氧化鱼油饲料中添加VE对黑鲷幼鱼体脂含量及肝脏抗氧化酶活性的影响

氧化鱼油饲料中添加VE对黑鲷幼鱼体脂含量及肝脏抗氧化酶活性的影响 氧化鱼油饲料中添加VE对黑鲷幼鱼体脂含 量及肝脏抗氧化酶活性的影响 第l7卷第3期 2008年5月 上海水产大学 JOURNALOFSHANGHAIFISHERIESUNIVERSITY V0I.17.No.3 May,2008 文章编号:1004—7271(2008)03—0298—07 氧化鱼油饲料中添加VE对黑鲷幼鱼体脂含量 及肝脏抗氧化酶活性的影响 彭士明,陈立侨,侯俊利,王伟,龙章强,叶金云,孙新瑾 (1.华东师范大学生命科学学院,上海200062; 2.浙江省淡水水产研究所,浙江湖州313001) 摘要:研究了投喂氧化鱼油饲料中添加维生素E对黑鲷(Acanthopagrusschlegeli)各组织中脂肪含量及肝脏 抗氧化酶活性的影响.以鱼粉,鱿鱼粉,豆粕为蛋白源,以氧化鱼油(过氧化物值POV为45MeqO:/kg油)为 脂肪源配制基础饲料,维生素E醋酸酯(纯度50%)的添加量依次为0mg/kg,100mg/kg,300mg/kg,700mg/kg, 1500mg/kg饲料,共配制五种不同维生素E含量的配合饲料,投喂平均体重18.7g的黑鲷幼鱼9周.结果显 示,饲料中添加维生素E可以显着降低全鱼的脂肪含量(P<0.05),而对肝脏与肌肉中脂肪含量并未有显着 的影响(P>0.05);随着饲料中维生素E添加量的增加,鱼肝脏中的维生素E含量显着升高(P<0.05);饲料 中添加维生素E显着降低了肝脏中丙二醛(MDA)的含量(P<0.05),且随着饲料 中维生素E添加量的增加 肝脏MDA含量呈现下降的趋势,但添加维生素E100,300和700mg/kg组问,700 和1500mg/kg组间肝脏 MDA含量均无显着性差异.与此同时,饲料中添加维生素E可以显着降低肝脏超 氧化物歧化酶(SOD),过氧 化氢酶(CAT),谷胱甘肽一硫一转移酶(GST)活性(P<0.05),并且SOD,CAT活性随 着饲料中维生素E添加 量的增加呈下降趋势,但维生素E对谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—px)与谷胱甘肽 还原酶(GR)活性并未产生显 着性影响(P>0.05).由此可见,在投喂黑鲷氧化鱼油条件下饲料中添加维生素E 在一定程度上可以减缓体 内由于氧化鱼油胁迫所产生的脂质过氧化程度,减轻由于体内过氧化所造成的机 体损伤. 关键词:黑鲷;氧化鱼油;维生素E;脂肪;抗氧化 中图分类号:S963.1文献标识码:A EffectofdietaryvitaminEonlipidcontentandhepaticantioxidant enzymeactivitiesofjuvenileblackseabream,Acanthopagrus schlegeHfedoxidizedfishoil PENGShi—ming,CHENLi—qiao,HOUJun—li,WANGWei, LONGZhang—qiang,YEJin—yun,SUNXin—jin (1.CollegeofLifeScience,EastChinaNormalUniversity,Shanghai200062,China 2.ZhefiangInstituteofFreshwaterFisheries,Huzhou313001,China) Abstract:AfeedingexperimentwasconductedtoevaluatetheeffectsofdietaryvitaminEleve lsonlipid contentandhepaticantioxidantenzymeactivityofjuvenileblackseabreamAcanthopagruss chlegelifeddiets 收稿日期:2007—09—18 基金项目:浙江省科技重大项目(2002C12015) 作者简介:彭士明(1980一),男,山东东营人,博士研究生,研究方向为水产动物营养 生理学.E—mail:shiming.peng@163.corn 通讯作者:陈立侨,Tel:021—62233637,E-mail:lqchen@bio.ecnu.edu.crl 3期彭士明,等:氧化鱼油饲料中添加V对黑鲷幼鱼体脂含量及肝脏抗氧化酶活性 的影响299 containingoxidizedoil.Fivedietswereformulatedutilizingfishmeal, squidmealandsoybeanmealasdietary proteinsource,andfishoil(whichwasoxidizedtoperoxidevaluePOVof45meq/kgoil)asdietarylipid source.Theadditionofa— tocopherylacetate(purity:50%)is0mg/kg,100mg/kg,300mg/kg,700mg/kg and1500mg/kgdrydietrespectively.Juvenileblackseabreamwithaninitialweight18.7g,werefedtest dietstoapparentsatiationtwiceadaylastingfor9weeks.Significant(P<0.05)inter— treatmentdifferencesin wholebodyfatcontentwerefound,butnodifferencesinliverandmusclefatcontentwerenoted(P>0.05). DietaryvitaminElevelsignificantlyaffectedhepaticvitaminEcontent.HepaticvitaminElevelincreased whendietaryvitaminEincreased.TheincrementofdietaryvitaminEsignificantlyreducedhepaticMDAlevels (P<0.05).However,therewerenosignificantdifferencesamong100mg/kg,300mg/kg,700mg/kg vitaminEsupplementationgroupsandbetween700mg/kgand1500mg/kgvitaminEsupplementation groups,respectively.Catalase(CAT),superoxidedismutase(SOD)andglutathione—S— transferase(GST) activitiesinfishliverwereallsignificantlyreducedbydietaryvitaminEsupplementation(P<0.05),andwith theincreaseofvitaminEsupplementation,CATandSODactivitieswerealsoreduced.Incontr ast,glutathione peroxidase(GPX)andglutathionereductase(GR)werelessaffectedbythedietaryvitaminEs upplementation (P>0.05).Inconclusion,thepresentstudyshowedthatdietaryvitaminEsupplementation canpartially abrogatedthelipidperoxidationinfishfeddietscontainingoxidizedoil,tosomeextent,lessen edthedamage tothefishcausedbyhighpro—oxidativestress. Keywords:Acanthopagrusschlegeli;oxidizedoil;vitaminE;lipid;antioxidant 脂质过氧化特别是多不饱和脂肪酸的氧化会引发体内膜脂的氧化损伤,并最终破坏细胞生物膜的 结构.对于鱼类,由氧自由基所引发的体内脂质过氧化是许多疾病产生的主要原因.由于海水鱼 必须从饲料中获得n一3HUPA,因此可以说饲料中高含量的HUFA一方面是海水鱼正常生长所必需的营 养素,另一方面也是其体内产生过氧化的一种负荷,.研究已证明维生素E是一种脂溶性的抗氧化 剂,可以有效的抑制体内脂类过氧化.目前针对维生素E的抗氧化机制研究大都以哺乳动物为研究 对象,而在鱼类上的研究,特别是维生素E针对油脂氧化胁迫的抗氧化作用的研究仍然较匮乏.通 过对金头鲷(SparusaurataL.)?和杂交罗非鱼(Oreochromisniloticus×0.aureus)的研究中发现,维生 素E的抗氧化能力在不同鱼种及饲养模式下存在差异.本实验以海水养殖种类黑鲷(Acanthopagrus schlegeli)为研究对象,以氧化鱼油为脂源配制基础饲料,通过在饲料中添加不同剂量的O/一生育酚醋酸 酯,研究其对海水网箱养殖黑鲷各组织中脂肪含量及其肝脏抗氧化酶活性的影响,旨在为水产养殖业的 健康与可持续发展提供理论基础. 1材料与方法 1.1试验饲料的制备 1.1.1氧化鱼油的制备 氧化鱼油的制备参考文献[3]的方法.油脂过氧化值,酸价和碘价的测定依次采用 国标 GB/T5538—1995,氢氧化钾滴定法和Hanus法.氧化鱼油的各种氧化指标见表1. 表1氧化鱼油的氧化指标 Tab.10xidativeindicesofoxidizedfishoil 300上海水产大学17卷 1.1.2饲料配制 试验的基础饲料以鱼粉,豆粕与鱿鱼粉作为蛋 白源,以氧化鱼油作为脂肪源.维生素E醋酸酯 (纯度50%)的添加量分别为0mg/kg,100mg/kg, 300mg/kg,700mg/kg,1500mg/kg饲料,共配制五 种不同维生素E含量的配合饲料,依次表示为E0, E1,E2,E3,E4.饲料原料经粉碎并过40目筛,混和 均匀后制成直径为2mill的颗粒饲料,置于一2O? 冰箱备用.饲料粗蛋白,粗脂肪与灰分含量测定方 法分别采用凯氏定氮法,索氏抽提法与灼烧法 (550?).基础饲料组成和营养成分见表2. 1.2试验用鱼 黑鲷幼鱼购自宁波市海湾水产苗种繁育中心. 暂养一周后,选取体质健壮,大小整齐的黑鲷幼鱼作 为试验用鱼,平均体重为(18.7?0.1)g. 1.3试验设计及饲养管理 试验于浙江象山港内的海水网箱中进行,网箱 规格为1m×1m×2m,共有五种饲料即五个处理, 每个处理设三重复,每个网箱随机放养30尾鱼.日 表2基础饲料组成和营养成分 Tab.2Thecomponentanditscomposition ofthebasaldiets 饲料原料含量(g/kg) 鱼粉 豆粕 面粉 鱿鱼粉 氧化鱼油 复合维生素 维生素c磷酸酯 胆碱 复合矿物质 营养成分(n=3) 粗蛋白(%) 粗脂肪(%) 粗灰分(%) 维生素E(mg/kg)a-Tocopherol 42.72 16.92 12.75 l18 注:1.每千克饲料添加(mg/kg):肌醇400,烟酸150,泛酸钙44, 维生素B220,维生素B612,维生素K310,维生素Bl10,维生素A 醋酸酯7,3,叶酸5,生物素1,维生素D30.06,维生素Bl20.02. 2.每千克饲料添加:KH2PO4,22g;FeSO4?7H2O,1.0g; ZnSO4?7H2O,0.13g;MnSO4?4H2O,52.8rag;CuSO4?5H2O, 12mg;CoSO4?7H,O,2mg;KI,2mg 投喂2次,分别在8:O0和l6:O0时,每次投喂至鱼摄食不活跃为止,饲料基本无浪费.实验周期为9 周,试验期间养殖海区溶氧7mg/L以上,水温(28?1)?,pH值7.83,8.05,盐度24.3,25.9. 1.4样品采集与分析 实验结束后,停食24h,从每个网箱中随机选取5尾鱼经MS222麻醉后解剖取其肝脏,肝脏样品置 于一70?冰箱保存待测.组织样品在4?下解冻,剪碎,按1:9重量体积比(w/v)加入预冷的 50mmoL/L磷酸缓冲液(pH值7.4),然后匀浆(均在冰上操作).匀浆液经10000r/min离心10rain,取 上清液备用. 丙二醛MDA用TBA法测定(nmol/mgprot). 维生素E用高效液相色谱法测定(g组织湿重). 超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT),谷胱甘肽.硫.转移酶(GST)和谷胱甘肽还原酶(GR) 的测定采用南京建成生物工程研究所的试剂盒,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH.px)的测定采用碧云天生物 技术研究所的试剂盒,具体测定方法参照试剂盒的说明书. 组织匀浆液的蛋白含量以福林一酚试剂法测定. 1.5数据处理 数据以平均值?误(Mean?SE)表示(n=3),试验结果用SPSS11.0软件进行统计与分析,采 用Duncan检验进行多重比较,P<0.05即认为有显着性差异. 2结果 2.1添加维生素E对幼鱼脂肪含量的影响 表3列出了饲养9周后各处理组幼鱼全鱼,肝脏,肌肉中的脂肪含量(湿重比).由表3可以看出, 与未添加维生素E的E0组相比,添加不同维生素E的E1,E2,E3,E4各组,其全鱼的 脂肪含量依次降 低了22.3%,29.0%,25.8%和23.4%,统计分析表明,饲料中不同维生素E添加组全鱼的脂肪含量均 伽姗5252 3期彭士明,等:氧化鱼油饲料中添加V对黑鲷幼鱼体脂含量及肝脏抗氧化酶活性的影响301 显着低于对照EO组(P<O.05),但随着维生素E添加量的增加,鱼体脂肪含量的变化并不十分明显. 肝脏中脂肪含量随着添加VE量的增加有下降的趋势,但与对照组相比无显着性差异(P>O.05);肌肉 中脂肪含量的变化趋势与肝脏脂肪的变化趋势相同. 表3添加维生素E对黑鲷全鱼,肝脏,肌肉中脂肪含量的影响 Tab.3EffectsofaddingVEonfatcontentinwholebody,liverandmuscleofjuvenileblackseab ream 注:表中数据为的平均值?标准误,同一列数据不同上标字母代表有显着差异(P<0.05) 2.2添加维生素E对黑鲷幼鱼肝脏中VMDA含量的影响 图1和图2表明,饲料中添加维生素E对幼鱼肝脏中维生素E与脂质过氧化中问产物丙二醛MDA 的含量有明显的影响.随着饲料中维生素E添加量的增加,除E1组外其它三组幼鱼肝脏中维生素E 的含量均显着高于E0组(P<O.05),E0,E1,E2,E3,E4组肝脏中维生素E的含量依次为97.65,494.12, 807.06,1240.00,2557.65g/g组织湿重.与对照组相比,饲料中添加维生素E显着降低了肝脏中 MDA的含量(P<0.05),但随着维生素E添加量的增加,E1,E2和E3组问肝脏MDA含量并没有显着 性差异,E3和E4组之问也没有显着性差异(P>0.05).E1,E2,E3,FA组肝脏中 MDA含量较EO组依 次降低了23.4%,22.5%,36.O%,45.O%. 3000.00 2500.00 2000.00 l500.00 l0o0.00 500.00 0.00 — 500.00 处理 treatments 图1添加维生素E对黑鲷肝脏中维生素E含量的影响 Fig.1EffectsofaddingVEonhepaticVEcontent injuvenileblackseabream 0 0 甚 目 昌 \ 《 坌 , 处理 treatments 图2添加维生素E对黑鲷肝脏中MDA含量的影响 Fig.2EffectsofaddingVEonhepaticMDAcontent injuvenileblackseabream 2.3添加维生素E对黑鲷肝脏中几种抗氧化酶活性的影响 表4列出了用实验饲料饲养黑鲷幼鱼9周后黑鲷肝脏中几种抗氧化酶活性的变化.由表4可以看 出,饲料中添加维生素E可以显着降低肝脏中SOD,CAT与GST活性(P<0.05), 但随着饲料中维生素 E添加量的增加SOD,CAT与GST活性的变化并不十分明显.随着饲料中维生素E添加量的增加,肝 脏中SOD活性呈现降低的趋势.CAT活性具有与SOD相似的变化规律.GST活性随着饲料中维生素 E添加量的增加呈现出波动性的变化,但El,E2,E3和E4组GST活性均显着性低于EO组(P<0.05). 同时,试验结果还显示,饲料中添加维生素E对GSH—px与GR活性并没有产生显着性的影响 (P>0.05). 302上海水产大学 表4添加VE对黑鲷肝脏中主要抗氧化酶活性的影响 Tab.4EffectsofaddingVEonhepaticantioxidantdefenceenzymesinjuvenileblackseabrea m 注:表中数据为的平均值?标准误,同一列数据不同上标字母代表有显着差异(P<0.05) 3讨论 3.1添加维生素E对黑鲷组织中脂肪含量的影响 脂肪氧化酸败产生的大量具有不良气味的醛,酮等低分子化合物及过氧化物,除会影响饲料的适口 性和营养价值,刺激肠粘膜而降低了鱼类的采食及其对营养素的吸收外,对鱼类还有直接毒害作用,如 会造成肝脏肿大,脂肪变性积累和代谢紊乱等』.饲料中添加维生素E可以在一定程度上减缓这种由 于脂质过氧化所造成的对机体的损伤,降低组织中脂质过氧化产物丙二醛的含量,提高组织中维 生素E_1.及还原性谷胱甘肽的含量,并最终可以提高鱼体的增重率'mJ.本试验结果显示,饲料中 添加维生素E可显着降低全鱼的脂肪含量,肝脏,肌肉中脂肪含量也同样表现出下降的趋势.但随着 维生素E添加量的增加,机体中脂肪含量的变化并不十分明显.提示在氧化鱼油饲料中添加适量维生 素E可以提高黑鲷对饲料中油脂的利用,原因可能是饲料中添加维生素E致使鱼体组织中的维生素E 含量升高,而组织中维生素E含量的升高则有效抑制了机体中脂质过氧化程度,降低了组织中的脂质 过氧化产物丙二醛的含量,提高了机体脂肪的利用率,从而减少了鱼体中脂肪的积累.此外,结果 显示,肌肉中脂肪含量较低而全鱼与肝脏中脂肪含量则较高,原因主要在于试验所用脂肪来源为氧化鱼 油,使鱼体腹腔与肝脏中脂肪过多积累所致. 3.2添加维生素E对黑鲷肝脏中V,MDA含量的影响 目前要直接检测氧化损伤尚有一定的困难,一般是通过测定氧自由基作用于各种生物分子如脂质 蛋白及DNA而引起的损伤来评估氧化损伤.其中丙二醛(MDA),异前列腺素等是目前检测氧化损伤 的标记,此为还可通过检测抗氧化剂如V,V等来问接反应机体的氧化损伤程度. 本研究中,饲料中的维生素E含量显着影响组织中的维生素E含量,随着饲料中维生素E添加量 的增加,黑鲷肝脏中维生素E的含量也相应增加.Stephan等对大菱鲆(Scophthalmusmaximus), Gatta等?对舌齿鲈(Dicentrarchuslabrax),Ruff等对庸鲽(Hippoglossusoglossus)的研究中同样发 现,鱼体肝脏中维生素E的含量随着饲料中维生素E含量的增加而增加.由于维生素E是一种有效的 牛物抗氧化剂,可与脂氧自由基或脂过氧自由基反应,使脂质过氧化链式反应中断,从而清除体内过多 的自由暴,因此组织中较高的维生素E含量可以有效抑制组织中的脂质过氧化j.本试验中随着维生 素E添加量的增加黑鲷肝脏中维生素E含量逐渐升高,可从一个方面预示着其抗氧化能力在逐渐得到 加强.但Kaewsrithong等?在对香鱼(Plecoglossusaltivelis)的研究中发现,饲料中较多的维生素E可导 致香鱼机体脂质过氧化程度加强,使血浆和红细胞中脂质过氧化产物过氧化氢物的含量增加.一般来 说,维生素E可中断脂质过氧化的链式反应而自身转变为维生素E自由基.在正常情况下,体内维 生素E自由基的消除主要依靠两种途径,一是其和另一脂质过氧化自由基反应生成非自由基的产物, 二是被组织中维生素c或者还原性谷胱甘肽还原成维生素E".因而过多添加维生素E导致香鱼 血浆与红细胞中脂质过氧化反应加剧的原因,可能是机体组织中维生素c的含量不足以消除机体内产 生的维生素E自由基?.此外,已有资料证实组织中过量的维生素E自由基还可与脂质底物及过氧化 3期彭士明,等:氧化鱼油饲料中添加V对黑鲷幼鱼体脂含量及肝脏抗氧化酶活性的影响303 氢物反应生成新的脂质过氧化自由基?驯,而体内脂质过氧化自由基的增多则最终加剧了机体脂质过 氧化的程度.因此,分析认为,只有饲料中添加适量的维生素E方可有效抑制机体中的脂质过氧化程 度. 丙二醛(MDA)是多不饱和脂肪酸氧化降解的主要产物之一,可以反映机体内的脂质过氧化程度, 同时也是评定抗氧化维生素如维生素E和C在抑制组织脂质过氧化方面有效性的一种指标卜.本 研究中,饲料中添加维生素E的E1,E2,E3和E4组其肝脏中MDA含量均明显低于未添加维生素E的 EO组,提示饲料中添加维生素E可以有效抑制肝脏中的脂质过氧化,从而降低了脂质过氧化对肝细胞 的损伤.Mourente等?在对金头鲷(~arusaurataL.),Huang等在杂交罗非鱼(Oreochromisniloticus ×0.aureus)的研究中均发现,饲料中添加维生素E均可显着性降低组织中MDA的含量. 3.3添加维生素E对黑鲷肝脏中主要抗氧化酶活性的影响 针对抗氧化酶的研究大都集中在其抗毒性作用和其在不同发育阶段的活性变化.动物体 参与清除体内过多自由基的防御系统可以分为非酶系统和酶系统,非酶系统主要包括维生素E,维生素 C,3-胡萝卜素,谷胱甘肽,巯基类化合物以及一些微量元素如硒,铜,锌等;而体内清除自由基的抗氧化 酶系统主要包括超氧化物歧化酶(清除超氧阴离子),过氧化氢酶(清除过氧化氢),谷胱甘肽过氧化物 酶及谷胱甘肽.硫.转移酶(清除脂质氢过氧化物)及谷胱甘肽还原酶(维持体内还原性谷胱甘肽的水 平)等.体内维生素E和抗氧化酶共同组成机体抗氧化防御系统,因而机体维生素E含量可直接影响 氧化油脂对抗氧化酶的作用.从本研究的结果来看,饲料中添加维生素E的E1,E2,E3和E4组其肝脏 中SOD和CAT活性均显着低于未添加维生素E的E0组.Mourente等?在对金头 鲷的研究中也发现, 在投喂氧化油脂时饲料中添加维生素E可显着降低金头鲷肝脏中SOD和CAT的活性.但也有资料显 示,在高氧胁迫下维生素E对大西洋鲑体内的抗氧化系统并未产生显着性影响J,原因可能是维生素 E的抗氧化作用机制在不同鱼种和胁迫因子条件下存在一定差异.此外,已有研究证实淡水鱼与海水 鱼之间,鱼体不同组织之间其抗氧化酶活性也存在差异'-2,这也是导致不同试验结果间产生差异的 原因之一. 本试验中,饲料中添加维生素E可显着降低SOD,CAT,GST活性,但随着饲料中维生素E添加量的 增加,SOD,CAT,GST活性并未出现显着性变化,原因可能是在氧化油脂胁迫下维生素E的抗氧化作用 具有一定的限度,或者是此时酶活力已足以消除胁迫的负面影响.试验结果还显示,投喂氧化鱼油条件 下饲料中添加维生素E对黑鲷肝脏GSH.px和GR活性没有产生显着性影响.Mourente等…的实验结 果同样表明,添加维生素E对金头鲷肝脏GSH.px和GR活性没有显着性的影响,Vallsa等的报道也 指出添加维生素E对高脂胁迫下小鼠肝脏GSH.px活性并没有显着性影响.究其原因,可能是当GSH—px 和GR活力已达到足以清除体内脂质氢过氧化物自由基,维持体内还原型谷胱甘肽水平的能力时,维生 素E对两者不具有明显的生理效应,但确切的原因还需要进一步研究. 参考文献: [1]MourenteG,Diaz—SalvagoE,BellJG,eta1.Increasedactivitiesofhepaticantioxidantdefenceenzymesinjuveni legiltheadseabream (Sparu~aurataL.)feddietaryoxidizedoil:attenuationbydietaryvitaminE[J].Aquaculture,2 002,214:343—361. 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