幽门螺杆菌感染与胃上皮细胞间隙连接功能的体外研究

幽门螺杆菌感染与胃上皮细胞间隙连接功能的体外研究 幽门螺杆菌感染与胃上皮细胞间隙连接功 能的体外研究 ? 118? 幽门螺杆菌感染与胃上皮细胞间隙 连接功能的体外研究 陶然,方平楚,叶少菁,姜云水,邢美圆 (浙江大学医学院病原生物学研究所,浙江杭州310006) 摘要:目的探讨幽门螺杆菌(H.pylon,Hp)对胃上皮细胞间隙连接通讯(GJIC)功能的影响及其发病机制. 方法应用Hp(包括CagA和CagA一株)全菌和超声粉碎上清分别作用胃上皮细胞株SGC一7901.采用激光扫描共 焦显微镜(LSCM,LeicaTCSSP)以荧光光漂白后再恢复(FRAP)技术测定SGC一7901细胞GJIC功能(以荧光传递 速率K表示,×10/s).结果CagA和CagA—Hp株均下调SGC一7901细胞GJIC功能(CagA:F=57.98;Ca— gA一:F一29,59,P<0,01);且CagA与CagA—Hp相比前者更显着下调胃上皮细胞GJIC功能(全菌:t=13.86,P <0,O1;超声粉碎上清:t=.11,87,p<0.01).结论CagA比CagA—Hp显着抑制胃上皮细胞的GJIC功能,提示 其在胃癌发生中起重要作用. 关键词:胃;上皮细胞/病理学;细胞间接合/超微结构;螺杆菌,幽门;细胞,培养的 中图分类号:R322,44文献标识码:A文章编号:1001.1692(2005)02—0118—03 全球几乎一半人口感染幽门螺杆菌(H.ylori, Hp).Hp感染已被确认为在人类胃,十二指肠疾病 发生发展中起重要作用[】].近年来,流行病学[2和动 物实验[3表明长期慢性感染Hp是胃癌发生的重要 危险因子,尤以CagA菌株为甚.本所以前的研 究[4亦表明CagAHp增加胃癌发生的危险性.但 其诱导胃癌发生的分子机制目前尚不清楚.间隙连 接细胞间通讯(gap—junctionalintercellularcommu— nication,GJIC)是细胞增殖与分化的重要调节机 制.早期的研究发现许多恶性肿瘤细胞缺乏GJIC 功能,进一步的研究表明肿瘤细胞连接通讯抑制的 程度与细胞的恶性程度呈正相关;GJIC功能下调 可以明显地促进细胞的增殖和诱导细胞转化[6;许 多促癌剂如佛波酯(TPA)有抑制GJIC的作用.由 此认为GJIC的抑制是癌变机制的一部分,GJIC功 能的抑制使癌变启动细胞(initiatedcells)得以逃避 周围细胞的调控而继续恶变和增殖最后形成癌肿. 而体外有关Hp与GJIC功能的相关性研究国内外 尚未见报道.本文通过研究对体外培养的胃上皮细 胞GJIC功能的影响,探索Hp致胃癌的可能机制. 收稿日期:2004—01—15 基金项目:浙江省自然科学基金(编号302023)和浙江 省医药卫生科技重点项目(2001ZD004)资助 作者简介:陶然(1979一),女,浙江嘉善人,浙江大学医 学院硕士生,从事幽门螺杆菌致病性基础研究. *通讯作者 1材料与方法 1.1菌株和生长条件Hp97002(CagA)和 Hp97OO4(CagA一)由浙江大学医学院病原生物研究 所鉴定并保存菌种.经免疫印迹显示CagA蛋白 Hp97OO2阳性,Hp97004阴性;Hp97002能使体外 培养的HeLa细胞形成细胞内空泡,即空泡形成毒 素阳性(tox),vacA基因型分析为Sla/m1,而 Hp97OO4为tox一,vacA基因型为m2.上述Hp菌株 分别接种于ECY固体培养基[8],微需氧(5O, 1O%CO,85%N)37C培养48小时,用0.01mol/ LPBS洗下菌苔,5000r/min,20分钟离心洗涤两 次,存放于一2O.C备用. 1.2细胞培养胃上皮细胞株SGC一7901,维持于 RPMI一1640完全培养基,内含体积分数1O的小牛 血清(NBS),L一谷氨酰胺2mmol/I,丙酮酸钠1 mmol/L,Hepes25mmol/L和青霉素100U/ml,链 霉素100ug/ml,在37C5CO的孵箱中培养. 1.3Hp全菌和超声粉碎上清样品制备全菌样 品制备是将冻存的Hp菌体溶解于RPMI一1640培 养基中,调终浓度为1×1OCFU/mI;超声粉碎上清 制备采用冻存的Hp菌体溶解于RPMI一1640培养 基中,调终浓度为1x1O.CFU/m1,经超声粉碎后离 心10000r/min,20分钟,取上清. 1.4Hp对SGC一7901细胞的作用GJIC功能测 定时,SGC一7901细胞接种于带22mm盖玻片的35 Inm培养皿中,密度为0.4x10./m1,0.5x10/ml, 实用肿瘤杂志2005年第2O卷第2期 培养4天.培养结束前24小时,换加Hp全菌和超 声粉碎上清样品;空白对照组仅加2的NBSRP— MI一1640;阳性对照组加2的NBSRPMI一1640,并 在培养结束前加TPA终浓度为5ng/ml. 1.5GJIC功能测定采用激光扫描共焦显微镜 (ISCM,IeicaTCSSP),按荧光光漂白L9]后再恢复 (FRAP)技术测定细胞GJIC功能.FRAP技术是将 待测细胞从表面加用荧光物标记,借助高强度脉冲 式激光照射细胞区域,从而造成该区域荧光分子的 光漂白,而该区域周围的未淬灭荧光分子将以一定 速率向漂白区扩散,通过LSCM的低强度激光扫 描,可以对扩散速率进行定时测定.FRAP中使用的 荧光染料6一羧基荧光素乙酰乙酸盐(6一CFDA)无毒 并具有膜通透性,其进入细胞后,在非特异性酯酶作 用下水解为膜不通透性的6一羟基荧光素,故荧光物 质进人细胞后无法通过细胞膜,而只能通过细胞间 的通道在细胞间进行传递.因此,测定细胞间荧光传 递速率可以反映GJIC的有无和水平. 1.6数据处理与统计学分析MicrosoftExcel数 据表经整理后,导人SAS6.12(CA0版本,由浙江大 学医学院卫生统计学教研室协助)行曲线拟合,计算 细胞间荧光传递速率K.各组间GJICK值的比较 采用方差分析(ANOVA)和相关分析. 2结果 Hp对胃上皮细胞GJIC的影响:Hp全菌和超 声粉碎上清刺激SGC一7901细胞24小时后,对 SGC一7901细胞GJIC功能(以荧光传递速率K表 示,×10/s)的影响(4-5)见表1.从表中可以看 出,Hp(包括CagA和CagA一株)全菌和超声粉碎 上清均下调SGC一7901细胞GJIC功能(CagA:F 一57.98;CagA一:F一29.59,P<0.01);但CagA 组与CagA一组间存在显着性差异(全菌:t一13.86, P<0.01;超声粉碎上清:t—l1.87,P<0.01).另 外,TPA[5ng/(ml?h)]能有效地抑制胃上皮细胞 SGC一7901间隙连接功能(F一737.93,P<0.01). 3讨论 目前研究表明促癌剂,致癌物和癌基因等都可 通过介导GJIC功能下调,在细胞增殖,转化畸变中 发挥效应[6].GJIC发受到抑制或缺乏与恶性肿瘤密 切相关.GJIC是由连接蛋白构成的中空离子通道, 胃上皮细胞的连接蛋白为32(connexin32,Cx32). NagaharaDo3和Uchida[1等的研究均报道,正常胃 ?119? 表1Hp对胃上皮细胞GJIC'的影响[?s(,1)] 组别CagA株一CagA一株一 全菌 超声粉碎上清 空白对照 TPA(5ng/m1) 26.O54-3.39(40)H36.95?3.78(44)" l5.924-2.53(4O)"?22.69?2.60(41)一 66.394-9.95(24) 8.474-0.95(22) 'GJIC用荧光传递速率(K,×l0?sec1)表示;一单因素方 差分析,CagA株F:57.98;CagA株:F=29.59.P<O.Ol; "I)unnett多重比较方差分析(与TPA组比较):P<O.05 ?CagA株与CagA一株问的t检验,全菌;f一13.86,P<0.01; 超声粉碎上清:f:l1.87,P<0.01 黏膜上皮表达Cx32;萎缩性胃炎Cx32表达明显减 少;胃癌未能检测到Cx32.癌前病变和胃癌早期上 皮细胞Cx32蛋白减少,无表达或异常,GJIC功能 均下调,甚至丧失.表明GJIC功能下调是胃癌早期 标志.关于Hp与胃上皮细胞GJIC功能之间的关 系,国内外均未见文献报道.本文采用体外方法,可 排除体内研究中机体免疫反应和多种细胞因子对胃 黏膜上皮细胞GJIC功能的间接影响作用.研究结 果表明,无论CagA还是CagA—Hp均下调胃上皮 细胞SGC一7901的GJIC功能,但CagA株抑制作 用更为显着.提示Hp下调胃上皮细胞GJIC功能可 能与胃癌密切相关. Smoot等[1的体外研究发现,尽管CagA株毒 性作用比CagA一大,但CagAHp对胃上皮细胞增 殖的抑制作用却比CagA一小.该结果与本组观察到 的Hp与胃上皮细胞SGC一7901共培养24小时后对 上皮细胞GJIC功能的影响结果一致.CagAHp显 着抑制胃上皮细胞GJIC功能,从而诱导上皮细胞 过度增殖,使细胞发生突变的机会增高和DNA修 复时间减少,提示其可能是胃上皮细胞癌变的部分 机制. 综上所述,Hp可直接下调胃上皮细胞GJIC功 能,进一步表明其与胃癌相关.与CagA一株相比, CagAHp诱导胃上皮细胞过度增殖,细胞DNA合 成加速,而Hp产生的许多有害酶类,毒素以及超氧 阴离子等,使得DNA受损的机会增加,可致胃黏膜 细胞发生基因活化或突变,最终导致增殖失控;同时 CagAHp显着抑制胃上皮细胞GJIC,GJIC功能 的抑制使癌变启动细胞(initiatedcells)得以逃避周 围细胞的调控而继续恶变和增殖,从而最后形成癌 肿.因此,CagAHp感染在增加胃癌发生的危险性 中起重要作用. 参考文献: [1]KuipersEJ.Helicobacterpyloriandtheriskandman— E2] E3] [4] E53 E63 [7] agementofassociateddiseases:gastritis,ulcerdisease, atrophicgastritisandgastriccancer[J].Aliment Pharmacolther,1997,11(Suppl1):71—88. DaneshJ.Helicobacterpyloriinfectionandgastriccan— cer[J].AlimentPharmacolTher,1999,13(7):851— 856. WatanabeT,TadaM,NagaiH,eta1.HelicobacterPY— loriinfectioninducesgastriccancerinMongolianger— bils[J].Gastroenterology,1998,115(3):642—648. 叶少菁,方平楚,厉朝龙.幽门螺杆菌130kDa(CagA) 蛋白的纯化与鉴定[J].中华微生物学和免疫学杂志, 2000.20(6):496—498. 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SmootDT,WynnZ,ElliottTB,eta1.EffectsofHell— cobacterpylorionproliferationofgastricepithelial cellsinvitro[J].AmJGastroenterol,1999,94(6): 1508一】51]. RelationshipbetweenHelicobacterpyloriinfectionandgapjunction functionofgastricepithelialcellsinvitro TAORan,FANGPing—chu,YEShao—jing,etal (InstituteofPathogenicBiology,CollegeofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou,3100 06,China) Abstract:ObjectiveTostudytheinfluenceofHelicobacterpyloriinfectiononGJICanditsme chanism.MethodsA humangastricepithelialcellline(SGC一 7901)wasgrownoncoverslips,thenexposedovernightto(CagAorCagA—strain) H.pyloriintactbacteriaandsonicateextract,respectively.GJICbetweenthosecellswasdeterminedusingthefluorescencere- dlstributionafterphotobleaching(FRAP)assay.ResultsWhencomparedwithcontrolwhichcellswereculturedinmedium alone.bothCagAandCagA— H.pyloriisolatesincludingintactbacteriaandsonicateextractcouldinhibitgap— junctionfunc. tioninSGC一7901cells(CagA+:F=57.98;CagA一:F一 29.59,P<0.01).ComparedwithCagA—strain,CagA+strainsignifi, cantlydown—regulatedGJICfunctionofgastriccellsinvitro(theintactbacteriasamples:,一13.86,P<0.01;thesonicateex, tractsamples:t=11.87,P<O.01).ConclusionsWhencomparedwithCagA一 ?.pylori,CagAH.pyloristraincandown. regulatethegapjunctionfunctionsignificantly,whichmayplayanimportantroleingastriccarcinogenesis? Keywords:stomach;epithelial/pathology;intercellularjunction/ultrastructure;Helicobacterpylori;cells,cultured