复方中药提取物和硝酸咪康唑的联合抑菌作用

复方中药提取物和硝酸咪康唑的联合抑菌作用 复方中药提取物和硝酸咪康唑的联合抑菌 作用 一 388一江苏农业科学2011年第39卷第4期 张超,雷春娟,魏琴,等.复方中药提取物和硝酸咪康唑的联合抑菌作用[J].江苏农业科学,2011,39(4):388—389 复方中药提取物和硝酸咪康唑的联合抑菌作用 张超,雷春娟,魏琴,殷中琼,周黎军,杜永华 (1.宜宾学院生命科学与食品学院/发酵资源与应用四川省高校重点实验室,四川宜宾644000 2.四川农业大学动物医学院,四川雅安625014) 摘要:参照美国临床实验室化委员会(NCCLS)提出的标准(M27一A),采用棋盘微量稀释法,研究复方 中药粗提物和硝酸昧康唑对自色念珠菌的体外联合药敏试验.结果明:联合用药时,复方中药提取物的最低抑菌浓 度(MIc)从单用药时的195g/mL降至49mL;硝酸咪康唑从单用药时的7.8~xg,/mL降至3.9舄/mL.联合抑菌 指数为0.712.由上述结果可知,复方中药提取物和硝酸咪康唑对白色念珠菌的抑制作用表现为相加作用. 关键词:复方中药;硝酸咪康唑;联合药敏;棋盘微量稀释法 中图分类号:$852.66文献标志码:A文章编号:1002—1302(2011)04—0388—02 白色念珠菌(Candidaalbicans)是机会致病菌,可致动物 念珠菌病…,主要有禽念珠菌病(即鹅口疮),奶牛乳房炎,瘤 胃炎,角膜炎,仔猪慢性肺炎等".一旦发病,将造成巨大 的经济损失.除饲养管理及环境卫生状况等因素外,这些疾 病主要是由于长期,大量应用抗生素,从而破坏了体内正常菌 群的拮抗平衡的结果.临床上多选用咪唑类抗真菌药,如伊 曲康唑,氟康唑,克霉唑,硝酸咪康唑等;另外还有两性霉素 B,制霉菌素,5一氟胞嘧啶等.但上述药物均存在不同程度 的耐药率,复发率及毒副反应一.因此,从传统中药中寻找 高效低毒的药物及其有效成分,成为研究念珠菌病防治的新 方向之一.而将中药与西药联合应用,可提高疗效,降低毒副 作用,减少用药量.在中医临床治疗念珠菌感染中应用广泛 的有苦参(radixofSophoraflavescens),土茯苓(rhizomeofSmi— laglabra)及白鲜皮(cortexofDictaranuzdasycarpus).这3种 中药均具有较强较广的抑菌作用….硝酸咪康唑(micon— azolenitrate,Mrs)为眯唑类抗真菌药,对许多致病真菌都有良 好的抗菌作用,对白色念珠菌的作用显着,但偶可引起过敏反 应.本研究用3种中药以一定比例混合的提取物与硝酸咪康 收稿日期:2010—11—24 基金项目:四川省宜宾市科技项目(编号:200903018). 作者简介:张超(1966一),男,重庆开县人,博士研究生,副教授,主 要从事生物工程与食品生物技术研究. 通信作者:魏琴,博士,教授,主要从事资源植物学研究.E—mail: weiqin2001—67@163.eom. 唑进行了对白色念珠菌的体外联合药敏试验,旨在为临床治 疗白色念珠菌感染选择高效,低毒抗菌药物提供试验依据. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1药物复方中药提取物,为四川农业大学药学实验室 自制;2%硝酸咪康唑溶液,由宜宾学院发酵资源与应用四川 省高校重点实验室提供. 1.1.2供试菌种白色念珠菌,由宜宾学院生命科学与食品 工程学院提供. 1.1.3试剂及培养基沙氏液体培养基及RPMI1640液体 培养基(购于Gibco公司),MOPS(购于Amreseo公司).RP— MI1640液体培养基参考NCCLS要求制备. l.2方法 参照美国临床实验室标准化委员会(NationalCommittee forClinicalLaboratoryStandards,NCC~)提出的标准(M27一A 方案)…,采用棋盘微量稀释法进行试验. 1.2.1菌悬液的制备挑取沙氏培养基上至少转种2次的 白色念珠菌菌落于生理盐水中,制成菌悬液,并调整其浓度为 1×10一5×10CFU/mL,备用.试验前用RPMI1640液体培 养基稀释1000倍后使用,即1×10一5x10CFU/mL.当与 等量抗真菌药液混合后,菌液最终浓度为0.5×10一2.5× 10CFU/mL. 1.2.2抗菌药液的配制(1)精确称量复方中药浸膏1g, 用无菌水制成1g/mL的复方药液,于超声仪上超声处理 (上接第387页) 3结论 大叶胡颓子根,叶中均含有甾体或三萜类,糖及其苷类, 有机酸,蛋白质,氨基酸,多肽,皂苷和强心苷,均未检测到蒽 醌;根中未检测到香豆素与萜类内酯,生物碱,叶的生物碱反 应较明显;叶中未检测到黄酮.根的醇提物在盐酸一锌粉反 应中呈阳性,在醋酸镁反应中紫外灯下黄绿色荧光很弱,三氯 化铝反应无荧光,因此,无法确定是否存在黄酮,说明根与叶 在化学成分类型及其含量上存在差异.大叶胡颓子根,叶含 有多种活性物质,这些物质具有多种药理功能,说明大叶胡颓 子是值得深入研究,开发利用的海滨盐生植物. 参考文献: [1]方文培,张泽荣,宋滋圃,等.中国植物志:第52卷第2册[M]. 北京:科学出版社,1983:15—16. [2]袁雪丽,辛兆学,辛卫忠,等.野生观赏木本植物大叶胡颓子驯化 及开发利用研究[J].山东林业科技,2007(5):49—5O,l8. [3]裴月湖.天然药物化学实验[M].北京:人民卫生出版社,2005: 11S 张超等:复方中药提取物和硝酸咪康唑的联合抑菌作用,——389--—— 10min使其充分溶解.(2)取2%硝酸咪康唑溶液1mL,加入 1mL二甲基亚砜(DMSO)稀释为l%的硝酸咪康唑溶液,于 超声仪上超声处理10rain使其充分溶解.(3)用RPMI1640 液体培养基分别对上述药液进行倍比稀释,使复方药液的初 始浓度为6250I,zg/mL,终浓度为49Ixg/mL;使硝酸咪康唑溶 液的初始浓度为125g/mL,终浓度为0.9g/mL.以上各 药物浓度均为2倍药物终浓度. 1.2.试验操作单用药敏板于每行1,8孔按浓度梯度加 倍比浓度药液100IxL,每个浓度设3个平行孔.联用药敏板 则分别在每行每列加2种药液各50L,第9孔加200L培 养液为阴性对照,第10;~LDI150溶剂和50液体培养基 作溶剂对照,第11-EDu100L培养基为生长对照.接种时 除阴性对照孔外其余各孔均加入100的2倍终浓度的菌 悬液,药敏板密封后于37?培养,单用药敏板培养24h,联用 药敏板培养46—50h后观察结果.联用药敏试验重复3次. 1.2.4结果判定将测试孔菌株生长情况与对照孔进行比 较,以培养基清澈为阴性,表示没有菌落生长,混浊有菌膜为 阳性,表示有菌落生长.以培养基清澈的最小浓度为该药的 MIC(最小抑菌浓度). 1.2.5联合用药效果评价试验结果以联合抑菌指数(frac— tionalinhibitoryconcentrationindex,FIC[)来判断两者的联合 效应.FICI:MICA联~/MICA单独+MICB联合/MICB单独.当 FICI<~O.5时为协同作用;0.5<C,?1时为相加作用;l< FICI<~4时为无关作用;当FICI>4时为拮抗作用. 2结果 复方中药提取物和硝酸咪康唑的体外单用和联合抑菌结 果见表1.根据联合抑菌指数计算公式可知:FIC1=0.712, 即复方中药提取物和硝酸咪康唑联合应用对白色念珠菌的抑 菌效果表现为相加作用. 表1复方中药提取物和硝酸咪康唑体外单用和联合作用(//,=3) 3讨论 本研究表明,复方中药提取物在单独用药时的MIC值 (195mL)低于白鲜皮的主要成分白鲜碱对白色念球菌的 大多数菌株的MIC值(128,512Ixg/mL),是最高MIC (512g/mL)的38%,说明复方提取物作用效果优于单独使 用,这可能与各成分的协同作用有关. 复方中药提取物与硝酸咪康唑联合用药时,2种药物的 MIC值均降低,复方中药提取物的MIC值降低了75%,硝酸 咪康唑的MIC值降低了54%.MIC降低的百分率高于梁晓 英等将白鲜碱与佛康唑联合应用后2种药的MIC值降低百 分率.可见,通过这2种药物的联合应用可以提高疗效, 降低用药量,还可减少不良反应的产生,并能为临床用药及其 剂量提供参考.本研究中,硝酸眯康唑的MIC值 (7.8g/mL,即百分浓度为0.00078%),是文献[14]中报道 的硝酸咪康唑溶液的MIC(0.叭%)值的7.8%.导致这种差 距的主要原因可能有以下两方面:一是所用硝酸咪康唑溶媒 不同.文献[14]中所用溶媒为吐温一80,而本研究中硝酸咪 康唑溶液是采用二甲基亚砜(DMSO)配制的,这2种溶媒本 身对白色念珠菌均无抑制活性,不影响硝酸咪康唑的抑菌 作用;但不同溶媒对硝酸咪康唑的溶解度不同,因此对药效的 发挥有很大的影响.二是,药敏试验方法不一样.文献[14] 中是先将药物与菌液充分接触16h,再将含菌试液致密划线 接种于沙氏培养基上,于22—28cC培养1周后所得结果;而 本研究是采用NCCLS规定的微量液体稀释法,通过不同浓度 药液与菌液的等比例混合后,37?培养24h后所得结果.文 献[14]所用方法使得作用时间延长了. 参考文献: [1]陆承平.兽医微生物学[J].北京:中国农业出版社,2005:398. [2]贾杰.现代真菌病学[M].郑州:郑州大学出版社,2001:57— 6O. [3]辛朝安.禽病学[M].北京:中国农业出版社,2003:228—229. [4]王志.畜禽真菌病[M].北京:中国农业出版社,1989:70—86. [5]姚冬梅,张雅洁,卿之驹.念珠菌属的分布及其对五种抗真菌药 物的耐药性分析[J].实用预防医学,2008,15(4):988—990. [6]方志军.白色念珠菌对常用抗真菌药物的耐药性分析[J].公共 卫生与预防医学,20o8,l9(2):68—69. [7]卫彦,陆慧君,张新成,等.白念珠茵对唑类抗真菌药物耐药机 制的研究进展[J].口腔医学,2005,25(5):311—313. [8]郑津辉,王威,黄辉.苦参提取液中黄酮类化合物的抑菌作 用[J].武汉大学:理学版,2008,54(4):439—442. [9]付永霞.白鲜皮的抑菌作用[J].中国现代药物应用,2010,4 (6):238—239. [10]王志强,邱世翠,宋海英,等.土茯苓体外抑菌作用研究[J].时 珍国医国药,2006,17(11):2203—2204. [11]NCCLS.ApprovedStandard.NcclsDocumentM27一A2:Reference methodforbrothdilutionantifungalsusceptibilitytestingofyeasts [S].Wayne:NCCLS,2002:1—29. [12]OddsFC.Synergy,antagonism,andwhatthechequerboardputsbe— tweenthem[J1.JAntimicrobChemotiler,2003,52(1):1. [13]梁晓英,郭娜,王丽莎,等.白鲜碱体外抗白色念珠菌活性研 究[J].中国农学,2009,25(16):21—24. [14]陈树新,蔡先东,陈翠环,等.硝酸咪康唑溶液对白色念珠菌的 体外抑菌作用研究[J].实用医技杂志,2008,15(1):58—60. [15]陈树新,蔡先东,陈翠环.吐温一80对硝酸咪康唑抑菌效果的影 响[J].国际医药卫生导报,2007,13(4):82—83.