罗丹明123介导的光动力学疗法预防急性移植物抗宿主病的实验研究
罗丹明123介导的光动力学疗法预防急性移
植物抗宿主病的实验研究 ?
2268?
[文章编号]1000—4718(2005)11—2268—04
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罗丹明123介导的光动力学疗法预防急性移植物
抗宿主病的实验研究*
曾慧兰,朱康儿,蒋建伟,谷怀民,蔡继业,程龙球,杨志刚,郑梅珍
(暨南大学附属第一医院,医学院生化教研室,生命技术学院,广东广州510632; 华南师范大学激光生命科学研究所,广东广州510632)
[摘要]目的:探讨Rh123介导的光动力学疗法(PDT)预防异基因造血干细胞移植急性移植物抗宿主病
(aGVHD)的可行性及安全性.方法:以C57B/6小鼠为供鼠,BALB/e小鼠为受鼠,建立小鼠异基因骨髓移植的aGVHD
模型;混合脾脏淋巴细胞培养(MLC)~NRh123孵育,接受氩离子激光30mW/em2照射3min,再与供者骨髓混合移植
给受鼠,观察受鼠移植后造血重建,aGVHD发生情况及病理改变,生存率;流式细胞仪
MLC细胞CD3CD69阳
性率.结果:光动力学治疗组的aGVHD发生减少,肝,皮肤,肠道病理程度减轻,生存率显着高于未经光动力学治疗
组;光动力学处理后的混合淋巴细胞培养24h后,CD34CD69
达明显下降.结论:Rh123介导的光动力学疗法可
有效预防小鼠异基因骨髓移植的aGVHD.
[关键词]光动力学疗法;若丹明123;移植物抗宿主病
[中图分类号]R733,7[文献标识码]A
ThepreventionofacutegraftversushostdiseasebyRhodamine123——mediat--
edphotodynamictherapy
ZENGHui—lan,ZHUKang—er,JIANGJian—wei,GUHuai—min3,CAIJi—
ve4,CHENG
Long—qiu4,
YANGZhi—gang4,ZHENGMei—zhen2
(DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospit~d,DepartmentofBiochemistry,MedicalCollege,JinanUniversity,
Guangzhou510632,Chitin;LaserScienceInstitute,NormalUniversityofSouthCh/na,G,l
册舢510630,China;Col—
legeofScienceandTechnology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China) [ABSTRACT]AIM:ToevaluatetheeffectandsafetyofRhodamine123(Rh123)一
mediatedphotodynamietreatment
(PDT)onacutegrgtversushostdisease.METHODS:Anacutegraftversushostdisease(aGVHD)micemodelwasestablished
usingC57B/6miceasdono~andBALB/cmiceasrecipients.MixedlymphocyticcellswereculturedwithRh123(50nmol/L)and
irradiatedbyargonlaser30mW/em2for3min.thentransplantedtoBALB/erecipientmicemixedwi山donorbonenlalTOW.Hep—
atopoieticrecovery,aGVHDoccurrence,survivaltimeaftertransplantationandpathologicalchangeswelPobserved.Inaddition,
CD3CD69positiveratesofMLCwereexaminedbyflowcytometry.RESULTS:OccurrenceofaGVHDdecreased,degreeof
pathologicalmanifestationbecamenfilder,survivalrateswerehigherthannonPDTgroups.CD3CD69ratesofMLCcellstreated
withphotodynamietherapy(PDT)andculturedfor24hsignificantlydecreased.CONCLUSION:Rh123一mediatedPDTCanef-
fectivelypreventaGVHDofallogeneiebonenlalTOWtransplantationinmice. [KEYWORDS]Photodynamictherapy;Rhodamine123;Grafthostdi~ase
异基因造血干细胞移植后,供者T淋巴细胞识
别宿主抗原而过度攻击宿主靶器官引发严重的急性 移植物抗宿主病(acutegraftversushostdisease,
aGVHD),近来研究发现光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)采用光敏剂rhodamine衍生物,渗入并 潴留于异基因免疫活化T细胞中,经特定波长的可 见光照射后诱发光化学反应而杀伤活化T细胞,却 不影响非活化的静息T细胞为异基因造血干细胞移 植中有效预防aGVHD提供了新的治疗思路[,.本 研究以C57B/6H.小鼠为供鼠,BALB/cH.小鼠为
[收稿Et期]2004—04—14[修回Et期]2004—06—30 *[基金项目]广东省医学科学技术研究基金资助项目(No.A20(O342)
Tel:020—38688033:E—mail:thlz@jnu.edu.cn
受鼠,建立小鼠异基【天1骨髓移植的急性移植物宿主 病模型,应用Rh123介导的光动力疗法体外处理混
与骨髓混合移植,观察受鼠移植后造血 合淋巴细胞,
重建,aGVHD发生情况,探讨Rhl23介导的光动力疗 法预防异基因造于细胞移植aGVHD的可行性及 安全性.
材料和方法
1实验动物
受鼠为清洁级BALB/c小鼠(H一2",10—12周
龄,雌性),于裸鼠室无菌饲养,移植前5d饮用含抗 菌素水(含庆大霉素320000U/L,红霉素250mg/L). 异基因供鼠为普通级C57BL/6小鼠(10—12周龄,雄 性),同基因供鼠为BALB/c小鼠(11一l2周,雄性). 小鼠购自广州医学院动物实验IfJ心
2主要试剂和仪器
参照文献l3J,Rh123于粉(AlexisBiochemicals公
司,美国)以5%甘露醇(不含酚红的RPMI一1640液 配制)溶解配成10t~mol/L储存液,一20?避光冻存 待用.不含酚红的RPMI一1640液J支酚红RPMI一 1640培养基粉(Gibco公二J),甲纤维素培养基一 MethoCuhTGFM3534(购自帕弗瑞,ti物技术北京有限 公司,StemCellTechnologies,加拿大),丝裂霉素(Sig— ma公司)以RPMI一1640液配制1250mg/L储存液. 白细胞介素2以RPMI一1640液制5×10U/L储存 液.鼠F1TC一抗CD69单抗(Phamlingen).INNO— VA70型激光器(COHERENT,华南师范大学激光生命 科学研究所),为连续输出氲离子光源,波长514nlll. 3移植
3.1供鼠骨髓细胞制备取供鼠C57BL/6小鼠及 同基因供鼠BALB/c小鼠,处死,剪取胫骨股骨,lip— MI一1540液冲洗骨髓腔,0.38%氯化胺裂解红细胞
离心洗涤3次,调整细胞浓 (骨髓液:氯化胺=1:4),
度为1.0×lo9/L,台盼蓝染色检测细胞活力达95% 以上.
3.2供受鼠脾脏单个核细胞制备取供鼠C57B/6 小鼠和受鼠BALB/c小鼠处死后取脾脏,200目金属 网上注射器针芯研磨,以淋巴细胞分离液(Ficoll— Hypaque1.077g/L)离心,获单个核细胞(mononuclear
cell,MNC).受鼠BALB/c小鼠脾细胞做为刺激细 胞,调整细胞浓度为1.0×109/L,加人丝裂霉素(终 浓度25mg/L),37oC,5%cO2孵育30rain,洗涤,再调 细胞浓度为1×lo9/L.供鼠C57B/6小鼠脾细胞作 为反应细胞,调细胞浓度1×lo9/L. ?
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3.3混合淋巴细胞培养经光动力疗法处理刺激 细胞BALB/c小鼠脾细胞与反应细胞C57B/6小鼠脾 细胞按1:1比例,37?,5%CO,进行混合淋巴细胞培 养(MLC),培养体系:RPMI一1640液含15%胎牛血 清,8一巯基乙醇(50/zmol/L),Herpes(20retool/L),L
一
谷氨酰胺(2mmol/L),丙酮酸钠(1mmol/L),青霉 素(1×lO5U/L),链霉素(1×lo5U/L).72h后,取出 混合培养细胞,加Rh123(50nmol/L),37?,5%C02 培养箱孵育40mia;用不含酚红的1640液重悬,孵育 90min;离心洗涤,用不含酚红的1640液重悬装于尖 头玻璃离心试管,1lnI/管,接受激光照射,功率密度 为30mW/cm0照射3min.
3.4移植方法移植受鼠BALB/c小鼠予175型 [?Co]治疗机7射线照射,照射总剂量8.0Gy,剂量 率0.60OcGy/min,照射后6h内经尾静脉注射移植 物.移植分5组,每组8只观察小鼠,另设小鼠3只 观察造血重建:(1)注射生理盐水组;(2)同基因骨髓 +同基因脾脏淋巴细胞移植组;(3)单纯异基因骨髓 移植组;(4)_异基因骨髓+异基因脾脏淋巴细胞移植 组(aGVHD组);(5)混合淋巴细胞培养经光动力学治 疗组.
4观察指标
4.1体外实验检测PDT对T淋巴细胞早期活化指 标CD69细胞的影响设4组:(1)C57B/6小鼠脾细 胞加IL一2(终浓度5×lO5U/L)培养组;(2)不加IL一 2一MLC组;(3)加IL一2(终浓度5×losU/L)MLC组; (4)PDT组:刺激细胞BALB/c小鼠脾细胞与反应细 胞C57B/6小鼠脾细胞按1:1比例混合,接受Rh123
(浓度50nmol/L),激光30mW/cm照射3min,加IL 一
2(终浓度5×lO5U/L)进行MLC.培养24h后,取 上述4组MNC1×1o6/试管,离心弃上清,加F1TC一 抗CD69,PE一抗CD3单抗室温孵育30rain,PBS洗 涤,4%多聚甲醛固定,流式细胞仪检测CD3,CD69阳 性表达率.
4.2移植后小鼠造血重建的观察移植第7d, 15d,21d分别处死造血重建观察小鼠,取尾静脉血 l0,计数白细胞数量.
4.3移植后小鼠aGVHD发生及存活情况WBC> 1.0×l06/L并具有以下症状为急性aGVHD发生:倦 怠,纳差,体重减轻,弓背,脱毛,腹泻甚至死亡.观 察小鼠最长时间为86d,其中存活时间大于30d为 长期存活L4j.
4.4移植后小鼠aGVHD病理改变取生理盐水
脾,肺,皮肤,肠,骨 组,aGVHD组,PDT组小鼠的肝,
髓,4%中性甲醛液定,常规切片,HE染色,光镜下 观察病理.
5统计学处理
数据用SPSS10.0软件进行绀问完全随机化配 对t检验,绘制Kaplan—Meier仔曲线.Poisson分 布检验流式细胞仪结果.
结果
lPDT对T淋巴细胞早期活化亚群表达的影响 混合淋巴细胞培养体系禽IIJ一2培养24h后 CD3CD69表达39.61%,未7J【III一2组13.83%;-5
之相比,接受光动力学处理后C1)3CD69表达明显
下降,n儿表1.
表1光动力学疗法对早期活化CD69细胞表达的影晌
Tab1Effectofphotodynanlictherapy(JfJtheexpressionofCO3al1~1
C1)69()nn1urirJear1va(.tivatP(1r一(.P11subst(%.1×1(r
P<0.05lII一2(一)MIandII一2(+)MI,Cgr()LlI)(Pois—
sondistrihuti~mtest).Poissonlistril)uliontest:CD3,CI)69ex—
pressionsofPlT—II一2(+)M1.Cgloupueresignifi('anti)l《)tr
thanII一2(一)MLCanti11,2(+)MIcgl'oup(P<0.05). CD57B/6:C57B/6illJeespleenlympho~',tesCOt'uhuredtl1II一2
(5×lOsU/I);IL一2(一)M1C:C57B/6lllit?ean(1BAI,B/(.n1i(
mixspleenlymphoeytes;II一2(+)NilC:C57B/6mi('and BALB/emi(?emixspleentymphtx~ytes(?(uhmedwithIL一2(5×l05 U/I);PT—II一2(+)MIC:C57B/6miceandBALB/(?nlice mixspleenlymphocyteseoeuhured,adde(11/1)123(50mnoUI),then
reeeivedlaserirradiatit)n(30f【1W/cm!),thPntllcultul?(twithII一2
(5×lU/I).
2移植后小鼠aGVHD发生及存活情况
生理盐水组小鼠均于15d内死亡.同基因骨髓
+同基因脾脏淋巴细胞移植组100%存活,单纯异基
因骨髓移植组,异基冈骨髓+异因脾脏淋巴细胞
移植组(aGVHD组)自第1ld开始出现典型的
aGVHD表达:消瘦,弓背,脱毛,体龟下降,不同程度
出现腹泻,除一只小鼠不明原因仔活超过30d,其余
在22d内死亡.混合淋巴细胞培养经光动力学治疗
组也不同程度出现以f:aGVHD表达,但程度较轻,
且存活小鼠数量增多,aGVHD绀和光动力学组问生
存率有显着差异(P<0.05)(I-*l1)
3移植后小鼠造血重建
移植后第7,15,21d分别处歹匕造血重建观察小鼠,
计数白细胞数量.生理盐水组小鼠均于15d内死亡, 死亡时WBC数赶5×to7/L一7×107/L.aGVHD组和 光动力学组小鼠死亡时WBC>1.0×lo9/L. 4移植后小鼠aGVItD病理改变
各组小鼠取肝,脾,皮肤,骨髓,肠道,观察
aGVHD病理:aGVHD组(A)肝脏可见肝细胞重度肿 胀变性,肝窦及中央静脉淤血,有淋巴样细胞浸润, 肝索消失;皮肤表现为表皮基底层细胞空泡形成,真 皮浅层有淋巴样细胞浸润;肠粘膜隐窝表浅糜烂坏死, 腺体结构破坏,部分粘膜脱落,基底膜淋巴细胞浸润. 光动力治疗纽(B)上述病理程度减轻(见图2). FigIlJ弋fi,alcurveofmice'aftertransplantation
图1移植后小鼠Kaplan—Meier生存曲线 讨论
慕『人l造血下细胞移植后,急性移植物抗宿主 病(aGVHD),足移植后的主要并发症,临床上传统以 各种免疫抑制剂预防aGVHD,或在体外选择性去除 移植物T胞,目的均是抑制T细胞功能或减少T 细胞数}lt:但去除供者T淋巴细胞可削弱供者T淋 巴细胞介导的GVL,致肿瘤复发;其次,T细胞免疫重 建延迟,致机会性感染增加,直接影响疗效l.近来 研究发现,光敏剂Rhodamine衍生物可渗入并潴留于 异基因活化T细胞中,经特定波长可见光照射后诱 发光化学反应,产生单态氧(02)等细胞毒性物质,杀 伤活化T细胞,不影响非活化的静息T细胞2. CD69是T淋巴细胞早期活化的指标,常在T细胞活 化12—24h内表达升高.本实验发现:混合淋巴细 胞培养(含IL一2)刺激体系在培养24h后,CD3 CD69细胞39.61%,比未加IL一2组(13.53%)明显
升高;含IL一2刺激体系接受光动力学疗法后培养 24h,CD3CD69细胞明显下降(仅7.36%),证实适 当浓度Rh123介导的光动力学疗法可有效抑制T淋 巴细胞活化.
1978年,光敏剂介导的光动力疗法开始用于肺 癌治疗.国外自90年代初已开始用光动力学疗 法治疗皮肤型慢性GVHD(cGVHD)[],但疗效仍不 ?
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