联合应用神经营养素-4胶质细胞源性神经营养因子对脊髓前角运动神经元的保护作用研究

联合应用神经营养素-4胶质细胞源性神经营养因子对脊髓前角运动神经元的保护作用研究 联合应用神经营养素-4胶质细胞源性神经营养因子对脊髓前角运动神经元的保护作 用研究 实用医技杂志2011年8月第l8卷第8期JournalofPracticalMedicalTechniaues,August2011,Vo1.18,No.8?795? 联合应用神经营养素一4 胶质细胞源性神经营养因子 对脊髓前角运动神经元的保护作用研究 山西省中铁十七局中心医院(030032)刘刚潘世鹏 【摘要】目的研究周围神经损伤后经蛛网膜下腔置管局部联合应用神经营养素(NT)一4和外源性胶质细胞 源性神经营养因子(GDNF)对脊髓前角运动神经元的保护作用.方法成年SD大鼠随机分为3组,GDNF组,NT-4 组和GDNF联合NT一4组.切断大鼠坐骨神经致相应脊髓前角运动神经元损伤,于第5,6腰椎椎间隙行蛛网膜下腔 置管,并注入外源性GDNF(10p.g/mL)和NT,4,不同时间处死动物并取材,对L4节段脊髓标本冰冻切片,行苏木 素一伊红染色,尼氏体染色,胆碱酯酶染色.结果GDNF联合NT一4组脊髓前角运动神经元的存活率,胆碱酯酶阳性 颗粒面积均比前2组有明显提高,组间比较差异有统计学意义(P<O.05o结论周围神经损伤后通过蛛网膜下腔联 合注入NT一4,GDNF较两者单独使用更有利于保护脊髓运动神经元. 【关键词】周围神经;运动神经元;神经生长因子类;胶质细胞源性神经营养因子 ProtectiveeffectofgIiaIcellline-deriredneurotrophicfactorandNT-4infusedintothetubese ttedintocavitas subarachnoidealisoHspinalfrontcornermotorneuronsLIUGang.NShi-peng.TheCentral HospitalofChina RailwayNo.17EngineeringBureau,Taiyuan03o032,China 【AbstractJobjectiveToinvestigatetheeffectofexogenousglialcel1line— derivedneurotrophicfactor(GDNF) andNT一 4infusedintothecavitassubarachnoidealisonspinalfrontcornermotorneuronsaftersciaticnerveaxotomy. MethodSeventy— twohealthySDratsweredividedinto3groupsrandomly:GDNFgroup,NT一 4group,GDNFandNT- 4group.Theleftsciaticnerveinratswerecutoffandspinalcordanteriorhornmotorneuronsweredamaged.Andthen NT一 4andGDNFwereiniectedintocavitassubarachnoidealisatkingroups,respectively.Theratsweresacrificedon postoperativeday1,2,4,8wrespectively.TheirspecimenofIspinalcordweretakenatdifferenttimeandsectioned. TheHEstaining,Nisslstainingandcholinesterase(ChE)staininginmotorneuronswereusedforcountingofmotor neurons.ResultInGDNFandNT一 4groupthenumberofmotorneuronsinspinalfrontcornerandtheChEactivitywere notablehigherthanthatofothergroups,whicthadsignificantdifference(JP<0.05).ConclusionTheexogenousGDNF andNT一 4infusedintotheeavitassubarachnoidealisweresupposedtoplayamoreimportantroleinprotectingthe degeneratedspinalmotorneuronfromdeathaftersciaticnerveiniury. 【Keywords】Peripheralnerves;Motorneuron;Nervegrowthfactors;Glialcel1line— derivedneurotrophicfactor 周围神经损伤后脊髓及背根神经节等相关神经 元会发生一系列形态,代谢,生化及基因达的改 变,甚至死亡,在周围神经损伤的治疗中,如何减少损 伤后神经元的死亡而提高神经修复效果,是临床所 关心的课题,神经因子的应用是该领域的研究方向, 胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline—derived neurotrophicfactor,GDNF)和神经营养素(NT)一4 是近年发现的神经营养因子(neurotrophicfactor, NTF),对运动神经元和感觉神经元均有强大的神经 营养作用?.本实验旨在通过切断并显微吻合坐骨神 经造成动物脊髓前角运动神经元损伤,经蛛网膜 下腔置管局部应用GDNF,NT一4,达到保护神经元的 目的. 1材料与方法 1.1动物及分组:sD雄性健康大鼠72只(山西医科大学动 物实验中心提供)250300g,随机分组:?NT一4(购于美国 PeprotechAsia公司)组24只,5%水合氯醛腹腔麻醉后,左侧 坐骨神经于梨状肌下缘1cm处切断,之后用9-0无创线缝合 神经外膜,再于腰(L)5,6椎间隙行蛛网膜下腔置管,于手术 当天通过留置管注入NT一46L(10p~g/mL),连续注射10d; ?GDNF(购于美国PeprotechAsia公司)组24只,同法给予 GDNF6;?GDNF,NT一4联合组同法个给予各3. 1.2实验标本制备:术后1,2,4,8周分别处死动物并取材. 具体方法:麻醉后,由心尖部插管至升主动脉,并于右心耳处 剪一小口,先用250mL生理盐水快速冲洗,再用4%多聚甲 醛磷酸盐缓冲液(PBS)溶液400mL灌注固定,最后20%蔗糖 溶液灌注,取腰膨大(中心为节段)之脊髓,于4%多聚甲 醛溶液中后固定4h,高渗蔗糖溶液(4?)脱水过夜,一20? 连续冰冻切片,片厚5m,间隔5张取1张. 1.3观测项目与方法:标本切片进行常规苏木素一伊红(HE) 染色;尼氏体染色(Thionine硫堇染色法);胆碱酯酶染色 (KarnOVSky-Roots铁氰化铜法).光镜检查照相及显微图像分 ? 796'塞旦医蕉盘查2!生8筮1鲞筮婴of,堕!丛i,!hg塑,盟2Q!!!,_l8'盟U. 析系统分析,计数脊髓前角大,中型运动神经元数目,计算实 验侧与对照侧的神经元数目之比,即神经元的存活率,使用 MIAS一2000图像分析系统计数胆碱酯酶染色阳性颗粒面积, 计算实验侧与对照侧的染色阳性颗粒面积之比,得出胆碱酯 酶染色阳性面积的变化率. 1.4统计学处理:数据以表示,采用SPSS11.0软件 分析,联合组分别与NT一4组和GDNF组同时间点两均 数比较进行t检验,组内不同时间点比较用SNK一口检验. 2结果 2.1HE染色结果:术后1周,即可观察到手术侧脊髓前角广 泛水肿,神经元数量减少,染色淡.偶而可见个别典型凋亡细 胞孤立存在,细胞核染色质边聚,致密深染;胞质呈橘红色明 显深染;胞体体积收缩变形;细胞周围有空晕存在.3组标本 处理后病理改变相似,但GDNF联合NT一4组神经元肿胀程 度和数量减少程度均较前2组轻. 2,2尼氏体染色:见表l.尼氏体是神经元胞体内含有的特异 性嗜色质,是合成蛋白质的主要场所,该染色可直接反映脊髓 前角运动神经元的数量和体积变化.本实验计数位于脊髓前 角外侧核大,中型神经元数目.脊髓前角运动神经元的存活率 以手术侧与非手术侧同类神经元的数量相对比表示,坐骨神 经切断后各组手术侧的脊髓前角神经元存活率减少,部分神 经元染色明显变淡,有的轮廓不清楚,l周以后,联合组神经 元的存活率较前2组大,差异有统计学意义. 表1坐骨神经切断后脊髓前角运动神经元存活率的变化() 2.3胆碱酯酶(ChE)活性的变化:见表2.健康大鼠脊髓腰段 前角外侧IX板层运动神经元ChE活性反应强烈,细胞轮廓清 晰,阳性反应颗粒呈红褐色位于胞质,核不着色,本实验神经 损伤后脊髓前角ChE含量的变化情况,术后1周观察有降 低,2周达最低,以后略有恢复,第4周以后基本稳定.除1周 外各时间点2组染色阳性颗粒面积的百分率相比差异有统计 学意义.说明联合GDNF与NT一4较单独使用GDNF和NT一4 更能够缓解外周神经损伤后造成的脊髓前角神经元ChE活 性的降低. 表2坐骨神经切断后脊髓前角ChE染色阳性面积百分率的变化(?s) 3讨论 3.1神经营养素对中枢神经元的保护作用:神经营 养因子是一类作用于神经元的功能性蛋白质,神经 损伤后神经元凋亡与神经营养因子的缺乏有关, 若给予外源性神经营养因子,则可通过由受体介导 的内吞作用经轴浆流运输到神经元发挥营养作用, 从而抑制神经元的凋亡.本实验选取的2种神经 营养因子是近些年研究发现的研究热点,NT一4/5是 2O世纪90年代在哺乳动物发现的,其实它们是同 一 物质,一般称为NT.一般认为,NT_4不仅对 某些特定亚群神经元的存活,增殖,分化及轴突可 塑性有一定的调节作用,而且对周围神经系统的感觉 神经元和中枢神经系统的某些神经元的生存也是必 需的. 研究表明NT一4/5能支持鼠胚运动神经元存活. 并在神经元上发现了其受体:运动神经元损伤后能诱 导神经调节素表达增多,这都说明它们具有运动神 经营养作用.大鼠坐骨神经横断2周后NT一4/5 mRNA显着上调,上升到正常的8倍以上,推测NT一 4/5具有保护运动神经元和促进轴突外向生长的能 力l3J.GDNF在1993年首先发现,来源于神经胶质细 胞,最初被认为对多巴神经元有明显的营养与促存 活作用,后来研究发现,GDNF对胆碱能运动神经元 也有强的活性.此外,其对感觉神经元,交感神经元 实用医技杂志2011年8月第l8卷第8期 也有一定的作用,GDNF是迄今发现的效能最强的 多巴胺能及脊髓运动神经元营养因子.神经损伤后其靶器官及损伤区域GDNF表达增加,提示损伤神 经元对GDNF的需求增加.大量研究工作表明:损伤 的中枢神经元具有可塑性,也能再生且在神经营养 因子作用下再生速度及质量均有显着增强.GDNF 作为神经营养因子之一,对神经元细胞的支持及存 活作用已成为中枢神经研究的热点.NT一4,GDNF均 对神经元起着重要的保护作用,但由于对两者的保 护作用机制尚未完全清楚,两者对神经元的保护作 用孰轻孰重,本实验中未妄加求证.本实验中联合用 药可提高保护神经元效果,但有无药物配伍禁忌尚 不明确,尚需进一步药理学研究. 3.2周围神经损伤后对脊髓前角运动神经元的影 响:Oppenhein等的实验表明,切断新生鼠脊髓运动 神经,可使脊髓中40%50%相应运动神经元死亡, 存活者也呈现萎缩:在断端加人GDNF则可阻止神 经元死亡和萎缩,存活的神经元胞体还有一定程度 增大,轴突切断后,可引起脊髓前角运动神经元的改 变.周围神经损伤后,神经元死亡的主要原因是自远 端向神经元的神经营养因子逆向运输中断,而通过手术重建神经的连续性可恢复神经营养因子逆向运 输,但目前临床上的治疗主要还是恢复外周神经的 连续性,对中枢神经元的保护研究临床报道较少.实 验研究发现提供外源性神经营养因子则可以延长神 经元的存活阁,所以神经功能重建的有效治疗方法就 是实施神经吻合的同时,对神经元采取保护性措施, 使神经元为再生轴突提供基本的物质条件. 参考文献 【1】袁源,杨志敏,王廷华,等.GDNF的研究进展.神经解剖学杂 志,2003,19(1):103—108. 【2】ThanosPK,OkajiamS,TerzisJK.Uhrastructureandcellular biologyofnerveregeneration.JRcconstrMicrosurg,1998,14 (6):423—436. [31BraunS,CroizatB,LagrangeMC,eta1.Neurotrophinsincrease motoneuronsabilitytoinnervateskeletalmusclefibersinrat spinacord—humanmusclecocltures.JNeurolSci,1996,136(1— 2):17—23. [4]OppenheinRW,HouenonIJ,JohnsonJE,eta1.Developing motorneuronsrescuedfromprogrammedandaxotomy—induced celldeathbyGDNF.Nature,1995,373(6512):344—346. 【5]王贵波,李兵仓,王建民.周围神经损伤后运动神经元的保护. 医学综述,2001,7(11):675—676. (收稿日期:2011—04—27) OlympusAU400故障排除三例 内蒙古自治区包头市蒙中医F~(014040)王雅娜张成岗 OlympusAU400全自动生化分析仪速度快,精度高,自动 报警,智能防撞,在国内被广泛地使用.通过多年的使用,对 一 些常见故障,已能做到自行排除.现举以下3例,讲述其排 除过程. 1开机后报警 试剂仓位置未检测出,且HELP提示,传感器有故障.考 虑到本机使用已达4年有余,首先需排除灰尘干扰因素.查 阅说明书,传感器位于试剂仓下方,且为3个.于是打开仪器 左侧板,借助手电筒观察.观察发现,3个用于试剂仓转动时 定位的传感器位置较深,除尘须借助工具.找来打气筒,在其 喷嘴处安一截空油笔芯.然后,尽量靠近传感器,逐个打气除 尘.除尘完毕,启动仪器,果然不再报警. 2运行中报警显示 3238CLOTSAMPLEDETECT(样品针堵).离心后已目 ? 医学? 测过标本,应该有一定血清量,怎么会报警呢?找出该标本,发 现该标本血块凝固后呈"弹簧"样,经过一段时间后凝块又胀 大,接近了血清液面,使得仪器报警.因此,对这种标本一定要 当心,必要时提取血清来做,以免出现仪器报警甚或测出假性 低值. 3开机片刻后出现 3133DIWATERSHORT(去离子水不足).当日水箱已 制好水,怎么会报警水不足呢?考虑到上个工作日标本量大, 水机又未处于"自动"制水状态,水箱内水位已降至出水口,可 能有空气进入了仪器的供水管.于是找到仪器背面下方的供 水单元,松开供水管箍螺栓,拔下供水管,进行放水.排除管中 气体后,再安装好供水管.开机测试,仪器恢复正常. (收稿日期:2011-04—17)