远志资源与品质评价研究（可编辑）

远志资源与品质评价研究（可编辑） 成都中医药大学 博士学位 远志资源与品质评价研究 姓名:王光志 申请学位级别:博士 专业:中药学 指导教师:万德光 20060401 摘要 // .或卵叶远志 远志为远志科植物远志 .的干燥根,。系常用中药。现代研究证明远志具有镇咳祛痰、镇静催眠、降 压、 随着野生药材 改善脑功能、促进体力和智力、抗炎、抗诱变等作用,临床应用较广。 资源的过度采挖,资源量不断下降,在山西、陕西等省已开始远志的人工种 植。为保护 和合理利用远志资源,需要开展远志资源的综合研究以及远志野生、家种药 材、远志饮 片的综合品质评价。 通过系统的本草考证,阐明了远志古今用药的一致性,产地分布的变迁以及 道地性; 总结了远志的性效、配伍禁忌以及古今炮制方法的沿革与变迁。 通过标本和相关文献查阅,以及我们实地采集调查的结果,总结出全国远志属药用 品种共有种;川渝地区药用品种共有种变种;对远志属民族药药用资源做了整理 研究,总结出远志属共有种植物在个少数民族地区使用。 首次对远志生长的地理气候因子、土壤营养元素与远志酸含量关系做了研究,初步 明确了影响远志酸含量的主要气候因子是年日照时数和无霜期,土壤因子是有效磷及水 分含量;对远志产区做了调查及实验研究,结合本草学考证,对远志的栽培适宜区做了 区划研究,为远志的合理栽培提供科学依据。 首次建立了远志及卵叶远志的和反应扩增体系,并在此基础上首次对 远志及卵叶远志的遗传多样性做了及研究,并进行了遗传关系聚类分析。 以远志酸含量为指标,采用法,对野生、栽培及商品远志进行了质量评价, 发现远志商品药材远志酸含量在.%~.%,甘草制远志饮片远志酸含量在. %~.%,蜜远志远志酸含量在.%~.%;发现陕西、山西及四川野生远志远 志酸含量较高,甘肃庆阳产者最低;山西沁源产栽培远志酸含量最高,为.%,其次 为山西汾阳、山西繁峙和陕西韩城,分别是.%、.%和.%:以甘肃镇原产者 含量最低,为.%。 以远志酸含量和醇浸出物为指标,结合药效学实验,首次对不同方法炮制的 远志饮 片有效成分含量、炮制、炮制前后药效学变化进行了综合评价,为远志 药材的综合 利用与远志饮片的临床应用、饮片规范化生产以及质量标准化、国际化奠定 基础。 炮制;药效学 关键词: 远志:本草考证;中药资源;;;土壤;; . . . ,, . , . . ,,, ., ?.也、 ., .. 户.’ , /, . . .. . . .’ . , . .. . . , ,.,.,.... :.. .. , . , . ,. , . . . , . .: : .;;;; ;;格目录 ? 表中国远志属药用植物种类及地理分布?一 表川渝地区远志属药用种类、分布及药用情况表远志属植物民族药应用概 况??.. ? 。表远志不同生长地气候因子一览. 表各影响因子相关系数, 表?主要影响因子表??. . 衰远志不同生长地土样, . 表.远志不同产地的土壤养分含量?.. . 表各影响因子相关系数. . 表土壤营养元素对远志酸含量影响的因子分析. 表远志及卵叶远志材料来源? 表 反应体系...??. 表远志及卵叶远志引物及多态性. 表远志及卵叶远志欧氏不相似系数平方矩阵. 表初步反应体系 一肿舶胛舯?御埘?珊瑚 表与各引物退火温度设计?..?. 衰.筛选的引物退火温度 . 表 标准反应体系.? 表各引物扩增产物多态性分析袭?不同居群远志及卵叶远志标记距离系数矩 阵?. 表一】不同野生产地远志及卵叶远志药材来源?. 表不同提取方去对测定结果影响?.. . 表?不同提取时间远志酸含量比较??. . 表不同酸浓度水解远志酸含量比较? . 表不同酸水解时间远志酸含量比较?. . 表?远志酸质量与峰面积吸收度积分值. 彤埘那川也舵 表对照品精密度试验?. . 表?供试品精密度试验.?.??.. ’ 表?供试品稳定性试验?. . 表供试品重复性试验.. . 表一加样回收试验??. . 袭?不同地区野生远志远志酸含量比较??.. .?州埘斛粥 表不同栽培产地远志材料来源. ... 表不同栽培产地远志酸含量比较.,. 表.不同地区商品远志药材来源. ... 表不同地区远志商品药材远志酸含量测定结果??。??. ?. ? ? ? . ? . . ? ’ 表?不同方法炮制远志浸出物含量比较?. . ? ? ? . . ? ? 表 不同炮制方法远志浸出物古量方差分析??.. . ? ? ? ? ? . . ? ‘ 表.不同炮制方法对远志酸含量的影响, ? ? . . ? . ‘ 表.不同炮制方法远志酸含量方差分析?. ? ? ? ? . . . ‘ 表.蜜远志艺正交设计因素一水平表?... . ? . ? , ? ? 表. 正交试验安捧及结果?... . ? ? ? ? . ? . ‘ 表总皂苷含量方差分析衷.. . ? ? ? ? . . 表. .征:交试验安排及结果??. . ? ? ? ? . . ? 表.远志酸含量方差分析表?.??.??. . ? , ? ? ? . . ? 表.验证实验结果一, , ? ? ? . . ? . 表?葡萄糖线性关系考察一 ? , ? , . ? . . 表,精密度实验结果 ? ? . ? . . 一 表稳定性实验结果?.. , ? .? ? . 一 表.加样回收实验?.. ? ? ? . ? . . ? . 表蜜炙样品葡萄糖含黉测定结果? ? ? . . ? . ? 表.实验用药品及试剂一览.??... . ? ? . ? . 表?对小鼠镇咳作用的影响.. . ? , . ? . . 表.远志、蜜远志、制远志对小鼠器官段酚红排泌的影响 . ? ? ? ? ? . . . 表?远志、制远志、蜜远志对小鼠自发活动的影响 ? ? ? ? ? 袁.远志、制远志、蜜远志对小鼠催眠潜伏时间的影响? ? ? ? ? ? ? . 一 表?远志,蜜远志对小鼠学习记忆的影响 ? ? ? ? ? ?? ?? 铭记舄铝铂铂铂卯卯船鲫曲?脚甜以??斛郇 彤研 ~~~~~一~~~~~一~~~~~~~~;; 表。不同炮制品对小鼠脑内单胺类神经递质含量影响??.图片目录 图本草著作中的远志图??,一 圈远志、卵叶原植物及其生境圈图中国远恚及卵叶远志分布图 圈远志适宜栽培地区划..??. 图.模板浓度的影响??.?.??:图. 矿浓度的影响图.引物浓度的影响?.?.??. 圈 酶用量筛选? 图 :浓度筛选??.?. 图远志及卵叶远志? 图?远志及卵叶远志引物的扩增结果?.??.. 圈.远志及卵叶远志遗传距离聚类图.. 图. 反应程序??.. 圈 模板浓度梯度 圈.】/:/蔓筛选??..??. 圈引物浓度筛选??.??. 圈. 浓度梯度..圈? 酶浓度梯度??. 圈. 引物及的退火温度电泳图谱??. 圈引物 扩增结果?.. 圈远志及卵叶远志不同居群标记遗传距离系数聚类结果图 图.远志皂苷及远志酸结构图.. 图.远志酸标准曲线图??.?,. 图远志酸对照品色谱图 圈样品色谱图.. 圈制远志、蜜远志炮制工艺路线图? 图一不同炮制方法远志酸色谱图?... 圈葡萄糖对照品溶液标准曲线?成都中医药大学博士学位论文 .』一?‘ 刖 墨 立依据 中药资源研究和品质评价研究仍是本世纪中药学研究的热门课题之一。中药作为生 物群落中的~个特殊群体,在生物多样性中也起着重要的作用,中药生物多样性也是中 药引种栽培、养殖、育种盼基础;中药资源关系着中药的生存与发展,同对也是重大的 环境生态闻鼹, 中药资源的持续繁衢生长与其所处的环境密不可分,环境养育中药,而中药同时又 可改造环境。中药的质最和产量除自身的种质因素外,更多的与其所处的气候、土壤以 及栽培技术等环境因素相关:优良的种质资源是长期自然选择和人工选择的宪美产物, 具有自身独特的优良特性,燕人类宝贵舞孝富豹晶质改良的源泉,燕形成优质药材豹内在 因素,薅适宜的生长环境和成熟的栽培技术对栽培药毒孝砸京是形成优质药材必不可 少的外在条件。 中药品质韵详价方法和认定模式也是随着科学技术水平的进步和中医药的发展而 不断发展豹。现代多学辩多种分析手段豹综合应用,使中药品质评价方法和模式有了缀 大的飞跃。中药的品质评价应该是一个综合的模式,应该是中药材及其饮片的综台,对 饮片进行炮制工艺和质景标准规蒲化研究,将对饮片质量的保证,规范化生产以及临床 用药的安全、有效产生深远影响。 远志 为远志科植物远恚 妇聃. 鼓卵叶远志寥 .的干燥根,系常用中莼。其性澡,昧萋辛,归心、肾、脾经, 具有安神益锂、祛痰、消肿的功效。现代研究证明远志能够镇咳祛痰、镇静催眠、降压、 改善脑功能、促邀体力和智力、抗炎、抗诱变等作用。临床常用于心肾不交引起的失眠 多梦、健忘惊悸、神志恍惚、咯痰不爽、疮疡肿毒、乳房肿痛等瘢。近年来由于需求量 的与目侯增,野生药材被大量采挖,远恚资源量不叛减少,有些种鑫娃子濒熊状态。由 于野生药材资源的日盏稀少,在山西、内蒙、陕霹、河等省开始远志的人工种植。 目前缺乏远志资源、质凝及其地理气候背景的系统研究,缺乏遗传多样性研究。对 现有远志的资源野生及栽培种类、分布进行调查,研究其生物学特性、遗传多样性 帮地理背景系统,结合药材质量综合评价,可为运志资源的保护利用研究、优良种质资 源的发现和可持续发展奠定基础。远惠资源与品质评价研究 远志饮片作为中药的重要组成部分和远志的主臻商品规格,广溅应用于版院药房及 中艨药生产中,直接关系到孛莓配方或制裁鼹瞧疼疗效与安全。窭懿获乏远恋铰片憋到 工麓和质壁标准规范化研究。对不间方法炮制的远虑饮片进行质量比较,规 范炮制工艺 和璇量标溅,进行饮冀矮爨控制方法硬究,将对远恚饮冀懋露工艺秘震量标难褒范识瓣 建溉提供科学依据。 茬导烬万德毙教授番摆鹣矮器“耱孛药饮蔑迩裁矮蓬恁磷究一邋忐谈片嫩裁 工慧及质量标准规藏化研究”的支持下,进行了远志属植物的分类、翡用资源调查研究: 对遮恚及雾跨远恚遴厅了生态环壤努橱,憨溪气嫉、圭壤激投生鐾学耨薤分褥,产送及 适窟区研究,分子标记研究:对远志药材及饮片进行了系统的质量评价,对饮片 进符了逡联正艺援藏铯骚究鞠震鬟较鑫方法瓣醑究。 生要研究内蜜 对远志的蕊用历史与名称记载、品瓣、产她分奄岛遭遮搜、性效、 配伍禁 忌、采收加工与炮制辞方面做了本革考证,阐明了远虑古今用药的一致性,产地分布的 变迁以及道遮性;总结了远杰的性效、配侵禁忌以及古今炮剿方法蛇沿革与变迁。 对全国以及川渝蛾区远态属药用资源做了调查研究,对远忠属民胰药药用资 滚做了整理研究,慧结了远患属的努露概撼。 荫次对远志的生长习性、生态群藩、地理气候因子、土壤髂养元紫、产区做 了调查及蜜验研究,褥出影响远恚瓷效盛分愈量的溉淫气嫉隗予窝主壤嚣予; 黠透悫懿 栽培适宜送做了区划研究,为远志的合理栽培提供科学依据。 对不同居攒的远惑及襄时远志傲了及分子标记疆变,兹次建立了 远虑的提取方法和远志、反应和扩增体系,分析了不同居群远志的亲 缘哭系和弓锈敦多;熬性。 对野生、栽培及商品远志药材做了质量评价:对不同方法炮制的远志饮片有 效威分含量傲了鞋:较;萤次瓣蜜远惑避行了炮制工慧援范豫磅究,黪选窭钱绽麴憝翻工 艺;首次进行了蜜远志饮片旗量控制方法研究;比较了远志饮片炮制前后药效学的变化, 阐述了彗摹铡与壅炙熬药效学差异。 成都中医药大学博士学位论文 .远志的本草学研究 .药用历史与名称记载 远志始载于《神农本草经》,列为上品,谓~名蔗菀,一名莫绕,一名细草”,谓“叶 名小草”,谓其“主咳遵伤中,补不足,除邪气,利九窍,益智慧,耳聪目明,不忘,倍 力,久服轻身不老】”。《本草经》引《尔雅》:“姜绕,藤菟”,郭注云:“今远志也,似 麻黄,赤华,叶锐而黄,其上名小草”;引《说文》:“甍,棘菟也。”;引《广雅》:“棘 菟,远志也,其上谓之小草口’’。宋.《证类本草》谓:“远志??一名棘菟,一名萎绕, 一名细革”并认为“今医但用远志,稀用小草【】”。说明远志药用部分一直为根。《本草纲 目》【载:“细革,燕菟,蔓绕”,并认为“此草服之能益智强志,故有远志之称”,并引 《世说新语》:“谢安云:处则为远志,出则为小草”,可谓“远志”之名的最佳注释。明. 《本草品汇精要》载:“姜绕,棘菀,即远志也”,“其苗谓之小草【】’’。清.《植物名实图 考》载:“释《诗》者即以萎为远志【】’’。综上所述,历代本草均用“远志”之名,并沿用 至今。 .品种考证 《本草经集注》载“小革状似麻黄而青【】”:《唐本草》载“似麻黄,赤华,叶锐而黄, .《开宝本草》谓“茎叶似 其上谓之小草”。二者所述当为今远志 大青而小”;《本草图经》云:“根黄色,形如蒿根,苗名小草。状似麻黄而青,又如荜 豆,叶亦有似大青而小者。三月开花白色,根长及一尺。四月采根??泗州出者花红, 根、叶俱大于他处。商州者根又黑色。俗传夷门远志最佳。”从叶的大小、花之颜色可 知,当时使用的远志已绝非一种。《证类本草》:“今医但用远志,稀用小草例”。李时珍 谓:“远志有大叶、小叶两种。陶弘景所说者小叶也,马志所说者大叶也,大叶者花红口】。” 清.《植物名实图考》载:“《图经》载数种,所谓大青而小,三月开白花者,不知何处 产,今产太原者,与《救荒本草》图同,原图解州远志,不应与太原产迥异嘲”。又谓: “滇南产甜远志叶大,花黄,土人亦不以如剂,盖习用之品。药肆所采,较当时州郡图 上者可信也”、“甜远长生云南大华山。独很独茎,氏叶硫齿‘,按《滇南本草》【】图, 该甜远志可能是菊科还阳参属 .植物。此外,《滇南本草》载“苦远志”与“紫花 地丁”,前者又名“远志”,后者又名‘‘,、远志、地丁、瓜子金”,据调查,原植物均为远志 属植物苦远志 .,二 .远志资源与品质评价研究 图本草著作中的远志图 者效用与《滇南本草》所述亦基本相符,仅药用部分不同,前者使用根皮,产 于云 南巍山,当地俗称“远志肉”:而后者使用全草。 据以上描述与《本草图经》泗州远志、解州远志、威胜军远志、齐州远志和商州远 成都中医药大学博士学位论文 志以及《植物名实图考》记载的产地、形态描述和附图可知,古代药用远志来源已有多 种。其所说小时一种,与现今远志尸 基源一致;大叶一种,或为卵叶远 志 .。《滇南本草》所载“苦远志”与“紫花地丁”,系远志属植物苦远志 .,“甜远志”非远志属植物,可能是菊科还阳参属植物。 . .产地分布与道地性考证 《神农本革经》载:“生川谷【】”,记述了远志的生长环境。《名医别录》谓:“生太 山及冤句川谷”。《神农本草经集注》谓:“冤句县属兖州济阴郡,今犹从彭城北兰陵来。”, 说明远志最初来源于山东半岛一带。明代《本卿乘雅半偈》载:“覆日:出太山,及冤 句川谷。冤句属兖州济阴郡,今从彭城北兰陵来。河、陕、雒西州郡亦有之【。”《本草 图经》载:“远志,生泰山及冤句川谷,今河、陕、?西州郡亦有之”,并谓:“泗州出 者花红??商州者根又黑色。俗传夷门今河南开封一带远志最佳口。”清.《植物名 实图考》载:“今太原产者,与救荒本草图同,原图解州远志,不应与太原产迥异。” 综上,远志最初来源于山东半岛一带,以后逐渐在各地发现新的远志分布地,如现 今的河北、河南、山西、陕西等地,其中山西、陕西乃远志现在的主产区。就道地性而 言,古代本草以山西、河南为道地,今以山西、陕西的质量最好,产量最大。 .性效考证 《神农本草经》将远志列为上品,视为养生不老之药,谓“主咳逆伤中,补不足,除 邪气,利九窍,益智慧,耳聪目明,不忘,倍力,久服轻身不老【】,’。《药性论》载:“治 心神健忘,安魂魄,令人不迷,坚壮阳道,主梦邪”。《日华子》载:“主膈气,惊魇, 长肌肉,助筋骨,妇人血噤、失音,小儿客忤,服无忌。”《名医别录》谓:“主利丈 夫,定心气,止惊悸,益精、去心下膈气,皮肤中热,面目黄,久服好颜色,延年例” 《政类本草》载:“利丈夫,定心气,治惊悸,益精,去心下膈气,皮肤中热,面目黄【】” 《抱朴子》云:“久服令人有子。”缪希雍《本草经疏》谓:“痈疽皆从七情忧郁恼怒而 得,远志辛能散郁,并善豁痰口】”《本草经》:“《经》不言远志能化痰,而化痰甚 效,想亦开郁之效也【】”。清代《本草述钩元》谓:“味苦微辛,气温芳烈。苦波热,温 壮气,辛散郁,肾经气分药??治小便赤浊及肾积奔豕。又,远志酒治一切痈疽,奇效。 同枣仁茯神人参地黄丹砂,为镇心定惊要药。同人参柏仁枣仁麦冬五味归身益智茯苓神 生地甘草沉香,治心气弱,心血少,馁怯易悸,梦寐多魇,神不守舍,怔忡健忘,矢志, 阳痿; 同茯神人参白术炙草枣仁木香龙眼肉,能归脾益智;入当归六黄汤,治阴虚盗嚣恚蚤瓣鸯磊震详搿研究 浮。”,势逡述“逡悫独璇蕴蟹撼妖者,驭悉瀚黪孛乏动麟,蘑谓戮皆粥毽”。瀵《零 辇害利》:善疗瘸鸯,数服皆奇跏 憨缝上述文献,表鞠遮惠豹璇羧主要爨“盐酸犍痰?“安毒枣裁罄”、“镶势蠖眠气“益 精”、“鲻年益寿”以及“散郁消肿”等;主治健懑、失眠、惊簿、咳逆、癜痘等减。从 《零经》瓣鼗潦趱至今,逡恚动效发甥誉多,识斌世对避惑功效檄理豹认识阐 发暇多。 配缀禁憨 《种教本孳经》谓;“褥获苓、冬葵子、龙嚣菠,杀哭雄、尉予毒,鼹珍珠、螫蠊、 藜芦、舞蛤、蘩蓣,紫憩淹使,瓣瞽遂辩。” 《爨性论》藏:“远虑提辩蟥。”漓代《零 萆从新》载:“邋恚交通癜肾,辩滗补髅。虚面授滞者,蠲莽血补气药髑。资其鬣导, 臻予太鞠,不可多用独瞒;纯纛凭滞者糠”。《零荜害潮》载:“魄元补性,寝黼抉滞 赘,同葬斑、补气药用,交通心鹭,资其畿导,臻予太和。不可多用、独髑。纯嶷无潞 鬻,误服之,令入空洞懋心痛。熙心经褥实呋,成麓黄滤、生嘏赣,禁与参、簿扑随 气药河瘸也?”。” 。采牧加工与熄鹪 .采收 《波粪本擎》;“嚣冀袋鬏、津,戮予箨’;《鬻经本擎》;“瑟予麓”《零攀晶汇赣要》: “戮月取搬”、“穰麟丈者为好强 .,炮铺 适港的炮镥《始见于脊《刘涡子鬼遗露》,宥“去心”的记载。《嚣公炮炙谂》: 远 恚,旯镁,先嚣去心??去心了,溺熬髓革涵浸缮,漉磁,瀑予霜之墩”莽诀为“港不去 心,服之令人隅】”。求代有“妙”、?‘焙啉訇,‘蘩汁浸炒”、“酒浸,洗去心,酒涌蒸,炒 予渊”、‘‘去;&,剿洗,妙黉莨鼬、“去?洛,馨鼙煮予粕等,憋锱方法涨逡多襻豫。元 代又有“菱汁蘸潍,取岗焙】”、“去心,溺酒浸令透秘”;从聪代释始簸谁法开熬增多, 魏“罴驻营鼙同撩”、“蘩汁蘩溯”,‘镰耱淫煮逮髓干,掰蒌泞裁罄等。瀵哉添瘸意誊法, 又有“涞港浸洗,捶去心四~或髑炭”、“炙器补“簸水炒”等熄镶《方法。现代《全国中 蕊怒京攫藏》浚羧‘‘裁添悉“‘蜜逡恚”、“求遮恚”镣,《孛凌炮翻经验集或》毂毒“裁逡漆”、 “姜制”、“朱远怨”、‘渺选志”、“焦远志”、“遗惑炭?蜜邀志’,等喇。 综上,送惑粒逡剃秀法众多。“去心”慧个热工盼壤念;攀~熬“炒”、“焙”、“炙”“巷妒 蹩不加辅料炮制的方法;应露辚隼萼的炮制方法更多,翅“髓革煮”、“督革汤浸”、“婺炒”“姜成都中医药大学博士学位论文 汁淹”、“酒蒸”、“米泔”等;多种辅料炮制如以甘草、姜为辅料,甘草、黑豆、姜为辅料, 猪胆汁、姜为辅料等。发展到现代,以甘草制、蜜炙为多,多种辅料炮制的方法已不用。 .小结 通过用历史与名称、品种的考证,说明远志类药材品种较多,但远志古今甩药品种 一致,均为远志 与卵叶远志. .的干燥根:其最初来源于山东 半岛一带,后来逐渐在各地发现新的分布地,但是古本草以山西、河南产者为道地。远 志主要有“止咳化痰”、“安神益智”、“镇静催眠”、“益精”、“延年益寿”以及“散郁消 肿”等功效;主治健忘、失眠、惊悸、咳逆、痈疽等症;在配伍应用时不宜与天雄、附 子、珍珠、蜚蠊、藜芦、齐蛤、薯蓣、甘遂等药公用。历代炮制方法众多,有不加辅料、 用单一辅料或者用多种辅料炮制的不同,发展到现代,以甘草制、蜜炙为多,多种辅料 炮制的方法已不用。 远志资源调查研究 中药资源是中药的载体,关系着中药的生存与发展,对中药资源的种类、药用情况 调查整理,可为中药资源生产规划的制定和合理开发提供依据。本文对全国、 川渝地区 以及民族地区远志属药用植物的种类及药用情况做了调查整理,为远志资源的利用提供 参考。 .远志属植物的分类 ..分类历史及分布 远志属“”一诃来源于希腊文‘”和“”,为“多乳汁 .为模式种建立的属,发表在他的 的”意思。该属是.于年以. 名著《 》中,当时有共种‘】。目前认为远志属植物有~ 种,广布于全世界,在新西兰太平洋南部岛国、玻利尼西亚以及北极地区无分布。 。 据统计国产远志属有种变种,分布于全国各地,主要分布在西南和华南 ..远志属植物的分类】 根据该属植物的花、果实、种子、种阜及花粉粒的形态特以及现代文献研究,国产远志资源与品质评价研究 远志属区分为个亚属和四个组: 黄杨远志亚属.....荷包山桂花组.. .. :.长毛籽组 小扁豆亚属.. . .., ..,.岩生远志组.. .. ..: 小扁豆组.. 远志亚属...远志组.. 《中国植物志》收有种变种。 .药用资源应用概况 。.远志的药用概况 远志属药用植物在全国不同地区应用相当广泛。《中国药典》版一部以远志 矗和卵叶远志 .作为法定药用品种。本文通过对《中国 药典》、云南、广西、湖南等地方标准?以及相关文献和标本的查阅,结合作 者 先后在四川、陕西、甘肃等地的调查采集结果,对我国远志属药用植物种类 及药用情况 做了调查研究。通过整理,我们发现远志属药用的共有种。见表。在国外, 远志 属药用以美远志为多,已有数百年历史,在美国处方集..第十版、英 国副药典..年版、日本药局方第八改正版和前苏联药典第八版均有 收载,功效与远志现同。 表中国远志属药用植物种类及地理分布 上咳、平喘、清热 鄂、粤、桂、川、根 尾叶远志 毛籽山桂花云南, . 乌棒子、野桂花广西贵、云 型里:望塑?一 疗疳积 肾果小扁豆 叉枝远志 广西、贵、云全草 兰生竺塑垦婴堡 堕 一一 曲江远志 一包花、红花倒水莲湘、粤、桂 全姜生堕塑壁。堕望 一成都中医药大学博士学位论文 密花远虑 辟树根、多花远志、罗云南东南部及南根 用于跌打损伤,身 ??整竺垫篓墅壁塑登 熙墨查::璺垄墨煎塑 整塞殛:壁垒一~ 小叶密艳远志 广磁、云南、西根 祛风散漫、舒筋活 产 藏 血 ,融髓..? 长毛籽远志 磷南远志广西,山鄂、赣、湘、桂、根 活血、滋补强壮、 尹 缝琵遥列、大麓器川、云 努经数蛊 黄山桂嚣南 一耍查墅塑墅缎望墨曼憋壁:~???? 小花远惠 细牛草、七寸金广东苏、浙、皖、赣、全革 活盘教瘀、纯痰止 “,” 堕:鲣童塑墅 生璺:壁丛一 嚣凑近惠 蟪纯生、猪夫殛疆 弼、蠹、云、藏穰 联气健痰、活纛丘 户 川,娘母照佤语 ??一堕:处:堂室塑~ 华毒远卷 瘸鬏蕈、锻不换广鞭 闽、挂、粤、云、垒攀渍热鳃毒、援搬潢 . ‖ 业 塑焦壅些堕 香港远虑 江磷、湖南、广全擎活血、解毒、他痰 狭叶香港远志 ???.???~?????????????????:??????????????????????????一 苏、皖、浙、 赣、全革 益智安神、化痰。 尹泰. 麓、粤 澧蠡孛数瘀 新疆远志 远子新聪 新疆 全草 化痰利窍、安神益 塑煎壁生塑 ?一土?丝翟塑望曼二~~?一~ 蕊子金 小时造?擎巍汪, 华东、华南、华全攀 谈嚷亿痰、活斑正 散血丹泼西,竹叶北、西北、西南 血、解毒、安神 ????一~??一整三塞整?? 蓼时远志 瓜子金、黄瓜仁草云桂、川、贵、云 全革 清热解毒、宽胸散 . 海,辣时根广魏, 结 ??~一 整堕堕茎堕堡叠??? ?三生,塑堕墨查???? 塑鱼型垩迤查:童堕亟. 查:兰:垄塑 窒塑蕉鱼:垫塞趟 避意赉源与品质评价研究 . 苦远森 夺远恚、兰花逸丁草云南、谣 全革 清热勰毒、携风止 云南 .. 痛、拔毒生肌 %台砖擎 对峙接鸯革赛攥, 疆、云纛、囊龛摹 瀵热勰毒 ..台掌革、捧钱金不换州 云南 。。。““”’’’。。。。。“?。’。‘。。。。。?““’???。。’‘‘。“?“????’。’。。。~ 远志 细竹远虑、小苹掖由 衣托、华、西根皮 安神益智,俄痰、 东,神妙草四 北、 中寓及四川 消肿 ..川瀹地区远虑属植物药用概况 运志置?:佟走《中霆药蒸》豹法定鑫耱,没有救入《嚣媸接羲惠》瓣“, 导师万德光教授在主持“九五”攻关课题一“近志质撼标准规范化研究”过程中进行资源调 撼。分毒。我们透过黠魍大学、孛嚣墨学 查时发现毅川茂关套远惠旦 院成都生物研究掰、成都中医药大举、成都中医药火学蛾眉学院等科研单位标本的衡阅, 绻合作者先后在蛾眉山、米易、茂县等地浆熊的结果和相关文献报道,邋过整理,表 绢弼渝魏酝远恚袋翁用植物共有稀含交种。具体瓶表. 囊 漆蟪嚣远恚纛祷用秘樊、分毒菠翁角馕撼 卵时葡包山桂花四川蛾眉、蛾边、石棉、霄波、米易、波根 网黄花远虑 川等地;重庆城口、垫源、石桂镰地 藏/ 尾叶远虑 四川叙永、蛾眉、霉波筹缝黧痰瑟浸、擐 幢寒,擞落;止嚷、乎:.云阳、开县、瓣水、武骧、南川、石柱等 嘴、清热利湿、祛痰, . 地 治咽喉肿痛、咳嗽气喘、 支气警炎等 圣.《 小翩豆 只四川达州、叙承、兴文、古蔺、筠连、巫全草 性温、味酱;活血 敝瘀, 蛾眉、天垒、宝兴、平武、盎县、马 螭毒,发袭,止咳化痰。 尔藏、蒜水、茂县、没、酾、美姑、 翔子气管炎、感冒彝塞、 越西、米易、槠城、乡城、泸定蒋地:堂 咽喉肿痛等,外治跌打 成都中医药大学博士学位论文 ?????????????????????????????????????????????????一?? 庆城、巫溪、南川、蜃、等地 损伤。 心果小扁豆 四川盐边 全草 同小扁豆 长毛籽远志 四川都江堰、万源、叙永、屏山、威远、 根 活血、滋补强壮、舒经 散血。用于乳腺炎、跌 资中、乐山、蛾眉、丹棱、马边、洪雅、 ~一一 雅安、天全、宝兴、平武、松潘、理县、 打损伤 甘洛、雷波、米易、壤&西等地;重庆城口、 ?? 至墨墅墨:互墨:蔓芏二趔箜些 西藏远志 根 性温,味甘;补心安神、 四川米易、攀枝花渡口等地化痰:用于血虚、心悸、 失眠多梦、咳嗽等避志资耀冬晶虞详侨磷究 .。民族药应用撅况 我稍逶过对《中国民羧嚣志》等文献转~的鲞阙整理,认为遮悫属共尊辩植物在 个少数堤族地区应用。见表 表远志麟植物民族药应用概况 默予袅 瑶鹱 瓜予金 用于中毒挂肺炎、联畿、跌把、蛇伤 , 侗族 “卯“’。叠革主治代嚷老老年唆嗽 ?成都中医药大学博士学搜论文 .小结 远志属翡用植物资源比较丰富,药用的有种;川渝地区药用资源种含变 释,鳕占垒罾药蠲转类静.廷,说明引流遗区遴志疆药掰瓷源穗警丰富,具有广瘸 的研究开发前景;邋志属植物作为鼹族药应厢亦多,有种植物在个民族地区 药潮,药爨耱类占垒蓬翡。粥,络会囊代辑究手毅灏蔑族缝区静掰药习爱,开震遗恋 属植物的民旅药物学研究,对远志民族药资源的开发利用具有重大寇义。 全鬻及川渝燕嚣远恚簇蕊滔接穆熬药弱鼯经主蘩菇全革藏鬏;药往有澄煞类,鸯寒 ?樊;功效主要有“补益气”、“滔衄化瘀”、“健脾利湿”、“祛风出湿”、“止咳平喘”、 “安秘益智”、“瀵热鳃毒”、“瓣罄”、“发表”等,蕊寐主要翅子气敷不是、跌打损巍、 风湿疼痛、咳嗽气喘、失眠多梦、健忘、惊悸等症的治疗。 远志生态与栽墙适宜区研究 对于特定的中芬,有效成分是冀发搀馋耀约甥联基础,有效或努躲含量决定该孛药 的质量,从黼决定了临床疗效的好环。影响中药有效成分积累的因素很多,除了自身的 遗传因素外,中药生长鲍?壤、气候、生态等地理鸷袋因素是影响中翡质量数塞接医囊,远志资源与品质评价研究 也是道地药材形成的外部条件。本文通过对远志生长群落、生长地土壤以及以生长地气 候因子等因素的调查研究,来初步研究远志的生态多样性,并探讨与远志有效成分积累 的相关因素以及主要影响因素,为远志栽培育种以及道地性的研究提供依据。 .生长群落调查 在远志资源调查的过程中,我们先后对四川茂县,陕西咸阳地区淳化县、陕西渭北 地区合阳县、韩城县,甘肃镇原县、甘肃榆中县等地远志的生态群落做了调查研究。发 现上述各地远志的生态群落类型主要有: 沙棘灌从:主要分布在甘肃镇原、榆中、兴隆山等地。灌木层主要有沙棘 、柳】 、黄蔷薇、三颗针 、甘青铁线莲// 、绣线菊妇阳,金露梅等,偶有油松、侧柏 砌等分布;草本层主要有西伯利亚针茅跚妒、长芒草跚口、 冰草 、蒿 、铁棒锤?? 、甘肃葱 、火绒草、荨麻祀 、百里香. 鳓、唐松 草 、黄芩 、香青 、柴胡 、野菊 等。 三颗针灌丛:主要分布在四川茂县,灌木层主要有三颗针 、绣线菊 等, 、铁线莲 、悬钩子、枸子 也有盐肤木 、漆树 桦 、高山松 等;草本层主要有羊茅 、火绒草三硒阳硪“所、风毛菊、 高山蒿草 、蒿柚早熟禾 等。 在陕西淳化、合阳以及韩城等地,远志生长地植被较单一,木本层主要胡颓子 、沙棘 、刺槐、辽东栎 、山杨 、野菊 等,草本层主要为胡枝子 、冰草 、蒿 等,树种有核桃等 远志、卵叶远志的原植物图及生境图见图. .地理气候因子研究 药用植物在漫长的进化过程中形成了与环境的自组织现象,其有效成分的含量 及特定组成是其适应不同生境的结果。因为生态环境对药材生长发育产生的影响和与其 盛塑垦塑盔堂垦主兰垡塑塞 一. 一 国远志、卵叶远志原植物及其生境图垄查至堡篡曼堕塑鱼照塞 有效成分的形成和累积有关。特剐是邋地药材的产生,与特定生境密切相关。本文 裳錾通过对远志不同生长地地理气候因子的初步调连,来搽讨地理气候因子对远惑的影 响。 ..燕要气候因子的确定 袒步确定了不同生长她远恚的个地理气候殿子指标:海拔、年平均渔度、月平 均温度、年降水礅、年日照时数以及无霜端。见表。 ..调查结聚 结果见表。 袭遂恚不嗣建长地气候盟子一览 ..数据分析 根器远志不丽生长溉魄理气候因子叛及相应的远志酸含量,瘸.统诗软佟送 行线形回归。选样逐步回归法对邈志酸含量与海拔、年均温、温 、馨降承蠢?、年日照、蠢耩麓进行隧耪。经多元线形西扫分析, 结果表明远志酸含量与月平均濒度、年降水量、年日照时数以及笼霜期存在 线形装系。成都中医药大学博士学位论文 其多元回归方程为:..?.?.?.。相关系数见表 ‘ .。 表.各影响因子相关系数 经方差分析,该回归方程的相关系数.,值.,达显著水平.。 对与远志酸含量相关的影响因子年均温、温、年降水量、年日 法,得相关系数矩阵, 照、无霜期进行因子分析,用 见表.。因子分析结果表明,影响远志酸含量的地理气候因子主要因素是年日 照时 数和无霜期,其次为月平均温度和年降水量。说明远志生长地的气温对远志 酸的含量 有较大影响。 表..主要影响因子裹 .土壤研究 药用植物的生长离不开赖以生存的土壤,土壤的肥力、含水量、值等因素直接关 系到药用植物的生长发育和有效成分的积累,从而关系药材的质量。通过对远志野生境 土壤的营养元素、水分以及值等条件的研究,来探讨影响远志有效成分积累的影响因 子。为远志的人工种植,进行合理的栽培管理提供理论依据。 ..材料 远志的主产地采集土样个。采样深度为~:土样具有较好的代表性和多样 性,基本能较全面地反映远志主产区土壤的各种类型。具体取样地点见表。远志资源与品质评价研究 表远志不同生长地土样 ..测定指标 所取的土样测定其全氮、全磷、全钾、水解氮、有效磷。速效钾、有机质、值 及水分。 ..测定方法 土壤水分的测定 先将野外带回的土壤自然风干,之后每个样点取一定的风干土装入铝盒称重 风干 土容器重,记为,然后打开盒盖,置烘箱中,在~条件下,烘至恒重, 再称重干土中铝盒重,记为。设铝盒重,则土壤含水量为: 含水量./一 每个土样重复次,取平均值,结果见表.。 土壤值的测定 称取每个样点的风干土壤约孔径约,置于净烧杯中,然力蒸 馏水,不断搅拌约,静置后,用校对好的一型数字酸度计进行测定, 结果见表.。 土壤营养元素的含量测定 具体方法如下: 全氮用高氯酸?硫酸消化蒸馏法,水解氮用氯化钾浸提一蒸馏法, 全磷用高氯酸?硫酸酸溶?钼锑抗比色法,有效磷用碳酸氢钠?硫酸钼锑抗混合显色 法,全钾用氢氧化钠.钾钠离子测定法,速效钾用中性醋酸铵,值用氯化钾浸提电位 测定法,有机质用重铬酸钾法。结果见表.。远志药材远志酸含量的测定方法见“远志 质量研究”部分。堕壑生堡垫查堂堡圭堂焦缝苎 裘.运志不同产地的土壤葬分含徽 水分 远志酸 取样地点 全氮 金磷 全钾水勰氮有效磷速效钾有机质 塑鱼墨墨. ??竺 堑塑鱼?塑?塑竺?塑盟 . . . . . , . 。 。 匹川燕县 . . . . . . . . . . 甘肃镇原 . . , .。 .,. 陕鞭淳他. . . . . . . . 】. . 陕西合阳。 。 。 . . 。 . . . 陕嚣藻城. . . . . . . . . . . . 山西临汾 . . . . 。 . . 嚣?溪台. 袭瓶各彩旗困子壤荚系数 ..数据分析 根据远恚主产地的土壤测定结柒以及相成采集地远志酸含薰, 用.进行绒 形回归。选掇向后赛《除法对远惠羧会量与垒氮、全袋、 全钾、水解氮、有效磷、速效钾、有机质含爨、值 殴及水分含鬣送行强麴。经多元线形翻魍分摄,结果袭甥远志羧含量冬 全氮、全磷、有效磷、速效钾、有机质含量以及水分含量存强线形关系。其 多元回归方 程炎;.,.....?。一. 经方差分析,该回归方襁的相关系数.,值.,自由度为时,达显潜 远志资源与品质评价研究 水平.。相关系数表见表?。 对与远志酸含量相关的影响因子全氮、全磷、有效磷、速效 钾、有机质含量、水分含量进行因子分析,用 法,得相关系数矩阵,见表.。因子分析结果表明,影响远志酸含量的土壤主要 因 素是有效磷及水分含量,其次是全磷和有机质的含量,再次为全氮和全磷的 含量。提示 在远志人工种植时,应主意旆磷肥、有机质和氮肥,同时要保证水分的充分供 应。 表?土壤营养元素对远志酸含量影响的因子分析 .主产地调查及栽培适宜区研究 ..远志药材主要分布地区 通过对不同地区《植物志》、《植物名录》也噜的调查整理,结合我们对标 本查阅和采集的情况,总结出远志及卵叶远志在国内的分布情况: 远志:在我国分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山西、陕西、宁 夏、甘肃、青海、河南、山东、江苏、安徽、浙江、江西、湖南、四川等省区,主要分 布在西北、华北和东北地区。而福建、云南、湖北、西藏等地无分布 卵叶远志:与远志基本相同,西藏、云南有分布,但在江苏、安徽、浙江、 湖北无分布。 远志及卵叶远志的分布见图. .。栽培远志主产区 我们对各地药材市场的远志来源做了调查,发现野生的远志及卵叶远志逐渐淡出 市场,而栽培药材主要是远志成了主流;结合我们对远志不同栽培产地 调查结果,确认远志的栽培主产区主要在山西、陕西和甘肃,现以山西、陕西产量最大, 质量最好。 成都中医药大学博士学位论文 山西:主要栽培在汾阳、闻喜、繁峙、岚县、沁源、兴县、应县等地 陕西:主要栽培在合阳、蒲城、澄城及韩城。 甘肃:主要栽培在镇原县。 图.中国远志及卵叶远志分布圄 图远志适宜栽培地区划 ..远志的栽培适宜区研究 根据远志的习性,远志系适应性很强的旱生植物,喜光照、耐旱耐寒,怕水涝; 适宜的气候条件为:全年太阳总辐射量为~千卡/,年均温.~?,年降水 量~;适宜土壤为栗钙土,灰色土和草原黄沙土,粘土和低湿地不适于生长。 综合对远志分布地的调查,地理气候因子和土壤营养元素的分析,不同产地 的品质评价避忠资源与精质评价研究 以殿本草考证的结爆,我们初步划分了三个远志栽培适宜区: 出嚣墨紫出区、溪中盆蜓逶宣区:出珏兴县、汾羽、闻警、沁源、繁峙、岚 县等地。 狭嚣溟戴遘宣区:陡廷翡城、会粼、辜城。 陇东平原适宜区:甘肃镇原。 远恚栽培适宜隧见臻 .小绪 对远志鲎长地生态群藩调查发现,甘肃平?、榆中等地主要为沙棘灌从群落类 型, 霞茂吴主瓣为三黻针灌馥,在陕聪淳纯、合辩滥及韩城等鹣,远志艇长逶熹被 较蕈~。 影响远忐酸含嫩的地理气候因予主要因素是年豳照时数和无霜期,其次为月平均 湓魔和年降水量。说明远志生长蟾静气温对逡志酸鹣含量有较大影响;影响逅志酸会整 的?壤因素主要是有效磷及水分含擞,其次是全磷和有机质的含量,再次为企氮和全磷 的含量。掇涿在远惑入工种植砖,液主意施磷肥、裔桃质和鬣腮,丽时要保证水分的充 分供应。 综合本草考证缩架,远恣地理气候因子调查和?壤函予调查缩聚,结合市场及产区 调豢结果,我们认为远志的栽培适嶷区主要是山西髓梁山区、晋中靛地适宜区,陕瑙渭 北遭宜区和陇东平簸适宜区。 .远志种质资源分子标记研究 ? 广义翡药蔫褴耪稀凄瓷源 趸泛指一切《 用予药物开发的植物遗传资源,是所有药用植物物种的总和;狭义的“种质资源”通常就 豢繁一其体耪释丽京,包括靛培晶稀、野生耱、透缘野生静和特臻瓣遗簧奉孝料在雨静所 有利用的遗传材料”。种质资源的研究熙收集、保护、评价和利用物种品种 的前提, 是芍进栽臻帮保护审药蜜添酶基磷,也是形残道蟪药材懿蠹在因素。往良鹃晕申质资滚霹 以为中药的栽培育种提供赚始材料,从而成为实施中药的保证。 。 戢辩时远恚. 远恚泉滚予运悫辩疆餐远恚 的干燥根,临床应用广泛。近年来由于过度采挖,导致野生药材资源骤减,者己被收 入《莺家蘩熹僳护翳生药毒搴物耱名激》,绦护缓翳为疆级。壤在套凌嚣、获疆等魏蠢蠢 大灏积栽培,但缺芝栽培的规范化研究以及栽培、野生药材种质的研究,目前在国内还成都中隧药大学博士学位论文 素觅鬟远志分子标记黯擐道。 本文试圈通过对不同地联野生远虑及卵叶远志基因组以及标记的研究, 来建立远恚黼静撬鼗方法懿及远惠霜反应扩缮锩系,为遴悫瓢指绞图谱 的构建和种质资源的遗传多样性研究藻定基础。 . 分子标记研究 随机扩增多态性 蹩年美国穗邦公司科学家...秘期剥裰尾亚生物研究辨,领导的礴令小组同时发展 起来的一项新技术泓】。因该技术具有应用随枕引物,毽火温度低且易于程序 化盼特点, 蘧爱获得了广泛应用。在药用植物逮褥多样性研究方面,已成功用于人参、 两洋参、当 归、糟斛、障朴、甘革、苍术、鱼腥草、党参、大黄、逾黄等药用植物的指 纹黼 谱构建、真伪鉴定、寒缘关系、种植遗传多榉性和药材道地憾研究上。本文 通过对远惑 .研究分析,探讨远志的遗传多样性,为 耙帕胁.及卵叶远虑,. 远志物种资源的剥用和保存提供依据。 。,仪器、材料与试剂 仪器 ,型恒温金属浴:杭州博日科技有限公司 趟纯承系统 越恒压电流电泳仪,型电泳槽:北京六?仪器厂 台式离德謦 越低温冰箱,一。日本三洋 . 凝羧鑫葫藏像系统 ? 仪, ’德嗣 鸯珏祥器 材料,见表 试蘩随机引物北京赛百盛基豳技术有限公司,,跨 , , ,.,, ,,,?一臻菱己簿窑趣,璩鬟糖上海生 物仪器有限公司分发,其余为国产试剂。远虑赞潭譬品赝评价研巍 表远志及卵叶远惠材料来源 戳上物种均经过等,币万德光教授蕊定。 ..试验方法 ...基嚣缀静挺敬 参照文献弹霉采稻法并稍加改进撼淑远恚。 取终弱建黢干燥髂远恚鲜旰,鹫.冰箱冷冻,取浅潜在磷钵中 癣戒粉末,邋速将粉米转入.离。管中,加入 撼取液,在。鑫 羼浴巾,其瀛不对摇动。 取爨冷帮至室滋,翔等体狡蔬谤,舅浅醇:,漉匀厥予/离心 。 取上清滚,蓬美簿步搽作。 取上瀵,加入/馋积懿异薅辫,予?放譬,予喇.褒。豁, 去主瀵。 熙%也醇洗沉淀次,风予溅淀。 将淡淀滚子豫越审,僚存备褥。 .. 定量分析 采用凝胶鑫动戏像系绞熙疆碱溅戆溪量帮会璧,取.魏弹缓狰滚 与.样品混合,在.%琼月旨麟凝胶上以/电愿条件下想溶,慈紫步灯下溉 察电波凝胶。熙凝胶囱动戏像系绞照搬,分梃凝胶黧橡,定爨。 .,. 扩增条他的慈立 分虽对模扳浓度、弓妨浓度、浓度、浓度、《懿耀量簿袋艘扩增 条件进行优化。选取?份材料进行预备试验,反应总体积,初步的及应体系见 表?: 成都中医药大学博士学位论文 .反应体系 表 试剂 加样量 ×旷 剐 . 山 引物/ 模版 酶/ 灭菌 叼呻 吣伽娜 扩增仪扩增,扩增程序为:预变性,然后进行循环:变性, ?复性,?延伸. ,循环结束后?延,一?保存。扩增产物在.% 。反应产物以 琼脂糖凝胶上电泳,电压/,电泳缓冲液为 为分子量标记,在凝胶成像系统上观察、照像、记录。 模板的浓度 模板的含量是影响扩增产物得率及特异性的一个重要因素。一般认为在每个 反应体系中,~倍范围的能提供好的结果。最佳的模板浓度范 围取决于研究的类群和模板纯度,在模板不很纯的情况下,宁可使用有效浓 度范 围内的最低极限,使抑止聚合酶活性的因子影响降到最小。 本实验对体系中模板从~范围内进行了试验。结果表明,远志扩增 时模板浓度以‖?为宜。见图.. 图模板浓度的影响 的浓度 “的浓度对反应至关重要,因为聚合酶需激活,由于引物与 模板的双链杂交的解链与退火温度受二价阳离子的影响,因此需确定每次扩 增反应的最 /。 佳浓矿浓度。一般反应体系中镁离子浓度为.~.远志资源与品质评价研究 本试验参照标准的反应中各成分的含量,龇浓度梯度实验。结果发 现图,矿浓度在.~./时都能扩增出带谱,最终确定选./。 结果见图?. 图 圈.引物浓度的影响 浓度的影响 , /;,. / /;,. ,.:,.;,. ; ,. /:,. 几 ,. ;,. . 引物的浓度 在.中模板与引物浓度的比例影响扩增产物的质与量,直接关系到可重复 性。引物浓度太低不能扩增,太高则产生新的扩增带。所用引物尽还要避免 自身的碱基 配对,一般含量为%~%时对效果较好。一般认为引物浓度在~ /之间为最佳浓度。 本试验结果显示,远志扩增引物浓度以/.为宜图?。 酶的用量 聚合酶的用量对反应产物影响影响较大。酶量过大,非特异性 条带增多,扩增产物的电泳呈弥散状,酶量过少,导致扩增产物减少。一般在 “反 应体系中,酶的用量在.~.时可以得到重复的、清晰的扩增带。 本试验参照标准反应中各成分的含量,设计酶的用量,实验中酶所用 量及扩增结果见图。实验表明,在.反应体系中,酶的用量在.时可得重复的清 晰 条带。见图?.成都中医药大学博士学位论文 图浓度筛选 圈酶用量筛选 /; ,./:,. /;,. ,.;,.;,. /:,. / ,. ,.;,. 浓度 本试验设计了.~./的浓度范围,实验中所用浓度及扩增结果 见图.。如图所示,以./时最佳。 ...引物的筛选 利用建立的条件,对条随机引物进行筛选,选扩增条带清晰、多态 性强的引物作为;物。 ...远志的分析方法 利用优化的婶?条件和筛选的条引物,进行远志及卵叶远志分析。 每个样品电泳条带按有或无记录,电泳条带存在时赋值为。否则赋值为。按 的方法计算材料间遗传相似系数。训‘算公式为:/,其中 ;/材料和共有的扩增片段数目, 、为材料、出现的扩增片段总数目。 根据遗传距离,按法进行遗传相似性聚类。 ..实验结果与分析 ... 提取及定量分析结果 所提的远志及卵叶远志如图,经凝胶自动成像系统分析,所提个样品 均大于图?,可供实验。远志资源与品质评价研究 捆辛邀志及郭种远志黼 ~ . :矿 .., 反应条捧饶证结果 通过对模板宙量、引物浓度、及浓度和酶用量等因素的筛 选,扩灞条静静簿逸礤究,我稻将远志分耩靛反旋律系确定秀:芨应总傣 积,内含× .”、.“、.、引物.、模檄、 酶。孺魏爱寝诲系对逅恚进行属。,霹褥劐清辩赘黼谱。 ...引物筛选结果 糕蘧,.建立弱条锌,对个麓瓿弓耪逡孳于了掺选,最终确定了扩:鬻条 带清晰、多森性强的个引物作为引物。所选的个引物见表.。 ’..运恚簦鬃分橱 对条引物扩