银杏叶提取物对局灶性脑缺血大鼠脑组织炎症信号TLR4表达的影响

银杏叶提取物对局灶性脑缺血大鼠脑组织炎症信号TLR4表达的影响 .. 银杏叶提取物对局灶性脑缺血大鼠脑组织 炎症信号TLR4表达的影响 【摘要】 目的 观察银杏叶提取物对局灶性脑缺血(FCI)大鼠脑组织Toll样受体4基因(TLR4)、蛋白表达的作用。 参照Longa等方法制造FCI大鼠模型，将60只Wistar雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、和银杏叶提取物组，分别采用RTPCR法及免疫组化法检测缺血灶周围脑组织TLR4基因、蛋白表达水平。结果 模型组TLR4基因相对表达均明显高于假手术组(P<0.01) ;银杏叶提取物组TLR4相对表达量明显低于模型组(P<0.01) ;TLR4蛋白表达类似于基因相对表达。结论 模型组大鼠缺血灶周围脑组织TLR4基因高表达，银杏叶提取物对TLR4表达有抑制作用，这可能是其抗炎作用的机制之一。 【关键词】 银杏叶提取物;脑梗死;大鼠;Toll样受体4 脑血管病是临床常见病、多发病之一，尤其脑梗死(CI)具有较高的发生率、致残率、病死率，CI后缺血损伤的机制复杂，其中过度的炎症免疫反应存在于CI后坏死及缺血区域，导致炎性损伤，此已成共识，因此减轻炎症损伤成为治疗急性脑梗死(ACI)的主要途径之一，研究证实TLR4与非生物性炎性损伤关系密切〔1，2〕。银杏叶味甘、苦、涩，性平，有敛肺、平喘、活血化瘀、止痛功效，其主要有效成分银杏叶提取物(GBE)已被广泛应用于脑血管疾病〔3〕、认知功能障碍〔4〕、炎症〔5〕等相关疾病的治疗，但其对CI的研究鲜有报道。本实验观察银杏叶提取物对CI大鼠脑组织TLR4基因及蛋白表达的影响，探讨银杏叶提取物抗CI的可能作用。 .. .. 1 材料与方法 1.1 动物与试剂 健康雄性Wistar大鼠60只，300,350 g，由吉林大大学动物实验中心提供〔许可证号DK04032007〕，清洁级。银杏叶提取物为河北石家庄神威药业有限公司生产的舒血宁注射液，5 ml/支，折合银杏叶提取物为17.5 mg。NAR ISH IGE SR6N脑立体定向仪(日本);电子天平(日本AND HR120，精确度为0.1 mg);RTPCR相关试剂(美国Promeg公司);引物合成(上海生工生物工程技术服务有限公司合成);PCR扩增仪(德国Eppendorf，Mastercycler gradient);低温离心机(德国Eppendorf，Centrifuge 5417R)，凝胶成像分析系统(SYNGENE)。 1.2 实验方法 将60只大鼠随机分为:假手术组，模型组和银杏叶提取物组。每组又分为6、12、24和48 h，4个亚组，每亚组均为5只大鼠。假手术组大鼠不插线，模型组及银杏叶提取物组线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉闭塞的动物模型。各组均为腹腔给药，将药物以蒸馏水制成相同浓度混悬液(40 mg/ml)，模型组及假手术组均给予1 ml生理盐水，于手术完毕后3 h给药1次，之后每天1次，直至相应时间点处死动物，取前囟前2 mm至前囟后3 mm脑组织，以进针点为界分为前后两部分，前部分取梗死灶周围脑组织，快速称取100 mg，置于冰浴中的匀浆器并迅速匀浆，用于抽提总RNA。后部分脑组织用4%多聚甲醛固定液固定，4?下持续固定24,48 h后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，在切片机上连续冠状切片，片厚5 μm，-20?保存。 1.3 RTPCR检测血肿周围脑组织TLR4 mRNA的表达 1.3.1 梗死灶周围脑组织总RNA抽提与纯化 在冰浴匀浆器中加入1 .. .. ml Trizol及100 mg组织，迅速研磨，将匀浆液装于EP管中，加入200 μl氯仿剧烈震摇30 s，间隔放冰盒保温，反复震荡， 4?， 12 000 r /min，低温离心20 min，取上层水相转移至另一EP 管中，加等体积的异丙醇，轻轻混匀，-20?过夜， 4?， 12 000 r/min，低温离心20 min，弃上清，加75%乙醇700 μl轻轻混匀，4?，12 000 r/min，低温离心10 min，轻轻吸出上清，室温垂直放置20,30 min凉干，加入DEPC水20 μl溶解，留取1 μl待测RNA浓度。 1.3.2 逆转录(RT合成第1条链cDNA) 在PCR管中建立如下反应体系:依次加入如下试剂: 5×RT缓冲液5 μl、dNTP (10 mmol/L) 2.5 μl、Rnasin 1 μl、Primer 1 μl、M2MLV 1 μl，RNA及DECP水总共14.5 μl。短暂离心?振荡混匀?4?低温短暂离心;在PCR仪中，37?反转录50 min，95? 5 min灭活反转录酶，立即冰浴，-20?保存。 1.3.3 聚合酶链式反应(PCR)TLR4引物的设计 GenBank中查到TLR4序列号为( #AF057025)，用Gene Toll软件设计TLR4上游引物为5′GCC GGA AAG TTA TTG TGG TGG T3′(2 442,2 463)，下游引物为5′ ATG GGT TTTAGG CGC AGA GTT T3′(2 776,2 795)，PCR反应条件为预变性95?×2 min后，变性95?×40 s，退火52?×40 s,延伸72?×1 min，35个循环后72?延伸10 min，PCR产物为356 bp。内参照βactin引物序列为:上游5′GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA3′，下游5′GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG3′，扩增产物为375 bp。PCR反应条件:预变性95?×2 min后，变性95?×30 s,退火52?×30 s，延伸72?×40 s; 35个循环后，最后延伸72?×5 min。 .. .. 1.4 PCR产物的电泳鉴定 各样品PCR产物5 μl(βactin 5 μl)加于2%琼脂糖凝胶电泳槽齿孔中，取PCR标准同时电泳，作为标准分子量参照。1×TBE 50 V恒压电泳40,60 min，取胶置凝胶成像系统中，紫外光下拍照，结果扫入电脑备处理。 1.5 免疫组化染色 免疫组化染色采用SABC法，石蜡切片经常规脱蜡，梯度酒精浸泡后充分水洗，置于3%H2O2/甲醛溶液中15 min，以消除内源性过氧化物酶活性，浸入0.01 mol/L、pH6.0枸橼酸盐缓液中，加热至92,98?热修复抗原， 20 min后冷却至室温，0.01 mol PBS(pH 6.0) 振洗5 min×3次，正常山羊血清封闭液孵育30 min。滴加兔抗鼠TLR4多克隆抗体(1?400)， 4?孵育过夜。0.01 molPBS(pH 6.0)振洗5 min×3次，滴加辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗，37 ?孵育45 min。吸去二抗，0.01 mol PBS(pH 6.0)振洗5 min×3次;加入辣根酶标记链酶卵白素工作液，37?孵育30 min。0.01 mol PBS (pH 6.0)振洗5 min×3次，DAB显色，适时终止反应;苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察。阴性对照以PBS代替一抗。 1.6 统计学处理 数据均以x?s表示，组间比较运用单因素方差分析，两两比较运用q检验，所有数据用SAS软件处理。 2 结 果 2.1 各组脑组织TLR4 mRNA相对表达 各组各时间点TLR4 mRNA 均表达，与假手术组相比模型组各时间点TLR4mRNA相对表达均明显升高，且在24 h达高峰，持续到48 h差异有统计学意义(P<0.01) ;银杏叶提取物组TLR4 mRNA相对表达明显低于模型组(P<0.01)，见表1，图1。 .. .. 表1 各组大鼠脑组织TLR4 mRNA相对表达水平的比较 1)与模型组比较，2)与6，12 h组比较:均P<0.01，下表同 图1 各组大鼠脑组织TLR4 mRNA表达 2.2 各组大鼠脑组织TLR4蛋白的表达 假手术组各时间点偶有TLR4少量表达;TLR4表达以小胶质细胞为主，位于细胞胞浆内。模型组在观察的时间段内6、12、24及48 h TLR4蛋白表达明显增多，于缺血后24 h达高峰，持续大约48 h。银杏叶提取物组TLR4蛋白相对表达明显低于模型组(P<0.01)，见表2。表2 各组大鼠脑组织TLR4蛋白的表达 3 讨 论 银杏叶提取物抗炎、抗氧化及免疫调节作用正逐渐受到重视。脑缺血损伤见于许多临床病理过程，影响这一过程的因素是多方面的。一般认为，脑缺血损伤是典型的非感染性炎症损伤，氧自由基产生、炎症介质释放是其重要机制。然而，在临床试验中抗炎治疗并没有效果，或许这些药物抑制炎症通路的效果有限。长期以来对炎症发生机制缺乏清晰的认识妨碍了人们对炎性细胞因子在脑缺血损伤中的作用给出合理的解释。 近年认为TLR4在非生物性炎症损伤中起重要作用〔1，2〕。TLR4的结构及其参与促炎反应、促进免疫细胞成熟分化及调节免疫应答等方面研究的较为清楚。目前已证实人和鼠脑内有众多的TLR4表达〔6〕，TLR4广泛分布脑室周围血管丛，小胶质细胞，星形胶质细胞，脑内血管平滑肌细胞和内皮细胞也表达TLR4 mRNA。多种PAMP如肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸(LTA)和脂蛋白以及氧应激，氧自由基等均可激活TLR4，最终引起TNFα，ILs等前炎症因子的激活，导致多种炎症因子的瀑链式释放而产生生物学效 .. .. 应。TLRs家族不仅识别外源性微生物，而且识别内源性有害物质〔7〕，如 参与调节机体对坏死细胞、热休克蛋白、细胞外基质降解产物等的应答。 最近研究证实〔8，9〕TLR4在诱导的中枢神经损伤中发挥着关键作用，小 胶质细胞是损伤介质的主要来源。TLR4作为炎性跨膜受体在感染性疾病研 究领域中已是热点。 本研究中假手术组各时间点TRL4 mRNA相对表达变化无差异,模型 组6、12、24、48 hTLR4 mRNA相对表达明显增多，于缺血后24 h达高峰， 并持续到48 h，与模型组比较银杏叶提取物组能显著降低脑出血大鼠TLR4 mRNA的相对表达，TLR4蛋白表达类似于基因表达。由此可以推断，局灶 性脑缺血后损伤组织释放的内源性激活物被TLR4识别后，启动了TLR4的 信号传导通路，并进一步激活NFκB而释放致炎细胞因子而造成组织损 伤。而银杏叶提取物可以降低TLR4基因、蛋白的表达，从而抑制之后一 系列瀑布式炎症损伤，并最终减轻脑水肿，而其具体机制尚需进一步的实 验研究。 【参考文献】 1 Li C，Ha T，Kelley J,et al.Modulating Tolllike receptor mediated signaling by (1?3)betaDglucan rapidly induces cardioprotection〔J〕. Cardiovasc Res，2004;61 (3):53847. 2 Cao CX，Yang QW，LV FL,et al.Reduced cerebral ischemiareperfusion injury in Tolllike receptor 4 deficient mice 〕.Biochem Biophys Res Commun，2007;353(2):50914. 〔J 3 Wayne MC，Lisa GR，Nikola SI,et al.Efficacy of antioxidant .. .. therapies in transient focal ischemia in mice〔J〕.Stroke， 2001;32(4):10004. 4 Yong FW，Lei W，Jing W,et al.The in vivo synaptic plasticity mechanism of Egb 761 induced enhancement of spatial learning and memory in aged rats〔J〕.Br J Pharmacol，2006;148(2):14753. 5 Biddlestone L，Corbett AD，Dolan S.Oral administration of Ginkgo biolba extract，Egb 761 inhibits thermal hyperalgesia in rodent models of inflammatory and postsurgical pain〔J〕.Br J Pharmacol，2007;151(2):28591. 6 Tammy K.Tolllike receptors in central nervous system glial inflammation and homeostasis〔J〕.J Neurosci Res，2006;83(5):711 30. 7 BEG AA.Endogenous ligands of Tolllike receptors: implications for regulating inflammatory and responses〔J〕.Trends Immunol，2002;23(11):50912. 8 Laflamme N，Echchannaoui H，Landmann R,et al.Cooperation between Tolllike receptor2 and 4 in the brain of mice challenged with cellwall components derived from gramnegative and gram positive bacteria〔J〕. Eur J Immunol，2003;33(8):112738. 9 Bsibsi M，Ravid R，Gveric D,et al.Broad expression of Toll like receptors in the human central nervous system〔J〕.J Neuropathol Exp Neurol，2002;61(11):101321. .. .. ..