【word】 骨髓间充质干细胞治疗缺血性脑损伤的研究进展

【word】 骨髓间充质干细胞治疗缺血性脑损伤的研究进展 骨髓间充质干细胞治疗缺血性脑损伤的研 究进展 :2oo7年8月第15卷第8期IntJCerebrovasc,August2007,Vol15,No.8 骨髓间充质干细胞治疗缺血性 脑损伤的研究进展 周琼,汤永红 摘要骨髓问充质干细胞在体外特定的条件下,可诱导分化成神经细 胞,这一生物学特性为缺血性脑 损伤的细胞和基因治疗带来了新的希望,为神经系统疾病的治疗和 康复展示了美好的前景.文章对 其研究现状及进展做了综述. 关键词骨髓问充质干细胞;神经干细胞;脑缺血 ProgressinResearchonBone]M[alTowMesenehymalStemCells forCerebralIschemicMury QiongZhou,Yong—HongTang DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospitalofUniversityofSou thChinc~ Hengyang421001,China CorrespondngAuthor.”Yong-HongTang AbstxaetBonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs)Callbeinducedan ddifferentiated intoneuronsinaspecificconditioninvitro.1hisbiolo西 calcharacteristichasbroughtnewa hopeforthecellularandgenetherapiesincerebralischerniciniury,anditveillr evealthe gloriousprospectsforthetreatmentandrehabilitationofnervoussystemdisea ses.Thisarticle reviewsitsresearchstatusquoandadvances. KeyW0rdsbonemarrowmesenchymalstemcell;neuralstemcell;cerebraliS Chernia 随着干细胞移植治疗研究的开展,细胞替代治 疗有望成为神经系统疾病治疗的一种新途径. 骨髓问充质干细胞(bonemesenchymalstemcell, BMSC)是一群有多向分化潜能的组织干细胞,在特 定的条件下,BMSC可跨胚层分化成神经细胞. 据报道,将BMSC应用于一些神经系统疾病的治疗 并取得了一定的疗效.现就BMSC在缺血性脑 损伤治疗中的应用做一综述. 1BMSC BMSC的概念由德国病理学家Cohnhein于 1867年首先提出,.BMSC又称骨髓基质细胞 (marrowstromalcell,MSC),是存在于骨髓问质中除 造血干细胞以外的非造血干细胞,具有自我复制和 基金项目:湖南省生厅科研基金(B2005103) 作者单位:421001衡阳,南华大学附属第二医院神经内科 通讯作者:汤水红 ? 599? ? 综述? 多向分化潜能,在一定的条件下可向脂肪细胞,成骨 细胞,软骨细胞,血管内皮细胞,肌腱细胞,肌肉细胞 分化.近几年的研究明,MSC可跨胚层分化 为外胚层的神经胶质细胞和神经元,且部分具有神 经元的电生理特性.这一研究成果不仅具有 重大的理论意义,而且具有良好的临床应用前景. 2BMSC作为细胞移植来源的优越性 2.1来源广泛 MSC最早从成人骨髓获得,骨髓基质是MSC 最主要的来源.20世纪70年代中期,Fr/edenstein 等u最先证实,将所分离获得的骨髓接种于塑料培 养皿,可见MSC贴附于培养皿表面,通过不断更换 培养液,弃去未贴壁细胞,即可得到少量梭形,漩涡 形细胞,这些细胞就是MSC.目前,人BSC主要来 自健康志愿者捐献骨髓,外科手术弃骨.但是,也有 研究报道,从骨,软骨,肌腱,脂肪细胞,骨骼肌,血管 平滑肌细胞及脐血,胚胎骨髓培养得到了具有MSC !生旦笙1鲞第星期JCerebrovascDis,At~ttst2007,Vol15,No8 特性的细胞.虽然胚胎干细胞具有全能性,且含量 较多,但其制备复杂,而且存在伦理问题.因此,提 取人骨髓来源的MSC作为细胞替代疗法的种子细 胞,是细胞治疗,基因治疗研究的理想工具?. 2.2分离获取容易 人MSC的含量极少,且随年龄的增长,骨髓中 MSC含量逐渐减少.因此,纯化和扩增至关重要. 目前国际上常用的分离MSC方法有全骨髓法和密 度梯度离心法,全骨髓法也称贴壁筛选法,即根据 MSC贴壁特性,通过不断换液除去不贴壁细胞,如 造血于细胞,血细胞等,以达到纯化MSC的目的,但 有报道称此种方法分离的细胞纯度不高.密度梯度 离心法即根据骨髓成分密度的不同,在分离液的作 用下,经高速离心后形成密度梯度,将密度不等的细 胞分离纯化提取单个核细胞进行贴壁培养.有报道 称,采用免疫磁珠法和流式细胞法分离纯化MSC效 果满意.但此法技术要求高,试剂和仪器价格昂贵, 且免疫磁珠法对细胞活性也有一定的影响,目前尚 不能推广普及.在国内,多采用密度梯度离心和贴 壁筛选相结合的方法作为基本的细胞培养,分离方 法,只在细节上略有改动.以人MSC为例,具体培 养方法如下:从健康男性或女性志愿者(年龄I8, 60岁)髂后上棘抽取3,5mL肝素抗凝骨髓,将所 获骨髓按900×gN心5min,弃上清与脂肪,将余下 的部分加入含有1.073eCmL的Percoll液中, 1000×g离心20rain;吸取中间层单个核细胞,转移 至含有15%FBS的完全培养基(DMEM—F12)的培 养瓶内,37~C5%CO,培养箱中培养,常规培养,传 代,观察细胞生长情况.此种分离方法培养出的 BMSC纯度可达95%以上,目前绝大多数实验室仍 然采用此种方法. 2.3MSC体外扩增迅速,可诱导分化成神经细胞 BMSC具有很强的增殖能力,研究MSC的细胞 周期发现,90%处于G0,G1期,”,20%处于静止 期(GO),极低密度培养即能保持增殖能力.CoRer 等|】发现,20mL骨髓标本经6周3代培养后,可 扩增至10个细胞,是源标本的2×10倍.BMSC 具有很强的跨胚层分化能力,在不同诱导条件下,可 向成骨,软骨,肌腱,脂肪,肌肉和肝细胞分化. 1999年,Kopen等?将培养纯化的MSC注射至新 生小鼠侧脑室发现,MSC向海马,嗅球,纹状体,小 脑内颗粒层,外颗粒层等部位迁移.2000年,Wood- burry等?首次成功诱导了MSC向神经元的转变, MSC表达神经元特有的标记物巢蛋白,胶质纤维酸 性蛋白(ialfibrillaryacidicprotein,GFAP)和神经元 特异核蛋白(neuron-specificnuclearprotein,NeuN), 确定MSC能在体外分化为神经元.Sanchez-Ramos 等?对MSC进行体外培养,建立了以脑源性神经 营养因子(brain—derivedneurotrophicfactor,BDNF)为 基础的培养体系,主要含小牛血清,视黄酸,诱导7, 14d后发现MSC横向分化为神经细胞,表达神经元 特有的表面标志物.但是这些研究多停留在诱导后 MSC具有神经元形态特征和表达神经细胞标记物 水平上,并未证明其具有神经细胞的功能和电生理 特性,因此,许多研究者认为这类细胞被称为”神经 元样细胞”更为妥当.2004年,Mahmood等叫应用 碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowth factor,bFGF),神经生长因子(nervegrowthfactor, NGF),Forsklin联合诱导MSC,产生具有类似于神经 细胞的电压触发性Na电位和迟发性K电位的细 胞,这是第一次有关在体内诱导的细胞可以在体外 产生类似神经细胞生物学挣I生的报道.大量实验证 明,在适宜条件下,MSC能向神经元和神经胶质细 胞转化,在体外扩增诱导后,可作为神经细胞移植的 供体用于神经系统疾病的治疗. 3MSC在缺血性脑损伤中的应用 3.1MSC治疗缺血性脑损伤的实验研究 缺血性脑血管病是最常见的脑血管病,大脑中 动脉供血区可卒中可引起偏瘫,偏盲和偏身感觉障 碍.从2000年起,许多学者便对MSC在卒中治疗 中的应用价值进行了一系列的动物实验.Li等? 将大鼠或人MSC在梗死后1d或1周注人大脑中 动脉闭塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)模 型动物体内,14d后注射组神经功能较对照组明显 恢复,28d后观察到MSC不仅在脑内成活,而且向 缺血区迁移,少部分细胞表达神经细胞标志物NeuN 和GFAP,脑室下区可见细胞增生,凋亡细胞减少, 缺血区BDNF,NGF含量明显增加,尽管梗死体积无 明显变化,但植入组神经功能评分显着优于对照组. Chen等的研究表明,大脑中动脉供血区缺血2h 再灌注后,将标记溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)的MSC移植到缺血部位,结果发现,移植细 胞能在宿主脑内存活并向同侧缺血半球集中.与对 照组相比,移植组侧脑室下区BrdU阳性细胞显着增 血管病杂志2007年8第l鲞筮塑!墨堕!!:: 多,一些MSC表达了神经细胞表面标记物,并且缺 血区周围bFGF免疫反应性细胞明显增多,凋亡细 胞明显减少.2000年,他们再次将人MSC注入短 暂性大脑中动脉闭塞后1d大鼠侧脑室内,7d后感 觉试验和14d后的运动试验明显改善,且坏死细胞 明显减少,少部分细胞表达NeuN和GFAP,表明 MsC在体内已分化为神经元和神经胶质细胞,在包 括感觉,运动,反射和旋转等方面对神经功能进行评 价中,实验组较对照组大鼠完成测试的综合能力和 速度明显优于对照组.2004年,Shichinohe 等将绿色荧光蛋白转基因小鼠BMSC植入 MCAO后7d小鼠同侧纹状体内,12周后处死动物, 免疫组化证实BMSC迁移至梗死边缘区,且表达神 经元或星形胶质细胞标志物. 3.2MSC治疗缺血性脑损伤的可能机制 3.2.1细胞替代作用 MSC具有多向分化潜能,研究证明可分化为神 经元样细胞,从而替代已受损神经元.研究表明,通 过静脉和动脉途径移植的MSC均可表达神经元特 异性蛋白,如NeuN,微管相关蛋白(microtubule. associatedprotein2,MAP.2)和GFAP.MSC以 细胞替代方式治疗缺血性脑损伤,目前仍缺乏肯定 结论.其原因是目前仍无法证实这些表达神经组织 标志的细胞具有神经细胞电生理或其他功能的证 据,也无法确定它们能否与宿主神经元建立功能联 系. 3.2.2促进缺血区新生血管生成 缺血性脑损伤是一进行性过程,脑缺血后神经 功能恢复与缺血后新生血管生成的速度和数量密切 相关].2003年,Chen等报道,通过静脉途径 移植BMSC可促进实验大鼠缺血区血管内皮生长 因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)分泌和 VEGF受体-2表达,促进了新生血管生成,对缺血性 脑损伤有一定功能保护作用. 3.2.3分泌神经营养因子 2003年,Lou等报道,MSC通过分泌可溶性 因子促进大鼠中脑神经干细胞向神经元分化.Chen 等给短暂性MCAO雌性大鼠静脉注射成年雄性 大鼠MSC后,缺血区周围bFGF免疫阳性细胞数显 着增加. 3.2.4促进神经系统的自我修复 ? 601? 正常情况下,中枢神经系统内存在未激活的神 经元;脑缺血时,MSC可激活这部分神经元,从而促 进神经功能恢复.2002年,Hofstetter等引发现, MSC移植治疗5周后与宿主细胞紧密结合,为自身 修复提供支架.Akiyama等_3报道,MSC移植后能 引起脱髓鞘的髓鞘再生,神经传导速度显着改善. 4发展方向与应用前景 由于MSC独特的性质特点和功能,在神经系统 应用的实验研究给神经系统疾病治疗提供了新的思 路.MSC来源充足,分离获取容易,体外扩增迅速, 且具有高度分化潜能,可为患者细胞治疗提供自身 种子细胞,避免了免疫排斥和移植物抗宿主反应的 发生,是治疗神经系统疾病的理想种子细胞.但是, MSC治疗缺血性脑损伤的研究尚处于探索阶段,仍 有许多问题需要解决:(1)目前分离MSC的方法尚 不稳定,如何提高MSC在体内的转化率,如何提高 向神经细胞的定向分化能力?(2)体外MSC向神 经细胞诱导分化的机制还不甚清楚;(3)MSC缺乏 特异性表面标记物,多次传代后是否真正具有神经 细胞的电生理特性和功能?(4)神经功能修复的具 体机制也不清楚;(5)MSC应用于临床的生物安全 性如何? 参考文献 1BrazeltonTR,RossiFM,KeshetGI,etalFromn’lalTOWtobrain: expressionofneuronal~enotypesinadultmice,Scienoe,2000,290: 1775—1779 2MalmaoodALuD,WangL,eta1.Irffmcerelxaltr~plaraationofn】釉w stromalcellsculturedwithl~LlrotrophJcfactorstxomotesftr~tional recoveryinadultratssubjectedtotratrnaticbrainJNeuro~ 2002,19:1609—1617. 3MahrnoodALuD,WangL,eta1.Treatmentoftratmaaticbraininjury infemaleratswithintravenousa~finistrationofbonemarrowstromal cells,Ne?Os?gery,2001,49:1196—1203 4LuD,LiWangL,eta1.Intra~eriala~ninistvationofnaaITOWstromal cellsinaratmodeloftratunaticbraini.j~-y.JNe?o缸锄mn2001.18: 813—89. 5SchwarzEJ,AlexanderGM,ProckopDJ,eta1.Multipotentialmarrow stromalcellstransducedtoVoduceL—DOPA:en~aftmeminarat lde1ofParkinsondisease.HumGere”lher.1999.10:2539—2549. 6ProckopDJ.Marrowstromalcellsasstemcellsfornonhematopoietic tissues.Science.1997.276:71—74 7LidaJ,YostdkawaLAkahaneM,eta1.Osteogenicpotentialofcultured bone/ceramiccomtmct:comparisonwithmarrowmesenchymalcell/ ceramiccomposite.CellTransplant,2004,13:357-365. 8SantaMariaL,Rojascv,MinguellJJ.Signalsfromdamagedbutnot undamagedskeletalmuscleinducemyogenicdifferentiationofrat bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells.ExpCellRes,2004, 300:418—426. 9KatayamaR,WakitaniS,TsumakiN,etalRepairofarticularcartilage transfectedautologousmesen- defectsinrabbitsusingCDMP1gene— chym~cellsderivedfrombonenlarrow.Rheumatology(Oxford), 2004,43:980—985. 10JiangJal~rdarBN,Reinh~dtRL,eta1.Pltripotencyofrnesenchymal ? 602-国际脑血管病杂志2007年8月第l5卷第8期肋 JCerebrovascDis.August2007.v0l15.No.8 stemceils&-n-ivedfromadultmarrow.Nattre.20()2.418:41—49. 11UchidaKOkmoH,Hayashieta1.GraftedswiReRe1.R’oepitbelial stemcellsca?lformmyelinatedaXOllSandbothefferentandafferent synapsesthxenegeneicratn~1.~o/]s.JNeurosciRes.2.72:661—669. 12DezawaM.KznnoH,HoshinoM,eta1.Specificinductionofneuronal cellsfromboren1wstromalcellsandapplicationforautologous transplantation.JClinInvest.2004.113:1701—1710. 13HorwitzEM,GordonPLKooWketa1.Isolatedallogeneicbore n1mTow—derivedmesenchymalcellsengraftandstimulategrowthin childrenwithosteogenesisimperfecta:Implicationsforcel1therapyof 937. boRe.ProcNat1AcadSciusa,2002.99:8932—8 14章静波,宗书东,马文丽,主编.于细胞.北京:中国协和医科大学 出版社,2003. 15CongerPa,/vfmguellJJ.Prmaotypic~andfunctionalpropertiesofhlrmn boRem舢wmesenchymalprogenitorcells.J(UPhysio1.1999. 181:67—73. 16Colter13(2,C1ass&DiGirolnmoCM,cta1.R叩 idexpansionofrecycling stemceilsincultt~esofplastic-adll眭cellsfromht~mnboRemalTOW. 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(收稿日期:2007—03—15) 医学简讯? 急性缺血性卒中的静脉内溶栓治疗——从试验排除到J临床禁 忌证 一 些研究显示,只有一小部分急性缺血性卒中患者接受了静脉溶栓治 疗.这一治疗的适应证和禁忌证 通常基于随机临床试验的纳入和排除标准.这些标准的试验环境妨碍了在现实中的应用.因此,荷兰学者 Dirks等旨在根据这些禁忌证在Delphi共识中获得专家意见. 在溶栓治疗方面,他们对一国际专家组采用了Del法.将纳入和排除标准改写成18个量化的短语化 命题.对每一个项目,共识定义为在2个预先设定的临床相关单元内达到某个十分位间距. 31名专家参加了第一轮,30名完成了全部3轮.18个命题中的l2个达成了共识:1.5个月,2个月和 14d不应发生过缺血性卒中,头部外伤和消化道出血,重度神经功能缺损定义为美国国立卫生研究院卒中量 表(NatiohalInstitutesofHealthStrokeScale,NIHSS)评分2,3分或更高,血压不应>185/1101”i”1111Hg,血小板 计数应>90×10/L,血糖水平2.7,22mmol/L,国际标准化比率<1.5及活化的部分凝血激酶时间< 50s.关于从卒中发作到治疗的时间,患者的年龄,近期医疗操作,自然改善率和血压治疗的命题没有达成 共识. Dirks等介绍了关于缺血性卒中静脉溶栓并发症的专家意见.由于这研究结果可能有助于增加接受治 疗的患者人数,因此对于常规临床实践可能是合适的. (李宏建)