薄层层析法黄曲霉毒素B1的测定

薄层层析法黄曲霉毒素B1的测定 ? 样品中AFT B经有机溶剂提取、净化、浓缩并经薄层色谱分离后，在波长1 365nm紫外光下产生荧光，根据其在薄层板上显示荧光的强度与标准品AFT B1 最低检出量产生的荧光强度比较来测定样品中AFT B的含量。 1 三氯甲烷（AR） 正己烷（AR 沸程30-60）或石油醚（沸程60-90） 甲醇（AR） 苯 （AR） 乙腈 （AR） 无水乙醚 （AR） 丙酮 （AR） （以上试剂应重蒸，并应经检验对薄层色谱测定无干扰） 苯-乙腈(98:2)混合溶液 甲醇-水（55:45）混合溶液 三氟乙酸（AR） 氯化钠 （AR） 无水硫酸钠（AR） 硅胶G （薄层色谱用） 5%次氯酸钠溶液：称取100g漂白精，加入500mL水，搅匀。另将80g工业 用碳酸钠（Na CO.10HO）溶于500mL温水中，倒入上述溶液中，搅匀，澄清过232 滤后贮存于带橡皮塞的玻璃瓶中，用作消毒剂。 ：用百万分之一的微量分析天平精密称取 1-1.2mgAFT B标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光置1 于4?冰箱中保存。使用前用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯-乙腈混合溶液调整其浓度为10ug/mL。（在350nm测定AFT B的苯-乙腈溶液的吸光度，其摩1 1 尔消光系数为19800，可根据朗伯-比尔定律求出其浓度）。 ：吸取1.0mL10ug/mL的黄曲霉毒素B标准贮备液于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容。 1 ：吸取1.0mL 1ug/mL的黄曲霉毒素B标准应用液I于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容。 1 ：吸取1.0mL 0.2ug/mL的黄曲霉毒素B标准应用液II于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液定容。 1 玻璃板：5×20cm 涂布器 色谱展开槽（25×6×4cm） 紫外光灯：100-125W，带有波长365nm滤光片 微量注射器：20uL,10uL各一支 称取4g混匀的花生油样品于小烧杯中，用20mL石油醚或正己烷，将其转移到125mL分液漏斗中，用20mL甲醇-水溶液分数次洗烧杯，洗液并入分液漏斗中， 振摇2分钟，静止分层后，将下层甲醇-水溶液移入第二分液漏斗，再用5mL甲醇-水溶液重复提取一次，提取液并入第二分液漏斗中。在第二分液漏斗中加入 20mL三氯甲烷，振摇2分钟，静止分层后，放出三氯甲烷层，经盛有约10g先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的慢速滤纸过滤于50mL蒸发皿中，分液漏斗中再加5mL三氯甲烷提取一次，三氯甲烷层一并滤入蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷 洗过滤器，洗液并入蒸发皿中。在通风柜中，将蒸发皿于65?水浴上挥干，然后放入冰盒上泠却2-3分钟，准确加入1mL苯-乙腈混合液，用带橡皮头滴管的 管尖将残渣充分混合，若有结晶析出，将蒸发皿取下，继续溶解、混匀，晶体消 失后用滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管中。 2 称取约3g硅胶G，加相当于硅胶量的2-3倍左右的水，用力研磨1-2分钟，至成糊状后立即倒入涂布器内，推铺成5×20cm、厚度为0.25 mm的薄层板三块。于空气中干燥约15分钟后，在100?下活化2小时，取出放入干燥器中保存。 将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板底端3cm的基线上用微量注射器滴加样液和标准液： 第一点：10uL 0.04ug/mL AFT B 标液 1 第二点：20uL样液 第三点：20uL 样液 + 10uL 0.04ug/mL AFT B 标液 1 第四点：20uL 样液 + 10uL 0.2ug/mL AFT B 标液 1 要求点距边缘和点间距约为1cm,样点直径约3cm,大小相同，点样时可用电吹风 冷风边吹边点。 在展开槽内加10mL无水乙醚，将点好样的薄层板预展12cm，取出挥干。再 于另一展开槽内加10mL 丙酮+三氯甲烷（8+92）混合溶剂，展开10-12cm，取出 挥干。 将展开好的薄板放在365nm的紫外灯光下观察：a.若第一点无荧光或都无荧 光。说明薄板或展开剂未制备好，需重新制备。b.第一点有荧光，而其余三点无 荧光。说明样液中有荧光猝灭剂，样液需重新制备。c.第一点有荧光，第二点无 荧光，三、四点有荧光。说明样液不含AFT B 或含量小于最低检出量。d.四个1 点都有荧光。需做确证实验后再进行定量。 于另一薄板上左边依次点二个样： 第一点：10uL0.04ug/mL AFT B标液 1 第二点：20uL样液 在以上两点各加一小滴三氟乙酸（TFA），待反应5分钟后，用电吹风热风2分钟，使温度不高于40?。 3 再于薄层板的右边点以下二个点： 第三点：10uL 0.04ug/L AFT B 标液 1 第四点：20uL样液 同第3>步展开后，于紫外光下观察样液是否产生与AFT B标准点相同的衍生物1 AFT B,未加TFA的第三、四点作空白对照。 2a 若第二点的荧光强度比第一点强，则根据其强度估计减少点样体积，于另一 薄板上点四个点： 第一点：10uL 0.04ug/mL AFT B标液 1 第二点：10uL 样液 第三点：15uL 样液 第四点：20uL 样液 展开后取荧光强度与第一点相同的样点进行计算。 V × D 1 X = 0.0004 × ———— V × m 2 X ——样品中AFT B 的含量ug/kg(ppb) 1 V——稀释前样液的总体积mL 1 V——出现同等荧光强度的稀释后样液点样量uL 2 D ——样液的稀释倍数 4