国内5种医用益生菌产品的菌种分析

国内5种医用益生菌产品的菌种分析 第三军医大学 硕士学位论文国内5种医用益生菌产品的菌种分析 姓名:但国蓉 申请学位级别:硕士 专业:动物学 指导教师:魏泓 20060501 ,,,五,, 第三军医大学研究生学位论文独创性声明 秉承学校严谨的校风和科研作风，本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名:征盟日期:啦:互:墨, 第三军医大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解第三军医大学有关保护知识产权的，即:研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第三军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为第三军医大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名:,皇国蕴 指导教师签名:尘堇坠 日 期:丛:,, , 笙三兰垦奎堂堡主堂堡笙茎 英文缩写一览表英文缩写 英文全称 中文全称,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,, ,,,核糖体,,,编码基因,,,,, ,,,,; ,,;,, ,,,,,,,, ,,,,;, ,,,, 局部比对检索工具,,, ,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,,, 十二烷基磺酸钠,, ,,,,,,,, 碱基对,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, 十六烷基三甲基溴化铵,, ,,,,(,,,,,,,,,,,,,),,,,,,,,,,,, 三羟甲基氨基甲烷,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,, 菌落形成单位,,, ,,,, ,,, ,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,,,, 联合国粮食及农业组织 ,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,,、,,?, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,, 世界卫生组织,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,;,,,,,,,,,,, 变性梯度凝胶电泳,, ，,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,, 肠应激综合症,, ，,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,, 炎症性肠病,,,,,, ,,,,,,;,,,,, ,,,酶,,,,, ,,,,,,,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, 脱氧核糖核苷三磷酸,,, ,,,,,,,,,, ;,,,, ,,,;,,,, 聚合酶链式反应,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,, 转数，分钟,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, 邻位相连法 第三军医大学硕士学位论文 ,,,,,,,,; ,,;,,,,, ,,,,,,,, ,, , ,,,,;,,,, ,,,,,,,,; ,,,,,;,, ,,,,,,;, ,,, ,,,;,,, ,,, ,,, ,,,,,, ,, ,,;,,,,,, ,,, ;,,;,,, ,,, ,,,,,,,,; ,,,,,;,,(,,;,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,; ,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,, ,, ,,;,,,,,,,,,;,,, ,, ,,, ,,,,,, ;,,,,,,,,, ,, , ,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,, ,,, ,,,,,;, ,,,,,(,,,,,,,，,,,,, ,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,;, ,,,, ,, ,,, ;,,,,,,(,,,, ,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,;,,, ,, ,,,, ,,,,;,,,, ,,,,,,,,; ,,,,,;,, ,, ,,, ;,,,,,,(,, ,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,;,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,;,,,, ,,,,,,,,; ,,,,,;,,，,,,,, , ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,;,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,;,,, ,,,,,,,,;,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,(,,, ,,, 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,,,, ,, ？,,,,,, ;,,,,,, ,, ,,,,,,,,; ,,,,,;,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,—,,,,,, , 第三军医大学硕士学位论文,,, ,,;,,,,,,,;,, ,,,,,, ,, ,,,,,;, ,,,,,,,;,,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,, , ,,,,,，,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,;,,,, ,,,,,,;, ,,, ,,,,,,,,;,,,,,,,, ,,, ,,,;,,, ,, ,,;,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,; ,,,,,;,, ,,, ,,,,,:,,,,,,,,; ,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,;,,,,, , 第三军医大学硕士学位论文 国内,种医用益生菌产品的菌种分析 摘 要 益生菌制剂产品菌种与活菌数含量是其产品质量的关键。国外益生菌产品的微生物分析表明，部分产品的微生物种属和活菌数含量与产品标签上标注的种属和数量不符。然而，国内还没有这方面的研究报道。本课题对国内主要的五种医用益生菌制剂产品进行菌种分析。考察了五种医用益生菌制剂多个批次产品的活菌数含量，有统计意义的反映产品在有效期内的活菌数含量情况。通过结合表型特征分析法与,,, ,,,,序列分析法对从产品中分离的,,株菌进行种属鉴定。同时将,,,,,,,,分析方法应用到鉴定益生菌制剂产品菌株组成，为益生菌制剂产品的质量控制提供快速、可靠、重复性好的分析方法。 方法与结果:(,)通过筛选获得到适合的选择培养基，并用于,种医用益生菌制剂,,批产品的活菌计数，计数结果显示:产品，中的三种菌的活菌数变化范围分别为,,,,,,,,,,,,粒、,,,,,,,,,,,粒、,,,,,,, ,,,，粒，产品?的活菌数变化范围为,,,,,,,,,,,粒，产品，，，的活菌数变化范围为,,,,,,, ,,,,粒，产品?中的两种菌的活菌数变化范围分别为,,,,,,, ,,,,粒和,,,,,,,,, ;,,,粒，产品,中的三种菌的活菌数分别为,,, ,,,,粒、,,, ,,,,粒、,,, ,,,,粒。(,)分离纯化,,株产品菌株，提取单菌株基因组,,,，,,,扩增,,, ,,,,基因，纯化并测定,,,产物序列，将测得序列与,,,,,,,数据库的序列进行同源性分析，并建立系统进化树。在,,,,,,,数据库中登陆其,,株菌的,,, ,,,,序列，获得如下序列号:,,,,(,,,,,,,,)，,,,,(,,,,,,,,)，,,,, (,,,,,,,,)，,,,,(,,,,,,,,)，,,,,(,,,,,,,,)，,,,,(,,,,,,,,)，,,,, (,,,,,,,,)，,,,,(,,,,,,,,)，,,,,(,,,,,,,,)，,,,,(,,,,,,,,)。基于菌株,,, ,,,,序列的,,,,,和系统进化树分析结果表明产品，中含有的三种菌分别为长双歧杆菌、植物乳杆菌和粪肠球菌;产品，，中含有的菌是动物双歧杆菌;产品?中含有的菌是地衣芽孢杆菌;产品?中含有的两种菌是屎肠球菌和枯草芽孢杆菌;产品,中含有的三种菌分别为动物双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌。(,)将分离菌株进行形态、生理和糖发酵实验，结果表明这些表型鉴定的结论与,, , ,,,,基因序列同源性分析结论一致，分离纯化,种产品的,,株菌中仍有相同的,株菌与标签标注的不一致，即其中标签上分别标注为青春双歧杆菌和长双歧杆菌的两株菌鉴定结果均为动物双歧杆菌， , 第三军医大学硕士学位论文标签上标注为嗜酸乳杆菌的菌株鉴定为植物乳杆菌。(,)提取产品及单菌株基因组,,,，,,,扩增,,, ,,,, ,,,,,区，,,,,电泳,,,产物，根据产品样的条带数分析,种产品的微生物组成，通过参照菌株样及已鉴定的单菌株样在变性梯度凝胶上的位置鉴定产品，、，，、,的微生物种属。结果显示,种产品都没有污染杂菌，产品，、，，、,的菌种鉴定结果与前面两种鉴定方法的鉴定结果一致。 结论: ,(本课题考查了国内的,种益生菌制剂,,批产品的活菌数含量，只一个批次产品的活菌数低于产品标签标准，说明我国益生菌产品在货架期基本能保证其活菌数含量不低于标签标注的数量。 ,(通过生理生化特征分析、,,, ,,,,序列分析和,, ,—,,,,分析，对,种产品中分离的,,株菌进行了种属鉴定。其中,种产品中各有,株菌株与标签标注不符，标签上分别标注为青春双歧杆菌、长双歧杆菌的两株菌，其鉴定结果均为动物双歧杆菌;标签上标注为嗜酸乳杆菌的菌株，鉴定为植物乳杆菌。 ,(在,,,,,,,上登陆了上述,,株菌的,,个,,, ,,,,序列，为相应益生菌产品菌种质量控制及其菌株知识产权保护提供了分子标记资料。 ,(,,,,,,,,分析方法可用于分析益生菌产品的微生物的组成和种属，该方法快速、可靠、重复性好。 关键词: 益生菌 ,,, ,,,, ,,, 标签,,,, 鉴定 , 第三军医大学硕士学位论文 国内,种医用益生茵产品的菌种分析 刖 舌 根据,,,,,,,联合专家委员会的定义【，】，益生菌是活的微生物，通过摄入充足的数量，对宿主产生功能性健康益处。益生菌的健康作用主要包括生物拮抗，微生态平衡，生物屏障作用，免疫调节作用和代谢营养作用【,(,】。以益生菌制成的制剂即益生菌制剂在临床上用于治疗腹泻、便秘、肠应激综合症(，,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,，,,)、炎症性肠病(，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，，,,)、幽门螺杆菌感染、变态反应性疾病、结肠癌等疾病,。,,。 随着人们对益生菌作用认识的深入，益生菌制剂产品在国内外迅速崛起，市场不断扩大。然而近年来国外一些研究表明，市售的有些益生菌制剂产品的微生物种属和数量,与产品标签上标注的种属和数量不符?“。目前研究发现益生菌株的作用具有种属特异,性，同一属内的不同种可能有不同的益生特性【,,，, ,】。同时临床实验证明，只有每天摄入:足够数量的活菌，益生菌才能发挥作用【,。”。因而正确鉴定益生菌制剂产品中的菌种组成?和检测其活菌数量是益生茵制剂产品安全有效的保证。 传统的形态、生理生化鉴定法虽然仍在工业微生物领域中广泛应用，但由于这种鉴定方法重复性差，分类分辨率低，常常只能将菌株鉴定到属的水平,,”。近年来国外学者在益生菌基因型鉴定方面做了许多研究，建立了,,, ,,,,序列分析法、,,,,,,,核酸杂交法、,,,,分析法、,,,,分析法等方法。这些方法各有优缺点，其中,,, ,,,,序列分析法是通过,,,扩增菌株,,, ,,,,序列，测定扩增序列，再与,,,,,,,数据库中的序列进行同源性比对，从而对菌株作出鉴定。,,,,,,,联合专家委员会”堆荐联合,,,,,,,序列测定和碳水化合物发酵实验来鉴定益生菌制剂产品菌株的种属。 然而，前面这些方法的一个共同特点是都必须先将菌株分离纯化。平板培养方法已被证明在复苏率和重现性方面都有局限，复苏分离可能不能真实反映产品中微生物的组成〔,,，,,，,,】。而且，更深入的研究益生菌制剂产品生产过程和生产菌株的存活力需要既分析活菌又分析死菌。在实际生产中，要把生产菌株鉴定到种的水平使依赖培养的鉴定方法非常耗时、耗力。研究发现，用不依赖培养的方法可以快速、可靠的鉴定益生菌产品菌株。其鉴定方法包括以下三步:(,)从益生菌产品中提取细菌基因组,,,;(,,),,,扩增,,, ,,,,基因特定片段;(,,,),,,,电泳,,, ,,,,扩增片段。目前，,,,, 第三军医大学硕士学位论文分析法是一种最合适并广泛应用的研究不同环境里复杂微生物群的方法【,,,，如人或动物胃肠道的微生物群的组成„,,，川。与复杂的生态系统比较，益生菌产品是一个相对简单的微生物群。因此，,,,,方法能够分析任何益生菌制剂产品的微生物组成。而且，,,,,,,捌等人和,,,,,,〔,,,等人的研究表明通过,,,,方法能 快速、准确鉴定产品菌株。 目前，国内生物制品规程上对益生菌制剂的检定方法还是用传统的生理生化鉴定方法„拥。并且这方面的研究论文也很少。其中，,,,,年袁佩娜„,,,等研究了应用,,,,技术鉴定菌株，文中指出目前国内不同的产品常用同一种菌，各生产厂家相互抄袭的现象。因此，本课题拟通过检测国内主要的医用益生菌制剂每种产品多个批次的活菌数含量对产品在有效期内的活菌数进行考察，通过结合表型分析和,,, ,,,,序列分析对产品分离菌株进行鉴定，同时利用并改进,,,,,,等人建立的,,,,,,,,,分析方法，快速、准确、可靠分析鉴定益生菌制剂产品菌株组成和种属。并期望这种技术能应用于益生菌产品的质量控制。第三军医大学硕士学位论文课题技术路线 , 第三军医大学硕士学位论文 材料和方法 一、实验材料 (一)主要试剂 ,,, ,,,,,,, 天为时代 蛋白酶, ,,,;, 十二烷基磺酸钠(,,,, 华美生物工程公司 二羟甲基氨基甲烷(,,,,) 华美生物工程公司 琼脂糖(,,,) 上海,,,,有限公司 溴化乙锭(,,) ,,,,, ,,,, 上海化学试剂厂 溶菌酶 ,,,, ,,,,,,,, ,,,扩增试剂盒 天为时代 ,,,铀,, ,,,, ,,？ ,,扩增试剂盒 ,擞,,, ,,,产物纯化试剂盒 上海华舜生物工程公司 氯仿，无水乙醇，异丙醇 重庆化学试剂厂 甲酰胺 ,,,,, 尿素 ,,,,, 四甲基乙二胺(,,,,,) ,,,,,,, 过硫酸胺 华美生物工程公司 丙烯酰胺,,，,?一亚甲双丙烯酰胺溶液(,,(,:,) ,,,,, ,,,,,—, ,,,培养基(,, ,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,,) ,，(,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,) ,,,,, 营养琼脂培养基 北京奥博星生物技术有限 公司 ,,,基础培养基 ,?,,, (二)主要溶液及配制 ,(,,缓冲液(,×):,,,,”，,,,—,,，(,,,(,)， ,,, ,,,,(,,,(,)，加去离子水搅拌混匀，定容到,,,,,, ,(,,,电泳缓冲液(,,,):,,,, ,,,,,一碱，,,(,,,冰乙酸，,,,,, ,(,, ,, 第三军医大学硕士学位论文,,,,(,,,,(,)，加去离子水搅拌混匀，定容至,,,,,, ,(,,,,,,,,,溶液:,,,,,,,，,(,,,,,，，加入,,,,,去离子水中，,,”,〕,,热溶解 ,(酸性,,,培养基:将,,,培养基用,,，调,,值至,(,?,(, ,(,,,培养基:将,，,,,公司的,,,基础培养基添加,,,的蔗糖 ,(,,,培养基:于,,,培养基中添加,(,,,的盐酸半胱氨酸(北京化学试剂公司)高压灭菌，待培养基冷至,,。,左右(倾倒平板之前)加入莫匹罗星水溶液使其终浓度为,,,,,,, ,(莫匹罗星水溶液:由百多邦软膏(莫匹罗星是百多邦软膏的主药成分)内容物以无菌蒸馏水稀释至,,,,,,，充分溶解后，过滤灭菌 ,(,,的聚丙烯酰胺凝胶(,,的变性梯度)溶液:,,,, ,,,丙稀酰胺，双丙稀酰胺(,,(,(,,)，,,, ,,,,,,缓冲液，,,,,去离子水，过滤(,(,,,,)，,”,保存 ,(,,的聚丙烯酰胺凝胶(,,,,的变性梯度)溶液:,,,, ,,,丙稀酰胺，双丙稀酰?胺(,,(,:,)，,,, ,,,,,,缓冲液，,,,,甲酰胺，,,,尿素，加去离子水定容到,,,,,，过滤(,(,,,,)，,,,保存 (三)菌株基因组,,, ,,,,鉴定实验参照菌株(表,)的基因组,,,由,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,, ,大学的,,,,,, ,,,,,,,,教授惠赠。 , 表,用于建立,,,,鉴定,,,,,,,和,,,,,,,的菌株 种名 菌株编号,,,,,, 第三军医大学硕士学位论文 (四)寡核苷酸引物(由上海英骏生物工程技术有限公司合成) ,(扩增从产品中分离的菌株的,,, ,,,,近全长的引物是原核细胞,,, ,,,,通用引物,,,,:上游引物,,,:, ,一,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,一,?下游引物,,,,,(,,?一,,, ,,, ,,, ,,,, ,,, ,,, ,一,? ,(扩增从产品中分离的菌株和参照菌株的,,, ,,,,,,,,,区的引物„,,,:上游引物,,,,一,,(位于大肠杆菌,,, ,,,,基因的,,,位核苷酸):, ,一,,, ,,,,,, ,,, ,,, ,,, ,,,,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,,,,一,下游引物,,,,(位于大肠杆菌,,, ,,,,基因的,,,位核苷酸):,?一,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,一,? (五)主要仪器 ,,,;,,,,,,电子分析天平 瑞士 ,,,,一,,,,超净工作台 苏州 ,,,,,电(子酸度计 ,,;,,,,，美国 ,, ,,,—,,,电热鼓风干燥箱 重庆 恒温光照培养箱,,,,,, 中国科学院武汉科学仪器厂 立式压力蒸汽灭菌锅,,—,,,, 上海医疗核子仪器厂 ,,,,,,,光学显微镜 日本,,,,,,,公司 ,,,,,,,数码相机 日本,,,,,,,公司 ,,, ,,型三用水箱 金坛市富华仪器有限公司 ,,,一,,,型,,,仪 美国,,,,,,,,公司 水平电泳仪 江苏海门市麒麟医用仪器厂 ,,,—,,, ,,,,,;,,,,型凝胶成相系统 美国,,,,,,,公司 ,,,一,厌氧培养手套箱 上海跃进医疗器械厂 ,,一,型微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂 ,,,型针头过滤器 上海医药工业研究院 ,(,,,,滤膜 上海医药工业研.