杂色云芝液体发酵制备高活力漆酶研究

杂色云芝液体发酵制备高活力漆酶研究 南京林业大学 硕士学位论文 杂色云芝液体发酵制备高活力漆酶的研究 姓名:王平 申请学位级别:硕士 专业:生物化工 指导教师:赵林果 20090601 摘要 本论文以杂色云芝为菌种，研究了部分金属离子及诱导剂对云芝分泌漆酶量的影响; 并对发酵过程进行了分批补料和pH的调控;研究了云芝与丝状真菌共培养对漆酶分泌量 的影响，建立了适宜的云芝发酵产漆酶的条件，达到了提高漆酶产量，降低漆酶生产成本 的目的。研究结果如下: ll 1 添加cu2+适宜的浓度为300mol,L且在发酵接种2d后添加，漆酶活力达到 umol,L和20ll 2 添加香兰素和愈创木酚的适宜浓度分别为250 mol,L。自制两种 价廉、易得的小分子介质A和B作为诱导剂能有效促进漆酶的合成。其中， 小分子介质 A作为诱导剂时漆酶酶活达到3493U,L。 行pH调控和分批补料发酵均有利于云芝分泌漆酶。当以209,L为补料量， 连续补料三次， 最高酶活达到3366(7U,L，且胞外蛋白含量也得到显著提高;当补料总量 相同时，可以以 递增、恒定、递减三种补料顺序进行补料，其中，以递减方式补料效果最好。 4 云芝与丝状真菌液态共培养中，适宜的接种时间为云芝培养后第 3d，漆酶酶 活是空白样的2(2倍。 关键词:漆酶;产酶条件;发酵调控;杂色云芝;木霉;共培养 fermentationof laccasewith activity Liquid high ――’ ? ? ?? - 、二ortolMs verSlcolot Abstract ?S studiedCoriolusversicolorforthe ofsomemetalionsandinductorsas Paper effect wellco(cultureofCoriolusversicolorwith tothe oflaccase( as filamentous secretion lungi Alsoweestablishedfed―batchand and pH regulationtechniqueappropriate in conditionsforCoriolusversicolororderto lacease andreduce improve production resultsareas costs(The follows: production Cu+with concentrationof afterinoculation 1 Add appropriate 300l-tmol,L 2d，laccase of and andthecontentextracellularreached4558(4U,L wasmore activity protein 2(65mg,m1(It add to Mn2+afterinoculation3d( appropriate500“mol,L of concentrmionvanillmand were and 2501(tmol ,L 2 Theappropriate guaiacol andconvenientsmallmoleculemediumAandBas 20I-tmol,L(Twoself-made(cheap can inducers the oflaccase(Laccasereached effectivelypromotesynthesis activity 3493U,L thesmallmoleculemediumAasinducen using initialconcentrationofwheatbranandthe valuewere and5(0( 3 Theoptimum pH 209,L andfed(batchfermenmtionwereof forlaccasesecretion pHregulation greatadvantage by Coriolusversicolor(Theimumreached3366(7U,Landextracellular activity protein as contentwasalso increased wheatbrannutritionfeededforthree significantlyusing209,L times thefermentation(?， llenthefedamountwasconsent(therewerethree during approaches offed―batchas whichthebest offed-batchwasthe increasing，constant，decreasing，duringway mode( decreasing CO(cultureofCoriolusVersicolorandfilamentousin 4 For fungiliquid timeforinoculationwas4dofthecultureofCoriolusversicolo凡laccase appropriate activity ofthecontr01( was2(2times versicolor, conditions，fermentationcontrol，Coriolus ermentation Keywords:laccase，f Trichoderma sp(，CO―culture 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行的研究工作 所取得的成果。尽我所知，除文中已经特别注明引用的内容扣致谢的地方外， 本 论文不包含任何其他个人或集体已经发或撰写过的研究成果。对本文的研究做 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式注明并表示感谢(本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文例枞圳:王乎叩易月2如 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南京林业大学有关保留、使用学位论文的，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 中国科学技术 信息研究所;国家图书馆等 ，允许论文被查阅和借阅(本人授权南京林业大学 可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以汇编和综合 为学校的科技成果，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论 文全部或部分内容。 保密口，在――年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密d。 请在以上方框内打“~,” 学位论文作者 本人签名 : 指导教师 本人签名 : 霉塌兰。产匆月芩日 致谢 本论文是在导师赵林果副教授的悉心指导和热情关怀下完成的。在攻读硕士学位期 间，导师在学习上的细心指导、工作上的大力支持以及生活上的关心帮助都给了我无穷的 动力，使我在求学路上永不放弃。导师渊博的知识、严谨的治学态度、开阔的思维方式， 科研工作中勇于创新、孜孜以求的进取精神、对学术前沿的准确把握，以及生活中和蔼可 亲、宽心待人的长者风范，将永远激励我，使我终身受益。值此论文完成之际，向导师表 示我最诚挚的谢意，愿导师身体健康!工作顺利! 在实验过程中，得到了丁少军教授、叶汉玲高工等老师的悉心指导和鼎力帮助，在此 对他们表示深深的谢意。 同时，在论文实验中，得到了本研究室研究生周潭澈、孟鹏、唐莹、游丽金、夏文静、 李丽娟、宗雅冬、倪浩、李飞、贺立燕、刘夏睿及本科生郭慧琴、潘锐、赵雯、叶劲松、 邱欣欣等的大力协助和无私帮助，在此对他们表示衷心的感谢，愿他们学业有成!工作顺 利! 最后，感谢我的家人和朋友对我学习和生活上的关心和支持，特别感谢陈美玲在我攻 读硕士学位期间对我的鼓励、关心、支持和帮助。正是因为有他们无私的爱，才使得我在 遇到困难时能坚强面对，在遇到挫折时能勇往直前。谨以此文献给他们，祝愿他们永远幸 福、快乐、健康! 作者:王平 二零零九年六月 (i希吉 日? 青 1(课题研究的背景及意义 在我国过去几十年的经济高速发展中，由于环保意识的薄弱，大量的工业废水，特别 是印染、造纸等行业的工业废水未经处理直接排入江河湖海，造成了水体和土壤的严重污 染。这不仅给人们带来了一系列的疾病，使我们的健康状况受到严重威胁，而且给广大养 殖户造成了巨大的财产损失。 研究表明，白腐菌降解酶系中的漆酶，它具有底物专一性广等特点，能够催化D_和 p--联,苯酚、多酚、木质素、氨基苯酚、多胺、芳基二胺和特定的无机离子的氧化反应，而 且形成的自由基可以继续引发高聚物的解聚、重聚、脱甲基和苯醌类的生成等【lJ，它比过 氧化物酶具有更大的优势和应用潜力【2】。因此，漆酶在造纸木质素的脱除，含酚工业废水 和纺织染料废水的处理及其环境中多环芳香碳水化合物 PAHs 、杀虫剂、农药的降解等方 面具有重要的应用价值。 已有的研究成果表明，已有多株漆酶高产菌株被成功筛选到，并获得了较适宜的培养 方式和最佳生理培养条件。但是存在的问题:一是高产菌株培养产出的漆酶活力仍然很低， 满足不了工业化生产的要求;二是发酵制备漆酶过程中大量使用重金属离子 或芳香化合物 作为诱导剂，导致发酵液后处理难度加大，易造成环境污染。 本论文以杂色云芝为菌种，研究部分金属离子及诱导剂对云芝分泌漆酶量的影响;并 对发酵过程进行分批补料和pH的调控;研究云芝与丝状真菌共培养对漆酶分泌量的影响， 建立适宜的云芝发酵产漆酶的条件，以达到提高漆酶产量，降低漆酶生产成本的目的。 2(本论文研究的主要内容 自制小分子介质的添加量及添加时间对云芝合成漆酶的影响。 2 研究分批补料、pH调控对云芝分泌漆酶的影响。 3 研究不同种丝状真菌与云芝共培养发酵制备漆酶，重点研究不同种丝状真菌的 添加量和添加时间对漆酶合成的影响。 3(本论文的创新之处 加量的研究，本论文不仅研究了Cu2+和Mn2+添加量，而且还研究了适宜的添加时间对漆 酶合成的影响。同时，我们还初步探讨了自制的两种环保小分子介质对云芝分泌漆酶量的 影响。 2 分批发酵和pH调控技术已在其他菌株发酵上得到应用，但是利用这两种方式来 提高云芝分泌漆酶的量还未见报道，本文探讨了这两种方式的适宜条件，有效诱导了云芝 分泌漆酶。 3 通过云芝与丝状真菌的共培养的研究表明，利用双菌株共培养发酵可以提高了 漆酶的活力。 第1章文献综述 1(1漆酶的来源 漆酶在自然界中分布于多种植物、真菌、少数昆虫和细菌中‘31。按漆酶来源可分为漆 laccase 两大类。高等植物漆酶的研究报道较少， 树漆酶 rhuslaccase 和真菌漆酶 fungal 研究最为详尽的是日本漆树，日本漆树分泌的汁液中漆酶所占的比重可达0(1,一1,。分泌 的高产菌种如表1-1所示。 表1-1主要的高产漆酶微生物 【ienus MIcmt，r龋nlsm Lentinus L(edodes??,(tigrinus Polyporus P(sangu面us Pversit口lor，P(hir(*utus， PaneepsP(pinsitt8 Pycroporats P(cinnabarinus，P(sangutneu$，尼‘? z‘ineus P Polystictus versieolor，P(sanguineus hisporlt， Agaricltv,49aricus Ganoderma G(1uciolum，Gvalesiocim BottytLv Botrwisdnera Panus ligrintts Lat‘uts lrpex Daedalea (flavida Ft’mes aBnn g Rhi octnia prut??ricola Neurospora rrassa Len ites betulina Sportricum pulerulentum pho,iota mutabilis Schinus malle Sterum pupereum e Captious oongrt,gatus CcriporiopsisC(subvernispora Bjerl?aradera B(aduxta Dichornitus D(s耳ualenss ―。ricularia 户o? ‘啦 PhellimIs P(rthts Fyathus Ebulk，'t Acer A(pseudoplatanux Phlehla P(tremellosa P，(庙sciculariaP(floridensis A(niduInns Aspergillus Dit-homitus O(squalens Trichophyton Z,6rum Daldina D(concentrica Cerrena c(ima，c(unlcoior Rigidoporus Plignosus Panus Ptigrinus polystiaus Psanguineus A:ospirillum 一(1ipqferum GaeumannaxmycesG(gramimis Marasmius g(quercophilus 7 qf"，F，d 7 vilh，M，7:verstt??olor 2 1(2漆酶的结构及理化性质 1(2(1漆酶的化学组成 已有多种不同来源的漆酶得到分离纯化，漆酶一般以单体蛋白的形式存在，其分子量 被不同程度的糖基化，碳水化合物含量占10,-45, 质量分数 ，一般情况下真菌漆酶的碳 水化合物含量要低于植物漆酶的碳水化合物含量。不同来源漆酶的分子量、含糖量和含铜 离子数见表1(2【51。 表1-2漆酶分子量、含糖量和含铜离子数 除柄孢漆酶是四聚体外，其他漆酶蛋白质部分一般含有一段大约520(600个氨基酸单 Val， Leu， 研，他们 Met，Be， 都有N(末端 Cys， ryr， Gin，Phe，Lys，His，Arg， 封闭肽段。 不同来源漆酶的氨基酸序列相似性并不高，这一点可以从其N一末端序列中得到 cFasso和Plebia 证实。模型研究表明，Neurosporus radiata漆酶的氨基酸序列为可以折叠 成和抗坏血酸氧化酶类似的三域B(折叠的结构。然而二者的氨基酸初级结构相似程度并 不高，五种漆酶和两种抗坏血酸氧化酶之间仅表现了7,的同源性。曲霉属和粗糙脉孢霉 竟然和担子菌漆酶的氨基酸序列没有同源性，倒是黄瓜过氧化物酶与之有50,同源性。 由于更多的真菌漆酶序列已被测定，从中人们很容易得出白腐担子菌的序列间有较高的同 源性的结论，但这只能暗示这些真菌关系更密切，而不能说明这一结构对催化功能有显著 的影响。但是，很重要的一点是这些漆酶在和铜原子连接的半胱氨酸和10个组氨酸之中 或周围都有严格的保守氨基酸残基，任何情况下这些氨基酸都分布在含有两 对组氨酸残基 的N(末端区域，或是分布于C(末端的半肮氨酸和其余组氨酸残基之间。 1(2(2漆酶的结构特征及活性中心 漆酶结构的研究进展一直比较缓慢，直到1998年，ValericD等【7】结晶并解析了第一 A 分辨率条 个真菌漆酶:灰盖鬼伞 Corpprinuscinereus 漆酶 CcL 。分析了同一晶体2(2 域 1，2，3 组成，形成球状结构 70x 而在整体结构上更像抗坏血酸氧化酶。第三个结构域除了有B一转角外，还有四个短的螺 连接一个N(型N(己酰葡糖胺。铜原子连接在其中的两个区域内。I型铜原子位于第三结 构域中，?型铜原子位于一、三结构域的交界处，这和抗坏血酸氧化酶的结构一致。没有 观察到?型铜原子位点的电子密度。这暗示了漆酶在漫长的生物进化历程中的保守地位。 c 图卜l clnereus漆酶的结构 versicolor，其分辨率为l 似。通过已获得的不同真菌漆酶的结构与其它蓝色多铜氧化酶 如抗坏血酸氧化酶 的结构 比较，可以看出它们在催化中心的结构上是高度保守的。比较MaL和ceL氯基酸组成和 晶体结构，其氢基酸序列仅有26,的同源性，结构差异也较大，两者的N末端、C末端 及许多环状结构 尤其是参与底物结台的环状结构 均有显著差异。MaL的晶体结构显示出 三桉中心的新信息，暴露了该位点中三个铜离子之削的电密度，提示一个氧分子结台于新 的几何中心。在反应过程中，这个氧分子可能经通道进八三核位点，该通道在CcL结构 中是开放的。相反，MaL的C末端形成一个塞子堵住了这个通道。CeL中两 个氧原子在 两个T3Cu原子间呈不对称排列，而在MaL中则呈对称排列。 通过NMR、EPR、CD光谱等一系列研究，以及与抗坏血酸氧化酶、血浆铜蓝蛋白等 的比较分析，对漆酶的生物化学及结构特性有了较为深入的了解。漆酶至少有一个I型铜 nm处有吸收。 原子，和氨基酸残基结合成为单核中心，它使酶表现为明显的兰色且在600 另外它还包含一个II型铜原子两个?I型铜原子构成的三核中心;两个m型铜原子偶连于一 个羟基桥，形成了双核，这种结构引起了电子顺磁共振效应的消失 如图1(2所示 。 值得指出的是，含四个铜原子的酶分子是最常见的形式，而某些酶蛋白的辅基有例外 类似III型铜原子的功能。1997年有人从Pleurotusostreatus纯化了一种新型漆酶，该酶中 只合有一个铜原子，却含有二个锌原子和一个铁原子，因此在600nm处没有吸收，表现 为白色，而最普遍的含4铜原子的漆酶是蓝色蛋白。 HH ,， ，，His 、, 。Cu 铲 c,,慨 话3氐 ，(^ 胁,|夕 H瓤H (强 (蝤 ,h,u, 。 His――Cu , His His 图卜2漆酶结构图示 1(2(3漆酶的分子生物学 I基因以来，已经克 1998年，自从Frohman等【10】首次从糙皮侧耳中克隆到漆酶pox 隆、测序并分析了多个漆酶的DNA序列，有的已经初步实现了重组基因的异源表达【ll】。 Yaver 均有13个内含子，表达出的成熟蛋白氨基酸同源性80,。实现了lccl基因在米曲霉 DM等11 Aspergillusoryzae d尸的异源表达。Soden3j研究了漏斗状侧耳 Pleurotussajor-caju 的4种漆酶同工酶基因，比较了这4种同工酶基因在氨基酸编码水平上与其它担子菌漆酶 的同源性，指出Psclac4的相似性最高 85, ，Psclac3的相似性最低 52,(57, 。二甲氧 基苯甲酸和1(羟基苯并三唑可诱导真菌漆酶表达:碳源、氮源、铜、锰和两种芳香族化合 lac3 物 2，5(二甲代苯胺和阿魏酸 可在基因转录水平对单个漆酶同工酶基因进行诱导。Psc 基因为组成型表达基因。实现了Psc lac4基因在甲醇营养型酵母表达系统巴氏毕赤酵母 lac4的理化性质【14】。应用 Pichiapastoris 中的异源表达，纯化并分析了重组漆酶蛋白Psc AFR技术克隆了这4个同工酶基因的启动子区，分析可能存在的转录反应元件，指出这 些元件可能参与漏斗状侧耳漆酶基因表达的转录调控。 1(3漆酶的酶学性质 1 温度 多数真菌漆酶的最适反应温度较低，一般在25―50。C之间。现在也有较耐高温真菌漆 J掣16J从来 自南非的嗜热白腐真菌菌株中得到耐高温漆酶，其最适反应温度为70?，60?保温9h仍 具有完全活性;叶汉玲等【17】报道的新鲜香菇 Lentinulaedodes 子实体 漆酶的最适反应温度 为70?，杏鲍菇 Plerotus 保留72(7,的活性?51。 2 pH 多数真菌漆酶的最适反应pH在4(0―6(0之间。刘淑珍等【19】研究发现，,种担子菌漆 酚为底物时，最适反应pH分别为6(0和7(0。 3 等电点 G等【2l】从糙皮侧耳 多数真菌漆酶多为酸性蛋白质，等电点在3(0-6(0之间。Palmiefi KS等【22】从毛云芝 Coriolus 中分离的白色漆酶POXAl的等电点为6(7，接近中性。Shin 列上有差异。 4 金属离子对酶活的影响 多种金属离子，如K+，Ag+，Cu2十，M92+， Ba2+，Fe2+，Fe3+可影响漆酶的活性。研究发现，K+对多数漆酶有激活作用，而对糙皮 侧耳Ax3菌株所产漆酶的活性有较强抑制作用;ct?+对多数漆酶起激活作用，对多孔菌 lignosus 漆酶的活性无影响【241。 1(4漆酶的发酵方式 目前漆酶的生产方法主要是真菌发酵法，包括液体发酵和固体发酵。目前研究较多的 是深层振荡液体发酵。比起漆酶提取法 从漆树上提取 ，真菌发酵法主要有三个优点: 1 微生物资源丰富，生产不受自然环境的影响，可以用人工控制来大量生产漆酶: 2 产酶周期短，生产成本低; 3 真菌漆酶比漆树漆酶对底物的专一性类型和pH、温度作用范围更广，便于进行 工业生产，获取具有更好热稳定性和更高催化效率的高纯度制剂‘25112611271。 6 1(4(1液体发酵产漆酶 液体发酵产漆酶条件研究的主要内容有:营养因子、非营养因子的优化 及诱导剂的筛 选等。营养因子主要包括碳源、氮源、无机盐、微量元素和维生素等;非营养因子主要有 pH，温度等。 利用真菌产漆酶的液体发酵条件研究中，采用杂色云芝 Coriolus 对产酶具有很强的诱导作用。康从宝等【29】人筛选到一株高产漆酶的层孔菌w_l，研究发现 Lee等【30】研究发现，添加4,的 采用补料的方法，可以得到大量的漆酶粗酶液;In(Young 基初始pH3(0。 在液体发酵产漆酶的研究中，除了使用游离细胞培养外，采用固定化细胞培养合成漆 酶近年来也引起了广泛的重视。唐舜等【33】固定细胞培养了鲑贝革盖菌Coriolusconsor和 干酪菌Tyromycessp(等白腐菌，发现漆酶最高产量比游离细胞培养高出近5倍。 1(4(2固态发酵产漆酶 微生物在具有一定温度和湿度的固体表面进行生产和繁殖称作为固体发酵。固体培 养与液体培养相比，具有以下一些优点:操作简便，可以因陋就简;可以直接利用粮食加 工下脚料或纤维废料进行生产，原料成本低;固体发酵能耗低、发酵全过程无废水或很少; 固体发酵的产物浓度高、回收费用较低。但固体发酵也存在着问题，如设备占地面积大， 劳动强度大，传质传热困难，参数如pH值、温度、菌体增殖量、产物生成量等难检测。 研究者很早就发现丝状真菌非常适合于在固态条件下培养【341。付时雨等【35】研究了贝 壳状革耳菌在固体及液体培养过程中胞外漆酶及同工酶的产生规律及其差异。研究结果表 明，固体培养基产漆酶的最高峰在培养17d以后，固体和液体培养过程所产的漆酶同工酶 差异比较大，固体培养下产生的漆酶活性远大于液体培养产生的漆酶活性。胡平平等【36】 研究了固体培养条件下外加营养碳源葡萄糖及土豆汁，微量元素CU2+，Mn2+对贝壳状革 耳菌产木素降解酶的影响。结果表明，营养碳源和微量元素对贝壳状革耳菌漆酶的产生有 CM 等【3‘刀 显著的促进作用，外加碳源土豆汁要比外加葡萄糖所产生的促进作用大。Juan 使用木糖渣为主要原料，并以乙醇蒸气为诱导物固态发酵产漆酶，漆酶最大值出现在第 14天。 在液体发酵和固体发酵中，有时候也有多菌株混合共培养发酵。微生物的共培养是指 将有益菌加入培养基中，以促进另一种微生物菌株的生长或提高其代谢活性，该方法已在 多个领域中得以应用。 7 1(5影响漆酶合成的条件 1(5(1碳源和氮源对真菌漆酶合成的影响 不同菌种对碳源、氮源的种类和氮碳比的要求有较大差异。 canerea 碳源方面:果糖有利于担子菌CECT20197菌株漆酶的产生;在培养Botrytis 和复杂碳源对Panus (5和1(7倍【3引。 碳源比以葡萄糖为单一碳源时漆酶酶活提高1 氮源方面:Agaricussp( 蘑菇 在碳源如甘油、葡萄糖、果糖、甘露醇、阿拉伯糖、麦 芽糖、蔗糖、纤维素或纤维二糖充足的条件下，限制培养基中的氮源，漆酶的产量明显提 高;而周金燕等【39】比较了13株菌在富氮和限氮条件下漆酶的合成能力，结果显示限制氮 担子茵组成型漆酶的产生。培养基中碳源与氮源种类的不同组合也能影响真 菌漆酶的合 成，一般认为Phanerochaete retool,L 的特定培养基中合成胞外漆酶，并且，在低氮或高氮 素 109,L 和酒石酸铵 2(4(24 的纤维素培养基中都有漆酶活性，而在葡萄糖培养基中无论是高氮还是低氮均无漆酶活 性。 1(5(2金属离子对真菌漆酶合成的影晌 活性低，增加Cu2+浓度后产酶活性增加，但是过多的Cu2+又对漆酶产生有抑制作用„J。 Mnz+对漆酶合成的影响:Agaricus 浓度，漆酶的合成受到抑制，而其他木质素降解酶的合成量却得到提高。 1(5(3某些化合物对真菌漆酶合成的诱导 某些芳香化合物如香草酸、香豆酸、单宁酸、阿魏酸【43】等都能有效地提高酶活。一 究表明乙醇也可以作为Trametes产漆酶的有效激发剂。 1(5(4其它因素 培养温度和pH值对漆酶产生的影响因菌种而异，不同的菌种有不同的适宜培养温度 radiata 辐形射脉菌 漆酶的产生，纯氧的抑制作用更加显著;增加环境湿度可促进 versicolor 杂色多孔菌 漆酶合成。 Polyporus 表I-3白腐菌分泌漆酶的适宜温度和pH值 1(6漆酶催化氧化反应机理及其介质系统 1(6(1催化氧化反应机理 漆酶是单电子氧化还原酶，它催化不同类型底物氧化反应机理主要表现在底物自由基 的生成和漆酶分子中四个铜离子的协同作用。底物结合于酶活性中心的I型铜离子位点， 通过Cys(His途径将其传递给三核位点，该位点进一步把电子传递给结合到活性中心的第 二底物氧分子，使之还原成水。整个反应过程需要连续的单电子氧化作用来满足漆酶的充 分还原，还原态的酶分子再通过四电子转移传递给分子氧。在此过程中，氧化还原很可能 分两步进行，两个电子转移产生过氧化氢中间体，该中间体在另外两单电子作用下被还原 成水。例如:当漆酶催化氢醌氧化时，首先是底物氢醌向漆酶转移一对电子，生成半醌( 氧自由基中间体。其次是不均等非酶反应，二分子半醌生成一分子对苯醌和一分子氢醌 M。漆酶催化底物氧化和对02的还原是通过四个铜离子协同地传递电子和价态变化实现 地，其过程如下: „ 。一“9 【 11 11l 氧化态 C还原念 氧化态 1(6(2漆酶的介质系统 漆酶介质系统 LMS 是指漆酶在介体和氧的存在下进行生物催化的过程。介体在酶的 作用下会形成活性高且有一定稳定性的中间体，这些活性中间体能从氧分子中获得电子传 递给底物，从而使底物降解。下面以漆酶介质系统处理染料为例介绍漆酶介质系统生物催 化的机理 如图1(3所示 。 9 图1-3非酶底物染料的降解机理 漆酶底物即介质 M 被漆酶氧化形成阳离子自由基 M+ ，自由基不稳定自动分解为 的非酶底物染料也是不稳定的，会分解成最终产物 PD ，被漆酶吸收的电子最终传递给 氧气形成水145]。这说明小分子介质对非酶底物染料的降解起到介导作用。漆酶介质系统 对木素以及其他酚、醌胺等各种有机物的氧化降解机理也类似。已有的研究表明，有效的 介质是一些带有N-OH或N O基团的N一杂环物。 1(6(2(12，2’一连氮一双一 3一乙基苯并噻咯咯琳-6-磺酸 简称ABTS ABTS作为介质时，介质系统的反应明显分为两个阶段，根据反应动力学曲线，氧化 剂是ABTS的二价阳离子 ABTS 去一个电子形成一价阳离子，接着再失去一个电子以后才成为二价阳离子，其变化过程如 146‘。 图1-4所示。氧化态的ABTS在氧化底物时反过来又被还原成为ABTS 1(6(2(2卜羟基苯并三唑 简称HBT 漆酶,HBT介质系统催化氧化底物过程中，HBT被氧化成为氧化态HBT，再作为氧化剂 氧化底物。此系统不能明显地分为两个阶段，其耗氧量动力曲线在整个过程中都表现出零 级反应规律，因此氧化态HBT的形成是反应速率的决定步骤。与ABTS不同的是:当HBT, 底物比值低时，氧化态HBT是作为单电子氧化剂而且能够被可逆还原为HBT。但是HBT, 底物比值高时，氧化态HBT是作为三电子氧化剂而且最后不可逆地还原为苯并三唑 BT 【4刀。 1(6(2(3N一羟基，N-乙酰苯胺 NHA NHA也是一种常用的介质，漆酶与NHA协同作用时，漆酶氧化NHA产生N一0??自由基， 自由基进攻底物后可返回到NHA。理论上，活性物质不消耗，能在漆酶与底物之间发挥转 移电子的作用，但微分脉冲法扫描的结果证实实际上有部分NHA的自由基会衰退，变成其 】0 他物质，而不完全可逆【4引。 以上几种常见介质的作用机理，均是介质先于底物迅速与漆酶反应，产生自由基后再 与底物发生氧化作用同时自身被还原。因此，能产生自由基的典型漆酶底物也可考虑作为 介质化合物。 sol e t soi 一 舻洲一一 邗一一 ,,， cH2cH3 cH2cH’托j|吒 SOf 图1-4ABTS转移一个或两个电子形成一价阳离子或二价阳离子的示 意图 1(7漆酶的应用 1(7(1在造纸工业中的应用 漆酶催化木质素降解的特性，可用于造纸工业中纸浆的生产。木质素在木材中的含量 约为15,(32,，仅次于纤维素和半纤维素。制浆时需要去除木质素以降 低纤维间的结合 力使之解离成浆状;木质素的存在影响了纸浆的颜色，因此纸浆漂白也需要去除木质素 【49】。造纸工业中传统的制浆是用烧碱或硫酸盐高温煮蒸原料，除去木材中的木质素，这 一工艺不仅会使部分纤维素和半纤维素降解，影响纸浆得率，还严重污染环境。 与传统方法相比，漆酶可选择性地降解木质素而不影响纤维素和半纤维 素，提高了纸 浆得率，且漆酶制浆的过程在常温常压下进行，节约了设备和能耗。在降解纸浆中木质素 的真菌酶系中，漆酶、木素过氧化物酶和锰过氧化物酶是起主要作用的三种酶。从脱木素 效果来看，虽然木素过氧化物酶稍好一些，但是漆酶有其自身的优点:漆酶更稳定，固定 化后能更有效的发挥作用[50,51】;不需要过氧化氢的参与;有些漆酶可以组成型产生，且表 达量较高;可以更有效的脱氯。因此，漆酶在脱木素方面得到了广泛的应用。 漆酶在造纸工业中的应用研究除了在制浆时脱木素方面外，还在漂白、废水处理的方 面得到较大限度的应用。传统的氯气漂白纸浆的工艺，因产生有毒的氯酚类化合物而带来 严重的环境污染，所以成为逐渐被淘汰的工艺。近年来出现的氧、臭氧和过氧化氢漂白工 艺，虽然比起传统氯漂工艺减少了给环境带来的污染，但得到的纸浆的粘度，抗张强度等 指标不太令人满意，且成本也比较高。因此很多学者把目光投向纸浆的生物漂白上，因为 利用酶法对纸浆进行漂白，不会产生有毒物质给环境带来污染，并且不会损伤纸浆中的纤 维素和半纤维素组分，可提高纸浆质量【521。并且经漆酶处理的纸浆制得的纸张具有良好 的抗张强度和平滑度[531。试验证明，漆酶和合适的介体协同作用，对低卡伯值的木浆有 高选择性，去除木素效率达到45,;同样对于高卡伯值的的木浆也有类似的效果，进一 步提高了纸浆的质量。 国内也已开展了这方面的研究，林鹿等【54】对按木浆的生物漂白试验表明，漆酶和木 聚糖酶组合处理对浆的卡伯值降低最高，白度最高，而对粘度影响较少，对后续化学漂白 工序产生有利的影响。连海兰等【55】研究了漆酶,碳源系统 LCS 预处理对稻草碎料板性能的 影响，结果表明，LCS完全可以代替昂贵的LMS来降解稻草中木质素，与粗碎料板相比， 酶处理对细碎料板的各项力学性能均有显著改善。 1(7(2生物修复 生物修复是目前认为的较为可取且很有应用前景的技术之一，它是利用生物的方法修 复被污染的局部环境，使之重现生机的过程，具有就地处理，操作简单，处理效果好且污 染物转化后无二次污染等众多优点【56】。真菌漆酶可降解环境中多种有毒物质，对污染的 局部环境进行生物修复。 C等【57】对分离自壬基酚污染的河水中的有丝分裂真菌UHH1-6(18-4和水 Junghanns 生丝状真菌 aqua疗chyphomycete Clavariopsisaquat纪a降解壬基酚作用进行了试验。对降 解代谢产物的分析表明，细胞内1,2t-NP异构体的壬基被羟基化，壬基支链的缩短及4( 羟基苯甲酸被确定为UHH1-6(18(4中t-NP的断裂产物。UHH1-6(18(4中t-NP的降解效 率高于C(aquatica,UI-tH CuS04和香草酸混合物可大大增加漆酶的产生。漆酶催化转化t-NP导致产物具有比母体 化合物更高的的分子量。这些结果强调了真菌的一个功能，水生生态系统中通过内分泌作 用降解水污染物，这在以前并没有研究过。更重要的是，结果支持分离自水生环境真菌的 两种降解t-NP机制:在单体t-NP异构体壬基支链上的轻基化及在部分异构体烷基链上的 进一步断裂;胞外漆酶对t-NP的攻击，漆酶使初级产物发生氧化偶合形成高分子的复合 物。 Sonoki T掣58】将云芝漆酶引入烟草植物中得到转基因植物FL4，其根部可分泌漆酶， 以达到去除土壤中有机污染物的目的。结果显示FL4对土壤有机污染物双酚A或五氯苯 酚的去除效率明显高于对照组。 12 1(7(3环境保护 工业“三废’’、化学农药分解时往往产生毒物酚或芳胺。早在20世纪80年代，研究 者就发现一些白腐菌可以降解多种芳香族类化合物和有机磷类毒剂。近年来随着对白腐菌 中木质素降解酶 木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶 研究的深入，人们对真菌降解 异生化合物的过程有了更深入的认识。这一酶系可以降解转化多环芳香化合物、氯代酚、 多氯联苯、二氧六环、二氯苯胺、杀虫剂、染料等多种难以降解的有机化合 物【591。从此， 木质素降解酶系中的漆酶在环境保护中有了用武之地。 在印染和造纸等工业过程中，有大量含有染料的废水释放，成为当今主要的环境问题 之一。合成染料广泛地用于印染工业，目前已超过10000种。合成染料被人们成防水、 抗光照、抗氧化的生物难降解化合物，以通常的活性污泥方法处理纺织废水很难达到预期 目的，同时存在着花费高和污泥再处理的问题。而筛选的染料降解细菌，对降解的染料结 构有高度的专一性，不适用于化学结构多样性的纺织废水处理。白腐菌漆酶是一种多酚氧 化酶，具有广泛的底物专一性，可以氧化芳香环化合物。实验证明漆酶对多种纺织染料的 培养液的粗抽提液分析表明，只有漆酶活力和染料的脱色效果呈现正相关，说明漆酶在其 中起重要作用。漆酶作用偶氮类染料的可能机制在于酶分子攻击与偶氮原子连接的芳香 碳，使其形成自由基，然后在水分子攻击下产生二氮苯，二氮苯通过单电子传递作用进一 A等 【63l研究的 对纺织活性染料的降解效果很好，短时间的光化学预处理效果更好。ZiUy 巴西风尾菇菌株 Pleurotus 作用，可完全或部分脱去氨基黑、刚果红、锥虫蓝、甲基绿、考马斯亮蓝R、甲基紫、乙 R(478无脱色作用。imo 基紫、亮酚蓝等染料，但对亚甲基蓝和Poly C等【64】比较了 地霉属 Geotrichum Geotrichum sp(可迅速转化黑色染料并具有持续转化大量染料的能力，漆酶参与了这一转 VL和Forchiassin 化过程。Papinutti F[65J研究了层孔菌 Fomes MG 的脱色作用，结果显示E 用含有高活性漆酶的上清液处理MG产生脱色产物DMG，DMG对黄孢原毛平革菌 菌的脱色能力，鉴定了一种新的真菌:Coriolusversicolor R(478、考马斯亮蓝R、MG和靛蓝胭脂红脱色28,，30,， 时内可分别使二甲代苯胺、Poly 素过氧化物酶和锰过氧化物酶。TauberMM掣67】研究了漆酶与超声波对含氮染料的降解 作用，漆酶脱色效率高但不能作用于所有所试活性染料，且高阴离子强度会导致酶失活， 超声波处理高能量输入3小时可使所试染料脱色，延长时间可形成无毒的离子。并首次指 出漆酶和超声波处理具有协同效应，共同作用可提高降解效率。 氯酚类有机化合物是重要的工业原料，用于生产染料、防腐剂、除草剂、杀虫剂等化 工产品，由于其氯原子的P电子和苯环上的万电子可形成稳定的共扼体系，所以氯酚的抗 生物降解能力很强，对环境的污染极其严重。此外，许多工业废水含有氯化芳香化合物， 如造纸工业的氯漂废水。由于这类物质具有一定的毒性，因此，严重危害着人体健康和人 类赖以生存的环境。漆酶是一种次级代谢酶，底物专一性小是很强，具有氧化酚类物质的 能力，包括氯酚及其衍生物。首先，漆酶催化氯酚类物质氧化产生苯氧基自由基，苯氧基 自由基可与自身或苯酚形成二聚体，同时将氯离子释放出来。二聚体也可以形成自由基， 以类似的途径形成三聚体或多聚体。这些低溶性的低聚物和高聚物可通过沉淀或过滤去 等【70】用糙皮侧耳漆酶进行了有机磷农药的生物降解试验，结果表明，真菌漆酶可分解三 (S(州，N(二异丙胺乙基 甲基磷酰硫醇?X 和O(异丁基(S。州，N(二乙基胺乙基 甲基磷酰硫 G等[71】研究了糙 醇 RVX ，并认为这是彻底氧化降解此类神经毒素的有效方法。Aggelis oilmill 皮侧耳生物反应器去除橄榄工厂废水 olive 过程，结果表明，漆酶可去除其中的酚类化合物，降低OMW毒性，解除其对环境中微 生物的抑制作用。David 该酶可完全去除咔唑和N(乙基咔唑，转化芴和二苯并噻吩化合物。E(Rodri gue等173】研究 ABTS或HBT存在时，漆酶的氧化作用显著提高。HiraiH掣74峻现云芝漆酶(HBT可有 效催化化学杀虫剂甲氧滴滴涕 MC 氧化脱氯，产生无毒产物。 1(7(4在生物传感器和检测中的应用 近年来，随生物技术的日臻完善、微电子学技术的迅速发展以及实际应用领域的迫切 要求，漆酶作为生物传感器作为一种强有力的分析工具，它己成功地应用于医学、国防、 环境、食品工业及农业等领域。漆酶在催化过程中消耗氧气，使得这一过程很容易地被转 化为电信号而高灵敏地得到检测。因此，漆酶被广泛应用于生物传感器和免疫检测。 感器，来检测茶叶加工过程中儿茶酚的变化情况，每个酶元件可以作多次检测，并且室温 下保存2个月。OldairD(Leite等r76J研究发现，在生物传感器检测儿茶酚胺中使用糙皮侧 耳漆酶(过氧化物酶组成的双酶系统可有效增加传感器信号。这种类型的传感器可以用于 检测来自煤炭、石油、天然气、造纸等工业污水中的木素、酚类物质等。医学中已利用固 定化漆酶制成的电位免疫传感器进行胰岛素分析。 双酶系统传感器是漆酶在传感器研制中的新发展。该系统用漆酶和依赖于P的葡 萄糖脱氢酶共固定在塑料片上，与氧电极偶联，大大提高了检测的灵敏度。它测定二茂铁 的浓度极限为O(2umol,L;而测定肾上腺素等神经介质的极限达皮摩尔级。生物电极是以 固定化生物体作为分子识别元件的敏感材料，与氧电极、膜电极和燃料电极等构成生物传 感器，将被测物的浓度与可测量的电信号关联起米。在发酵工业、环境监测、食品监测、 临床医学等方面得到广泛的应用。将漆酶吸附在碳上制成固定化酶电极，能有效催化负极 10-5(7(0X104 氧化还原，可精确测定浓度在2(0X mol,L范围的多酚、多胺墓苯等底物。 酶法免疫分析 EIA 是利用标记酶与各种性质配体 如杭原，抗体，蛋白质A等 的相互结 14 合，用漆酶作标记酶，其抗原(漆酶的接合灵敏度有很大提高，同时对培养基中变价金属 离子的含量具有更高的敏感性。 OsinaM A等【77J用云芝漆酶分别与邻苯二酚、多巴胺和2(氨基-4(氯 苯酚形成的复合物 作为生物传感器电极测定溶液中低浓度酚类物质的含量，其中与2(氨基(4(氯苯酚形成的 粒子表面的纳米复合粒子，并用此纳米复合粒子通过戊二醛交联法固定了漆酶，固定后的 酶比游离酶具有更好的贮存稳定性及操作稳定性。姜德生等【79】以戊二醛为交联剂制备了 磁性壳聚糖微球作为载体固定漆酶。固定化漆酶最适温度比游离酶降低50?，在60。C条 件下保温210min，固定化酶保留酶活力74,，而在相同条件下游离酶酶活力仅保留19(4,。 固定化酶连续进行10次操作后，酶活力仍保持80,以上，漆酶使用效率明显提高，且该 固定漆酶具有良好的存储稳定性。 1(7(5在食品工业中的应用 漆酶在食品工业中的研究和应用正日渐广泛和深入。国内外大量研究报告对漆酶在饮 料加工、食药用菌生产、食品分子交联、植物食品保护等方面都有涉及。 酒、果汁等饮料在储存期间往往出现浑浊或沉淀，这与其中含有酚或芳胺类物质有关。如 果用漆酶预先处理麦芽汁，使其中的酚氧化后除去，则可提高啤酒的质量和透明度，且有 利于长期储存并保持澄清。漆酶酶法稳定果汁具有显著优点:果汁及浓缩果汁澄清、色浅、 稳定;不需要澄清剂及助滤剂;不需要PvPP 聚乙烯吡咯烷酮 、活性炭及吸附剂处理; 污染少，方便简单，易自动化。 漆酶还可用于食、药用菌的生产。在食、药用菌制种过程中加入漆酶制 剂能加速木质 素的分解，并作为末端氧化酶参与呼吸过程中的电子传递，为菌丝生长提供养料和能量， 促使菌丝内的物质合成、运转和积累，加快菌丝吃料，缩短培养时间;接种时加入酶制剂， 还能够促使菌丝扭结，形成更多的子实体原基，提高菇类产量。漆酶制剂能将酚氧化为醌， 作为抵抗杂菌的毒素，抑制杂菌污染，可提高成功率f811，漆酶还参与子实体形成的调控 作用。Helio H(Suguimoto掣82】的研究表明，在原生质和担子果形成过程中产生大量漆酶， 在菌丝体生长及真菌分化阶段3，4(二甲氧苄基乙醇可刺激糙皮侧耳漆酶产生并参与子实 体的发育，在担子果成熟时漆酶活性显著下降，证明漆酶在子实体形成过程中具有一定的 生理学功能。因此在食用菌生产中添加漆酶可加速菌丝体的生长和分化，促进子实体的形 成。此外，可利用漆酶和木质素作为培养菇类的材料，使菇类的液体培养成为可能。利用 漆酶活性高的白腐菌株处理秸秆等可制取有优越生理功能的功能性食品添加剂如膳食纤 维，现已取得具实用价值的结剁s3]。 另外，多项研究报告证实漆酶能使食品分子间形成交联。例如:漆酶通过将邻近链的 阿微酸酯联结成缩水二聚物而使阿拉伯木聚搪溶液凝胶化，与其他过氧化酶比，漆酶能够 Roland等[84J在用纤维二糖脱氢酶催化生产乳糖酸时，加入 形成硬度更高的凝胶。Ludwig 漆酶可使反应中的电子受体持续再生，在漆酶再生系统中还包括苯醒、ABTS、高铁氰化 物或二茂铁等氧化还原介质。Kuuva T(等【85】用漆酶诱导甜菜胶的凝胶化，且酶活性越高果 15 胶分子间的交联度越大，形成的凝胶硬度越大。 漆酶在食品工业中的各类应用取得了多项专利，包括用漆酶去除食品变味以及添加到 酱油中增加其风味、以一种包含漆酶的化合物用作食品防腐剂、向油或含油产品 如色拉 调味品 中加入有效量的漆酶使之脱氧等等。利用漆酶活性高的白腐菌株处 理农工废弃物 如秸秆等，通过漆酶对木质素的特异降解，制取有优越生理功能的功能性食品添加剂一膳 6‘。 食纤维，现已取得具实用价值的结果18 16 第2章部分金属离子及诱导剂对云芝产漆酶的影响 云芝漆酶是一种诱导型漆酶，其合成易受环境条件如营养因子、金属离子、诱导物等 影响。其中，ct?+作为漆酶蛋白的结构重要组分，它能有效提高多种真菌漆酶同工酶产量; Mn2+对酶起着活化剂的作用，对菌株产生漆酶也有明显影响，而部分小分子介质也能促 进云芝分泌漆酶。本章主要研究cd+、Mn2+以及诱导剂的浓度和添加时间对云芝产漆酶 的影响，以获得较适宜的诱导剂种类，掌握其用量及添加时间，达到提高漆酶产量的目的。 2(1材料与方法 2(1(1材料 (1(1(1供试菌种 2 杂色云芝茵Coriolusversicolor CV菌种 ，南京林业大学微生物技术研究室保藏。 2(1(1(2基本培养基 PDA平板培养基 g,L :马铃薯20，蔗糖2，琼脂2。 200mmol,L 0ml ,L，Kirk OOmFL，lmmoFL愈创木酚溶液1 pH5(0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液l Salts溶液lOOml,L，Tween802滴,瓶，诱导剂 2(1(1(3主要仪器 电子天平 BSl24S :北京Sartorius仪器系统有限公司 basic 磁力搅拌器 RH KI,C :德国IKA公司 AUTO 自动蒸汽灭菌锅 D(1 CLAVE型 :北京发恩科贸有限公司 生化培养箱 SHP-250型 :上海精宏实验设备有限公司 水浴摇床 ZHWY-lOX :上海智城分析仪器制造有限公司 新型恒温振荡器 ZHWY-2102C :上海智城分析仪器制造有限公司 电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9203A型 :上海精宏实验设备有限公司 pH计 pHS-25数字型 :上海雷磁仪器厂 匀浆杯:美国制造 冰箱 BCD--277 :SIEMENS公司 U-1800紫外一可见分光光度计:日本日立公司 7230G可见分光光度计:上海精密科学仪器有限公司 2(1(1(4主要试剂 硫酸铜，硫酸锰，无水乙醇，异丙醇，葡萄糖，酒石酸铵，柠檬酸，柠檬酸钠，氯化 钠，硫酸钙购于南京化学试剂有限公司，愈创木酚购于国药集团化学试剂有限公司 上海 ， Tween80购于南京赛吉科技有限公司，ABTS购于Sigma公司，自制小分子介质 2(1(2制备及检测方法 2(1(2(1菌种活化 4C，培养至菌丝体长 将保藏的菌种接入到新鲜平板中，放入生化培养箱中，恒温28 满平板表面。 2(1(2(2试剂的配制 Kirk XThiamin trace Salts溶液。 sol VBl ，Kirkelements 6X 溶液配制成pH 4(5的Kirk Kirktrace elements 6 traceelements 6× 溶液。 CaCl:??2H。0等溶液配制成pH 4(5的Kirk 玻璃棒引流于1L的容量瓶中，定容，摇匀。 璃棒引流于1L的容量瓶中，定容，摇匀。 璃棒引流于25ml的容量瓶中，定容，摇匀。 氮一二 3-乙基一苯并噻唑一6一磺酸 ]溶液:称取0(0559 色试剂瓶中放入冰箱冷藏室低温保存。 0(2mol,L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液: A液:0(2 加蒸馏水溶解后，定容至1L。 HzO，分子量 B液:0(2mol,L柠檬酸钠溶液，称取柠檬酸钠58(82g Na。C。H。0，??2 294(129,m01 ，加蒸馏水溶解后，定容至1L。 将A液和B液按下表的比例配制所需的pH值。 塑笪 垒这 翌!! 星邃垫12 巳旦笪 垒邃 翌12 里邃 坐!1 3(O 82(O 18(O 5(O 35(0 65(O 3(5 70(8 29(2 5(5 23(3 76(7 4(0 59(O 41(0 6(O 11(5 88(5 4(5 47(3 52(7 2(1(2(3产酶条件 r,min，以菌悬 云芝产漆酶的初始pH值为5(0，培养温度为28。C，振荡速度为160 液为菌种，接种量10, ml,m1 。发酵液于4"C，8000r,min条件下离心5min，取上清 液供分析检测。 2(1(2(4不同诱导剂制备漆酶的方法 不同诱导剂的用量对云芝产漆酶的影响:在培养初期分别添加不同浓度的Cu2+、 IVln2+、自制小分子介质、香兰素、愈创木酚，接种培养5d左右后开始取样测漆酶酶活。 同一诱导剂浓度不同添加时间对云芝产漆酶的影响:选取适宜的诱导剂 浓度，研 究在不同的时间添加到发酵培养基中，接种培养5d左右后开始取样测漆酶酶活和胞外 蛋白含量。 2(1(2(5漆酶酶活测定方法 处的吸光值。定义每分钟氧化IpmolABTS所需酶量为一个酶活单位 U ; 计算漆酶酶活的公式如下: 漆酶活力 u,三 参笔蒜 公式中: AOD:吸光度的增量 ?t:反应时间的变化量 V1:反应总体积 m1 V2:测定酶活时所取的酶液体积 m1 ,:消光系数 ,420 36000M-1era"1 N:酶液稀释倍数 2(1(2(6蛋白含量的测定方法 采用改良的Bradford法测定【871。 1 基本原理 nm， 蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合，使得染料最大吸收峰从465nm 变为595 nm 在一定的线性范围内，反应液595nIIl处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595 处吸光度的增加即可进行蛋白定量。 2 试剂 ml95, -250原液称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于 a 试剂A:考马斯亮蓝G 50 的乙醇，加入100ml85, w,v 磷酸。 19 水按15:85比例混匀，过滤。4?，棕色瓶保存。 c 0(1mol,L盐酸 新鲜配制 和双蒸水。 BSA品溶于lml水， 室温稳定 d lmg,ml牛血清白蛋白 BSA 标准液:将lmg 2h，12，000 g离心lOmin，-20?保存6’8月，-80?保存1年。 e 待测样品 12，000g离心lOmin 。 3 操作步骤 A(准备: a 将样品稀释至标准曲线的线性范围内。 b 考马斯亮蓝G-250测定工作液取出恢复室温。 C 实验所需的刻度试管、移液管事先要重新洗净、烘干、冷却，避免试管、移液管 中残留的微量蛋白杂质的干扰。 B(标准曲线的测定 将9支干燥洁净的试管编号，按下表加入试剂并摇匀。室温放置半分钟后各管加入 3(5m1考马斯亮蓝G-250测定工作液，摇匀，室温放置10min后，以0号管为空白调 零测定其余各管595nm处相对吸光度。 C(样品的测定 在一干燥洁净试管内，先加入800此蒸馏水，再加入适当稀释后的样品100此、 HCl 0(1mol,L ml考马斯 100止，摇匀，室温放置半分钟，然后在各管中分别加入3(5 亮蓝G-250测定工作液，摇匀，室温放置10min后，测定其在595nm处相对吸光度 以 mol,L HCl为空白调零 。每个样品测两个平行样，取其平 900止蒸馏水+100此0(1 均值。 D(数据处理 以吸光度为横坐标X，蛋白量浓度 ?g,此 为纵坐标Y，绘制标准曲线，回归出工作 方程y f X ，利用工作方程计算待测样品的蛋白量 肛g,此 y值。 E(样品蛋白含量计算 原样品的蛋白含量 mg,m1 稀释倍数:Ic根据标准曲线计算出的Y值。 20 2(2结果与讨论 2(2(1Cu2+对漆酶合成的影响 2(2(1(1Cu2+浓度对云芝产漆酶的影响 lJmol,L、 100IJmol,L、200 以云芝液态发酵培养基为基础培养基，分别添加Cu2+浓度O II pmol,L、400umol,L、500umol,L