,实现了肺结核杆 菌分泌蛋白MPT64的转化.上述工作虽然取 得了很多的成果,但是由于胡萝卜的总蛋白浓 度较低,这给转化苗的鉴定工作带来了很大困 难,尤其是水平的鉴定.所以用一种快 速有效的方法鉴定目的基因是否整合与表达 十分必要.本实验以胡萝卜栽培品种'金笋 五寸','Carol'和'改良黑田七寸'无菌苗的 下胚轴,子叶为外植体,建立了高频愈伤诱 导体系.用根癌农杆菌介导的遗传转化将 G因导人胡萝卜的下胚轴和愈伤组织细 胞,获得了转GUS基因的转化苗,并利用x. Gluc染色,实现了对转化苗的快速有效鉴定, 建立了高效的胡萝卜遗传转化体系. 1材料与方法 1.1植物材料 胡萝卜(Daucuscarotavarsativa1'金 笋五寸',购自北京市种子公司;'Carol'(法国 品种),'改良黑田七寸'(日本品种),由北京 市农林科学院蔬菜研究中心孙盛湘老师惠 赠. 1.2菌株与质粒 大肠杆菌(Escherichiacoli)Topl0,购自 美国InvitrogenCorporation;根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404为本实 验室自存.质粒pBI121为本实验室自存,带 有选择性标记基因?Pm和报告基因GUS. 1.3胡萝卜无菌苗的获得 胡萝卜种子经75%乙醇浸泡30秒,无菌水 冲洗2遍,再用0.1%升汞浸泡10分钟,无菌水 冲洗3,5次后,接种于不含任何激素的1/2 MS固体培养基(含1.5%蔗糖)上,于24cI=暗 培养条件下萌发7,10天后,将子叶和下胚 轴切成0.5cm的截段作为组织培养和遗传 转化的材料. 1.4胡萝卜的组织培养 1.4.1不同品种及外植体最佳培养基选择 试验将3个胡萝卜品种的子叶和下胚轴,分 别接种于含不同浓度激素的诱导培养基上,待 愈伤组织形成后转接于分化培养基上.分化芽 和根,长成植株.愈伤组织诱导采用MS(Mura. shigeandSkoog,1962)和B5(Gamborgeta1., 1968)2种基本培养基,分别补加1mg.L_.2,4.D +0mg?LKT(代号为MS和B5),1.5mg.L 2,4-D+0mg?L_.KT(MS1)和1mg?L一2,4-D +0.2mg?LKT(代号为MS+KT和B5+KT)3种 激素组合;继代和分化培养基采用不含激素的 MS培养基(MS0).上述培养基的蔗糖浓度除 MSl培养基为5%外,其余均为3%;pH值为5.8; 生根培养基为不含激素的MS培养基,蔗糖浓 度为1.5%(MS01). 1.4.2暗培养与冷处理后愈伤组织的诱导 按1.3节所述方法,分别将萌发的'Ca.rol'和'改 良黑田七寸'无菌苗放在24cI:暗培养箱中培养 l0天后,将外植体截段接种于B5培养基上,24 cI=,l2小时/天散射光下培养,诱导愈伤组织. 将未经暗培养和冷处理的材料作为对照,统计 出愈数,计算出愈率,比较暗和冷处理对诱导 愈伤组织的影响. 1.5胡萝卜的遗传转化 农杆菌菌液(OD6oo=0-3—0.5)20mL.1760 g离心10分钟,收集菌体后用5mL1/2MS液 体培养基重悬.将经过冷处理的下胚轴在上 2005张娅等:胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建立39 述菌液中侵染10分钟,接种在无抗生素的B5 固体培养基上,26?,黑暗条件下共培养两 天.再转接于附加50mg.L卡那霉素(Km) 和500mg.L羧苄霉素(cb)的B5培养基上,10 天后转接于附加50mg?LKm和300mg?L Cb的B5培养基上,每l0天转接1次,筛选抗 性愈伤组织.愈伤组织的转化方法同下胚轴 相同,共培养选用MS.培养基.将抗性愈伤 组织转接于附加100mg-LKm和300mg. LCb的MS0培养基上,每10天转接1次,待 愈伤组织分化出绿芽后,转接于合50,100mg. LKm和100mg.LCb的MS01培养基上,诱 导长根,形成苗后,转接于无抗生素的1/2 MS培养基上. 1.6转化苗的鉴定 分别取抗性植株和未转化植株的叶片各 0.2g,用CTAB法(MurrayandThompson, 1980)提取植物总DNA.以提取的DNA为模 板,PCR扩增外源DNA片段,上游引物为 CaMV35S启动子一段序列(35s),5'AGATT. AGCCTTTTCAATTTCAGAA3',下游引物为 GUS基因中部一段序列(midGUS), 5'TCTTCATGACGACCAAAGCC3'.PCR反 应条件为:95?,预变性10,15分钟;95?, 变性30秒,55?,退火30秒,72?,延伸30 秒,25个循环;72?,延伸5分钟.参照《植 物分子生物学实验指南)XMaligaeta1.,2000). 对转化4天后的愈伤组织和转基因植株的叶 片进行GUS基因组织化学鉴定,观察GUS基 因在转化苗中的表达情况. 2实验结果 2.1愈伤组织的诱导 2.1.1不同基因型及外植体对愈伤组织诱 导的影响表1结果表明,以3个胡萝卜品种 的子叶为外植体诱导愈伤组织,出愈率最高为 '金笋五寸',达50%;在培养基中同时添加2,4一D 和KT的效果比只添加2,4一D差;蔗糖浓度的增 加(见MS培养基)没有提高出愈率;从总体效 果看,B5培养基略优于MS培养基.表2结果表 明,3个胡萝卜品种中最高出愈率情况为接种 'Carol'的下胚轴在B5培养基上,达到9l%.其 他条件的最优选择结果与接种子叶的相同. 综上所述,3个胡萝卜品种以'Carol'的出 愈率为最高;外植体子叶与下胚轴比较,无论 是什么培养基,下胚轴的出愈率都要高于子 叶.所以在下面的实验中可以选择胡萝卜 'Carol'的下胚轴为受体材料,接种在B5培养 基上,这样出愈率可以达到最大. 2.1.2暗与冷处理对胡萝卜愈伤组织形成 的影响结果表明,暗处理对'Carol'和'改良 黑田五寸'的出愈率没有多大影响;但冷处理 后的下胚轴出愈率有明显提高. 至此,我们建立了胡萝卜的高频愈伤诱导 体系,即接种经低温处理10天的'Carol'品种的 下胚轴在B5培养基上,诱导愈伤组织.并希 望在此基础上获得高效的遗传转化体系. 2.2胡萝卜的转化 表13个胡萝卜品种子叶最佳培养基选择实验 4022(增刊) 表2不同胡萝卜品种下胚轴最佳培养基选择实验 分别以'Carol'经冷处理的下胚轴和愈伤 组织作为受体材料,利用根癌农杆菌LBA4404 介导转化质粒pBI121. 2.2.1下胚轴的转化卡那霉素抗性实验表 明,接种在附JJ[130mg.LKm的培养基上的 未经转化的下胚轴不能诱导形成愈伤组织. 而经转化的下胚轴接种于附~Jn5omg.LKm 的B5培养基上,9,10周后开始形成抗性愈伤 组织.转化的124块下胚轴中,有42块分化 出抗性愈伤组织,频率为33.9%.形成的抗性 愈伤组织可以继续分化出芽和根,长成抗性植 株. 2.2.2愈伤组织的转化卡那霉素抗性实验 表明,接种在附~Jn8omg.LKm的培养基上的 未经转化的愈伤组织可分化出白化苗,而且很 容易死亡,这与Km抑制叶绿素合成的机理是 一 致的.而接种在附加100mg.LKm的培 养基上则愈伤组织不能分化出芽.将经过农 杆菌侵染转化的愈伤组织接种于附~nlOOmg. LKm的培养基上,4周后开始分化出绿色的 抗性芽,并继续分化出根,长成抗性植株.得 到的32株抗性植株,经PCR鉴定,有17株可 以扩增出目的条带,转化效率为53.1%. 转化下胚轴与愈伤组织相比,转化下胚轴 得到抗性植株的周期比较长,需大约4个半月 的时间;而转化愈伤组织,从开始转化到得到 第一株抗性苗仅需要两个月,时间缩短了一半, 但转化苗的假阳性较高,在得到的32株卡那霉 素抗性苗中仅有17株可以扩增出特异性的目 的基因片段,这可能是由于转化的愈伤组织接 种在抗性培养基上时,不可能每部分转化材料 都接触到培养基,这样不利于Km对细胞壁的 渗透,而增加了假阳性的比率. 2.3转化苗的鉴定 2.3.1转化苗的PCR检测以35S和 midGUS为上,下游引物对G因进行PCR 检测,结果在1000bp左右扩增出特异的条带. 2.3.2GUS基因的组织化学鉴定由于 pBI121含有G嗽告基因,所以用LBA4404/ pBI121转化得到的转化体可以通过X—Glue的 表3暗与冷处理对胡萝卜愈伤组织生成的影响 Table3Effectsoflightandlowtemperaturetreatmentsoncallusinduction 苷.叫营『叫-培拜南姐世fe转化悼汞的4 包求旺叫5I'l"Jlf上 刊2rl转,七的愈伪?触啦蓝包而杠 缀转ft的愈川{尤刚菥包厦砬引3r 转化l竹的rl?1吖做染成巴时?H转化 的11?采破-耙乜I"jPB1I2I的6罐 J愈协僻到文选 3讨论 迎如故,E定呐}A物纰1培捧自I? 系统趾h物鞘I81fiti丽摧植物舯l0 , …,补植f水炎f19M培养嘻巾澈素十 失浓的同等占Ij,三彬u?l再愈伽纠n勺 j吣#戕们I血上士叭宴些?索的探讨执..}丁 I-的较对岬I商:}_lJ氲f瞬导f扛采最 的廿1愈车i-^土刮qI‰n【式躺姒ViJ不玎 锭晌菌轴】fill,…体,】,轴 ul愈}…_『十Jiif"讣rI本窭骑 阿1转化rf(,i'i'gPCY, M_】I2000Markel:I…甜州pBII2I.2转 化I'j.H转化 Fig.1P【R.l…l0llcIn【ranlc PIanI MDL2f)00.IPosi…ivcnlr…If{I12/2N…n …inmrmedpllml;3Irl】cJ『'I8? ' 图2?鹎化也恼h^1IBA440~,pBl12 转化廊伤钿tBffrij×"[tic乜 Fig.2X-aIldyingoiIhc?【1.iran~lbrnledcII IAd日dlhcLBA4404ipBI12IIrn…【?ledralllfR 图3转化{Af【IE化J(【j)I呻nxu… 邑 I%,听精j幢的益巴 Fig.3XtillJcdyin?rlhcn'm一?It11~rTl1d l…i1aclAJmd?1c{rlln~fblI}1"lIlin】T1clH) Aijl,ws1ndca_cc11pilsllionL1Ilh~bluendychlg i}i,【IMS,键水诱培养娃的山愈半叫!甑 丁B5J^捧堆…愈卒最高匈67''u『m州B'~Ji:f 鉴,n选州91‰同nf翰碴发观.峭处 理i,rl秀甘愈伽【…率没有?_幺彬响4,而fIC 黼处理…会提高诱愈协组蚋哺翠 血【l…n胡苗J,转化寓骑巾虽然许多 成J的俐『?屉转化被率即宵大的肇驯 ITakaichieu~l(2000)P^LBA44fI4『j株为转化 媒介叫21f州f'll(Kurothlg{isunInd INanlcsSeaNc[)世_I渣『专转化转化串什别 Ii一IIu当用农带曲佧(5I介导 转21,一I押M转化半丹刑为6c%和6I一‰ 半均转fE牢为^4%部{}实验llJI1坍己酰 丁嗣后转化技毕订所挺高{刹州志.1996;邙 网唧等2002)】一攘耻等(200I)对ivIJ帅无 菏I进行低汛处理子叶,:?F轴?{『[性愈坼j 嘲半凡攫商比未经让圳的列蹦商}f1 2,3fi"f矾岛的边77一未鲐处l?0rl_I椰下 轴抗性愈伤l再蛳社舒lJlJ却3_J_^"啊『37 9%)4'-试验i.将阍单},j发7的F 经过低处娌io兀接种丁1ing.L,4一 Di'r9H5培非卜_西导血伤斟I.利刖伙fT 介导转化愈圳f.q其最高的转化敬率一土 4222(增刊) 到53.1%,与以前的实验结果相比是较理想的 遗传转化体系.同时我们发现在转化胡萝卜 下胚轴细胞的过程中,无菌苗的萌发时间很重 要,一般选择萌发7一l0天后的无菌苗下胚轴, 此时的植物细胞处于活跃分化的状态,易于转 化.过于幼嫩的下胚轴,在受到农杆菌侵染 后,两端的切口部分会变褐,腐烂,细胞坏 死,这一点在花椰菜转化过程中也同样存在(徐 淑平等,2002).另外,在农杆菌介导转化胡萝 卜的愈伤组织过程中,我们也发现转化材料以 选择下胚轴接种在B5培养基上6周后形成的 愈伤组织,转化效率最高.此时的愈伤组织 胚性最强,易于转化和分化出苗,而愈伤组织 分化时间过长,会失去胚性,降低分化能力,降 低转化效率.这些都说明受体材料的生理状 态十分重要.同时经冷处理的下胚轴诱导形 成的愈伤组织,转化效率有增高的趋势,这一 点与王凌健的实验结果相同(王凌健等,2001), 最高的转化效率可以达到52%,是较理想的高 效遗传转化体系. GUS基因的活性在转化愈伤组织4天后 就可以通过X—Gluc染色确定,这对于鉴定目的 基因整合与表达快速而有效. 参考文献 刘明志(1996)酚类化合物促进含双元载体农杆菌对 胡萝卜悬浮细胞的转化和植株再生.植物,38: 203—208 刘稚,樊梦康,崔徽(1987)土壤根癌农杆菌体外转化 胡萝卜悬浮培养细胞.中国科学B辑,5:507—512 王凌健,倪迪安,陈永宁,李忠明(2001)利用转基因 胡萝卜表达肺结核疫苗.植物.43:l32一l37 徐淑平,卫志明,黄健秋,钟仲贤,徐悌惟(2002)根癌 农杆菌介导B.t.基因和C?T1基因对花椰菜的转化. 植物生理与分子生物,28:193—199 郑回勇,郑金贵,许明,刘峰,赵伊英(2002)胡萝卜再 生体系及高效遗传转化体系的建立.广西农业科学, 5:237—24l 赵秀英,张霆,张晓东,黄德庄,阎惠平(2000)HBV表 面抗原基因植物表达载体的构建及其对胡萝卜细胞 的转化.中国微生物学和免疫学杂志,20:401 MaligaP,KlessigDF,CahsmoreAR,GruissemW, VamerJE(刘进元,吴庆余等译)(2000)植物分子 生物学实验指南.科学出版社,北京,35 GamborgOL,MillerRA,ojimaK(1968)Nutrient requirementofsuspensioncultureofsoybeanroot cells.ExperimentalCellResearch.9:195—198 MurashigeT,SkoogFA(1962)Arevisedmediumfor rapidgrowthandbioassayswithtobaccotissue culture.PhysiologiaPlantarum,15:473—497 MurrayMG,ThompsonWF(1980)Rapidisolation ofhighmolecularweightplantDNA.NucleicAcids Research,8:4241—4245 ScottRJ,DraperJ(1987)Transformationofcarrot tissuesderivedfromproembryogenicsuspension cells:ausefulmodelsystemforgeneexpression studiesinplants.PlantMolecularBiology.8:265— 274 TakaichiM,OedaK(2ooo)Transgeniccarrotswith enhancedresistanceagainsttwomajorpathogens, ErysipheheracleiandAltemariadauci.Plant Science.153:135—144