【doc】补骨脂注射液对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响

【doc】补骨脂注射液对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响 补骨脂注射液对体外培养大鼠成骨细胞增 殖的影响 ? 6?(总326)中医正骨2O04年6月第16卷第6期 补骨脂注射液对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响 广州中医药大学(510405) 林举择陈升恺罗家栋 提要为研究补骨脂对体外成骨细胞增殖的影响.以出生24h以内的wistar大鼠为来源,酶消化法分离培养新生大鼠颅盖骨成 骨细胞,胰蛋白酶消化后,传代培养大鼠成骨细胞;取一定量接种于24孔培养板细胞贴壁后,分成实验组1.5与空白对照组,分别 用含补骨脂注射液5%,12.5%,25%,50%,100%,0%的DMEM培养基进行培养,连续观察7天,绘制细胞生长曲线;另取一定量 接种于96孔培养板,分组及加入培养基同上,MTr法观察细胞存活和增殖能力.结果显示原代成骨细胞逐渐形成成纤维细胞集 落,有成纤维细胞型表现;传代成骨细胞逐渐被细胞分泌的基质所包埋,形成钙化.补骨脂对新生大鼠成骨细胞的增殖有显着促 进作用.表明利用胰酶消化法可以分离培养出纯度高,数量较多且培养时问明显缩短的成骨细胞.补骨脂抗骨质疏松的作用与 其增加成骨细胞的数量和促进成骨细胞的增殖能力有关. 主题词骨质疏松症/中医药补骨脂/治疗应用成骨细胞/生理学实验研究动物大鼠 中国分类号:R336文献标识码:A文章编号:1001.6o~5(2oo4)o6-ooo6-o2 中药补骨脂为豆科植物补骨脂PsoraleaeorylifoliaL.的干 燥成熟果实,有补肾壮阳,温脾止泻之功效.据文献报道,补 肾方药可以提高LMP-1在骨骼的表达,从而促进成骨细胞的 分化Ll】.从补骨脂的现代药理研究来看,补骨脂的主要化学 成分是香豆素类和黄酮类化合物L2],此外还含有植物雌激素 类物质和Ca,P,Zn,Mn等微量元素【引.黄酮类和雌激素在临 床及试验研究中都已被证实对骨质疏松症有肯定疗效.而 Zn,Mn等微量元素在体外条件下对成骨细胞的生长分化有明 显的促进作用l4J.本实验旨在通过分离和培养大鼠颅盖骨成 骨细胞,研究在体外环境下,补骨脂对新生大鼠颅盖骨成骨细 胞的作用,阐明了补骨脂防治骨质疏松的细胞学机理,为补骨 脂应用于临床防治骨质疏松提供实验依据. 1材料 1.1药物补骨脂注射液购自广东省中医院药理实验室,批 准文号:(99)穗卫医制(省)字第B-266号.规格:含药物补骨 脂1g?瑚l-.. 1.2动物出生24h内的W'mtar大鼠,由第一军医大学实验 动物中心提供. 1.3主要试剂和器材相差显微镜(Olympus),Bio-rad450型 酶联免疫检测仪(美国),培养板,DMEN培养基,Hepes粉(美 国Giboo),Triton-100,MTr,二甲亚矾(北京天象人),胎牛血清 (杭州四季青),胰蛋白酶,?型胶原酶(美国Sigm.). 2方法 2.1成骨细胞的获取与培养取出生24h以内的健康W'mtar 大鼠,无菌条件下取出颅盖骨,放入预冷的D-Hanks液中,去 除附着的脂肪,脑组织及结缔组织.用剪刀将颅盖骨充分剪 碎至1n大小.加入0.25%的胰蛋自酶消化10min,吸除消 化酶,以去除颅骨表面的结缔组织及成纤维细胞成分.加入 混合消化液(含0.1%的?型胶原酶和0.25%的胰蛋白酶)消 化4—5次,每次15rain,收集每次的消化液,加入含胎牛血清 (f1Bs)的DMEM培养基终止消化.500r离心10min,沉淀即为 12003级研究生 所得的成骨细胞.弃上清,加入完全培养基(含15%}-'BS的 DMEM培养基),反复吹打,制成单细胞悬液.计数后以每升 105个细胞的密度,接种与培养瓶中,放于37~C,饱和湿度,co2 分压5%的细胞培养箱中进行培养.待细胞长满培养瓶底后, 吸出培养基,用0.25%的胰蛋白酶消化,进行传代培养.细胞 培养过程中,在倒置显微镜下进行活体观察,隔日换液. 2.2成骨细胞生长曲线的绘制取传至第3代的成骨细胞, 消化后制成单细胞悬液,以每升105个细胞的密度接种于2,4 孔板中,每孔加入含15%FBS的培养基lml,在37oC,5%co2 及饱和湿度条件下培养.24h细胞完全贴壁吸去培养基,分别 用含补骨脂注射液0%,5%,12.5%,25%,50%的DMEM培养 基和100%的补骨脂注射液进行培养,每组3孔.3天后消化 细胞进行计数. 2.3MTr法测定补骨脂对大鼠成骨细胞增殖的影响将传 至第3代的细胞以每孔5x个细胞的密度接种于96孔培 养液中,每孔加入含15%FBS的培养基2oota,在37oC,5%co2 及饱和湿度条件下培养.24h细胞完全贴壁吸去培养基,分别 用含补骨脂注射液0%,5%,12.5%,25%,5o%的DMEM培养 基和100%的补骨脂注射液进行培养,每组3孔.于第3天用 1WIT法分析成骨细胞的存活和增殖能力. 2.4统计学分析数据以均数?标准差(?s)表示,应用 SPSS统计软件进行方差分析. 3结果 3.1成骨细胞的培养与观察原代成骨细胞接种后8h开始 变形,延展,24h完全贴壁,随后开始进行分裂增殖,并向几种 细胞形态分化:?成纤维细胞样细胞:细胞呈梭形并带有多个 长的胞浆突起,细胞核较大,扁圆形,可见1—2个核仁.?不 定型细胞样细胞:细胞不规则形态多样,胞体大,胞核为圆形 或椭圆型,有多个核仁,有部分不规则细胞的胞浆向不同方向 伸出短小突起.5—8天后,细胞逐渐形态分散的细胞集落,其 形状与大小各不相同,多为成纤维型细胞形态,可称之为成纤 维细胞集落.10—12天后细胞集落问相互融合成单层,形成 多转化为梭形,为成纤维细胞型表现.传代成骨细胞一般情 中医正骨20O4年6月第16卷第6期(总327)-7 况下于4h开始贴壁,8—10h基本贴壁完全.细胞多向梭形细 胞,多角型细胞转化,带有敬个突起,突起的个数及形态各不 相同.培养10,12h后细胞融合成单层,随着培养时间的延 长,细胞形成多层细胞.并不发生细胞问的接触抑制现象(圈 1A,B),培养15h后,逐渐形成多个散在致密的岛状细胞结构. 其中的细胞结构变为蝮立方体.紧密排列,细胞周围被分泌物 包绕,分泌糖有高折射性的空泡及深色颗粒.此岛状细胞结 构逐渐被细胞分掘的基质所包埋.形成钙化(图1c). 固1传代培养的大鼠成骨细胞培养倒置显徽镜片 A.细胞形成曩蔫×100B.细胞呈梭形和不规划形x20O C.细胞呈多层生长.细瞻团内形成钙化xl0D 2.2大鼠成骨纲胞生长曲线传代培养的成骨细胞生长曲 线见圈2,由图中可见成骨细胞贴壁后即开始快速增殖.并维 持较长的时问,5天后开始减缓. 20 5 15 呈 10 三 螽5 基 暴0 01234567 圈2传代培养的大鼠成骨细胞生长曲线 2.3扑骨膳对大曩成骨细胞增殖的髟响如表1所示.补骨 脂在5%,50%浓度范围内,对太鼠成骨细胞的增殖有明显的 促进作用,且在这个范围随着剂量的增大,作用增强,说明 朴骨脂对大鼠成骨细胞的增殖作用具有量效性.在100%浓 度时对戚骨细胞的增殖有抑制作用,考虐到加入培养板孔中 的完全是补骨脂注射液,不台有D旧口培养基,可能是细胞缺 乏各种生长必要因子所致. 表1补骨脂对大鼠成骨细胞增殖的影响 注-与空白对照组相比.Pc0毗 4讨论 4.1研究概况骨质琬橙症是以骨量减少,骨微观结构退化 为特征的,使骨的脆性增加以及易发生骨折的一种全身性骨 骼痰病究其病机.主要与人体衰老而导致肌体骨吸收和骨 形成的平衡被打破有关,而骨形成和骨吸收主要由成骨细胞 和破骨细胞来完成成骨细胞分路骨基质(脏原和糖蛋白). 并参与骨基质及骨钙的代谢,是骨形成过程中的主要功能细 胞.所以促进成骨细胞的增值在骨质疏松症中有重大意义. 中医认为,肾主骨((幕问?宣明五气篇》),"肾生骨髓, 骨精充足,则骨髓生化有谭"((素问?应象大论)).朴骨脂为 朴肾助阳药物,其性辛,苦,太温,人肾经,可以温补肾用,温脾 止泻,通过朴肾益脾可以达到朴骨之功能从以往的文献来 看,前人只是研究了补骨脂对于体外培养的破骨细胞的髟 响J+缺乏补骨脂对于体外培养的成骨细胞作用的研究.因 此本实验选用补骨脂观察其对成骨细胞性骨形成的作用. 42研究方法本实验戚骨细胞的分离和培养方法是在文 献综合前人的细胞培养方法的基础上】,根据自己在细胞培 养实验过程中的不断摸索和经验总结.井结合客观的实验条 件,改良了前人的成骨细胞培养方法,诚项培养技术是以新生 24h内的Wistar大鼠颅盖骨为来源,以?型狡原酪和胰蛋白醇 分离成骨细胞.用台15%FBS的D删培养基培养绑施.遥 过形态学观察,发现传代成骨细胞在培养l5天后+逐渐形成 岛状细胞结构.该岛状细胞结构逐渐被细胞分泌的基质所包 埋.形成钙化.证明所培养的是成骨细胞.在培养传代成骨细 胞的过程中总结出谈法的关键是掌握好酶的甩量及消化时 间.否则可能引起细胞的损伤,失去一些膜受体,影响细胞的 功能及实验的结果,诫法的优点是培养出的成骨细胞受污染 小.纯度高,细胞分离量多,易于满足实验要求,同时还具有检 测灵敏度高等优点,值得在科研和临床研究中推广应用. 4.3结论分析由实验的结果来看,传代培养的太鼠成骨细 胞在第3天贴壁后即开始快速增殖,进入对数增长期.显示出 旺盛的生命力.同时,用M'IT法分析补骨脂对大鼠戚骨细胞 增殖的影响,发现朴骨脂注射液在5%,50%浓度范围内作用 具有量效性,能明显促进太鼠戚骨细胞增殖,与空白对照组 (0%)相比具有显着性差异,在本次研究中发现50%浓度的补 骨脂注射液对促进骨细胞的增殖作用最强.由奉实验结果可 推测扑骨脂对成骨细胞的功能有促进作用,进而促进骨的形 成,而且这种促进作用与补骨脂的浓度有关,可以推测这种与 浓度相关的作用是与其作用机理相联系的.本实验通过研究 朴骨脂对大鼠成骨细胞的增殖的影响.从一个方面阐述了补 骨脂抗骨质疏橙的细胞学基础,为补骨脂应用于临床治疗骨 质疏橙提供了理论依据. 5参考文献 l刘索彩.李桃.李恩.朴舒膏药对骨质疏船太鼠骨中12M矿化蛋白 表玷的影响中国骨厦蘸按杂志2001;7(1):72 2吕娲.林末湃,季仲然.补骨脂的化学成分厦药理作甩研究进展. 沈阳葑科大学1996;13(3):220 3黄剑.赵陆华.郜巧根.等.朴骨睹化学成分及蓟理研究进展.骑 学进展20?;(4):212 4刘秀明,王淑云.李锐,等.微量元素对太鼠厦盏成骨细胞样细胞 体外培养增值分化的影响.中华骨科杂志1995;15(3):177 5张稠荃.史风芹,庞教珍.等.朴骨措对分离硅骨细胞作甩的研究. 现代口腔医学杂志199519(3):136 6捌粗锥.峨鸿声.破阳跃平新生大鼠舸骨成骨性缅臆律外生长过 程研究解占l『1~95;26(2):157 (2003-12-05牧稿2~4-04-23修回)