RP—HPLC法测定血脂康胶囊中大豆苷元、黄豆黄素和染料木素

RP—HPLC法测定血脂康胶囊中大豆苷元、黄豆黄素和染料木素 RP—HPLC法测定血脂康胶囊中大豆苷元、 黄豆黄素和染料木素 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1I期2007年11月?1645? 表3特征指纹峰的相对峰面积 Table3Relativepeakareasofcharacteristic fingerprintpeaks 峰号 特征指纹峰的相对峰面积 12345平均值 方法生产的山银花药材液相指纹图谱,系统地反映 了其山银花不同成分的全貌,可作为山银花不同产 地加工品的质量控制方法之一.由于样品数量有限, 只采集了安龙和贞丰2个产地的药材,但从图谱中 可以看出,2个产地的药材在化学组成及主要特征 指纹峰相对峰面积上没有显着差异. 山银花的加工主要蒸气脱水,机械化生产,机械 化炒干,土法蒸后烘干和强制通风干燥5种方法.从 指纹图谱的分析结果可以看出,5批样品的色谱图 整体相貌是相同的,说明不同产地加工方法的山银 花药材的化学组成一致性较好,质量稳定.但同时也 应看到各主要特征峰的相对峰面积还是有一定的差 别,如量较高的10,ll,12号色谱峰,在机械化生产 的山银花中分别高达1.329,1.282,1.765,而土法 蒸后烘干的山银花则分别只有0.653,0.650, 0.801;2号特征峰相对峰面积在土法蒸后烘干的山 银花中达到0.086,蒸气脱水,机械化生产和机械化 炒干的山银花则在0.025左右;7号特征峰相对峰 面积在机械化炒干的山银花中高于0.92,蒸气脱水 和机械化生产的山银花保持在0.82左右,但土法蒸 后烘干和强制通风干燥生产的药材则只有0.50.说 明山银花的加工方法不同,其药材的指纹图谱也有 较大的差异,对于选用合适的加工方法生产山银花 具有指导意义. 用药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度 评价系统2004A版1.0版对5批样品的数据进行 处理,得到了相关系数,按样品编号用平均数表示依 次为0.9953,0.9878,0.9908,0.9511,0.9825, 用中位数表示依次为0.9741,0.9674,0.9727, 0.9352,0.9330.说明选用的特征指纹峰是恰当 的.据此,制定了真伪鉴别相似度值的,即相关 系数用中位数和均值表示均不得低于0.900,特征 指纹峰的相对保留时间RSD小于1.5.但特征指 纹峰的相对峰面积积分值差异较大,建议在实际应 用中根据具体适应症选用固定的药材. References: [1]c^P(中国药典)Es].VolI.2005. E23ZhouRH.ResourceofChineseMedicinalMaterials(中药资 源学)EM].Beijing:ChinaMedico—PharmaceuticalScience andTechnologyPublishingHouse,1993. [3]ShiY,ShiRB,LuYR.Advancesinstudiesonthere— sources,chemicalconstituentsandpharmacologyofmedical honeysuckleinChinaEJ].ChinPharmJ(中国药学杂志), 1999,34(11):724. [4]HuangLY,LnZZ,LiJB,ela1.Studiesonthechemical constituentsofJapanesehoneysuckle(Lonicerajoponica) EJ].ChinTraditHerbDrugs(中草药),1996,27(11): 645. [5]WangYZ,ZhangZW.Commentaryontheresearchof honeysuckleprocessingdrugsEJ].JShandongUnivTradit ChinMed(山东中医药大学),2000,24(1):66—67. RP—HPLC法测定血脂康胶囊中大豆苷元,黄豆黄素和染料木素 马学敏,郭树仁,段震文.,王祥云,李霄. (1.北京大学化学与分子工程学院,北京100083;2.北京北大维信生物科技有限公司,B京100083; 3.北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京100022) 摘要:目的建立血脂康胶囊中大豆苷元,黄豆黄素,染料木素的测定方法.方法采用反相高效液相色谱法, YMC—Ce分析柱,乙腈一水(O.1%磷酸)梯度洗脱为流动相,检测波长256nm.结果大豆苷元,黄豆黄素,染料木素 收稿日期:2007—0326 作者简介:马学敏(1976一),女,山东蓬莱人,博士,现为北京大学与北触E大维信生物科技有限公司联合培养博士后,主要研究方向为 中药新药研发与中药指纹图谱. *通讯作者郭树仁Tel:(010)51557550E—mail:guosrpku@263.net 850759945900 140478074299 200210780092 001000000101 300020562242 960398633345 100210480890 001000000001 760996634301 980200013550 100221560668 001000000000 770267841677 420578206245 200210910204 001000010111 240584623925 320760115286 200211800327 001000010111 260808076686 220436304027 200210880103 001000000111 ) 12456789u3 ?1646?中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第11期2007年11,El 在测定范围内线性关系良好,平均加样回收率分别为97.8,99.1,97.9,RSD分别为 2.O2,1.93,1.84 (=5).结论方法操作简便,准确,重现性好,可用于同时测定血脂康胶囊中大豆苷元, 黄豆黄素,染料木素的量. 关键词:血脂康胶囊;大豆苷元;黄豆黄素;染料木素;高效液相色谱 中图分类号:R286.1文献标识码:A文章编号:0253—2670(2007)11—1645—03 Determinationofdaidzein,glycitein,andgenisteininXuezhikangCapsula MAXue—rain,,GUOShu—ren,DUANZhen—wen,,WANGXiang—yun,LIXiao. (1.InstituteofChemistryandMoleculeEngineering,PekingUniversity,Beijing100083,Chi na;2.BeijingWBL PekingUniversityBiotechCo.,Ltd.,Beijing100083,China;3.CollegeofLifeScience& ;Bioengineering, BeijingUniversityofTechnology,Beijing100022,China) Keywords:XuezhikangCapsula;daidzein;glycitein;genistein;HPLC 血脂康胶囊是以红曲为原料的制剂,具有降血 脂,抗动脉粥样硬化,抗癌,抗骨质疏松等I临床疗 效[1].血脂康胶囊中含有大豆苷元,黄豆黄素,染料 木素等大豆异黄酮成分.大豆异黄酮具有抗癌,抗肿 瘤,降血脂,抗动脉粥样硬化等广泛的生物效应[2]. 其测定方法目前主要有比色法,纸色谱法,薄层色谱 法,气相色谱法和液相色谱法[4].比色法干扰多, 专属性差,测定结果偏差大;纸色谱法和薄层色谱法 分离效果差,定量分析误差大;气相色谱法需要复杂 的前处理,影响结果的重现性.本实验采用HPLC 法同时对血脂康胶囊制剂中的活性成分大豆苷元, 黄豆黄素,染料木素进行了测定,为较全面地分析和 控制其质量提供了简便的方法. 1仪器与试药 岛津Lc一20AT高效液相色谱仪(日本岛津公 司),SPD--M20A检测器,SIL一20A自动进样器, CLASS—VP色谱工作站;MettlerAE200万分之一 电子天平(瑞士). 大豆苷元,黄豆黄素,染料木素对照品为自制, 质量分数大于99;血脂康胶囊由北大维信生物科 技有限公司提供;乙腈为色谱纯,水为重蒸水,其他 试剂为分析纯. 2方法与结果 2.1色谱条件:YMC—C18(250mm×4.6mm,5 m)色谱柱;流动相:乙腈(A)一0.1磷酸水溶液 (B),梯度洗脱:0min(25A)一15min(45A)一 20rain(95A),检测波长为256nm;柱温为室温; 体积流量为1.0mL/min;进样量10L.色谱柱理 论塔板数以大豆苷元峰计不低于3000. 2.2对照品溶液的制备:精密称取大豆苷元,黄豆黄 素,染料木素对照品适量,以MeOH—DMSO(1:1) 准确配制成含大豆苷元6.8~g/mL,黄豆黄素4.0 ~g/mL,染料木素12.0~g/mL的混合对照品溶液. 2.3供试品溶液的制备:取本品约0.3g,精密称定 后置于50mL圆底烧瓶中,加入30mL乙腈65?水 浴提取3次,30min/次.合并3次提取液,减压蒸干, 残渣以MeOH—DMSO(1:1)转溶至5mL量瓶中, 并以MeOH—DMSO(1:1)定容至刻度,摇匀,即得. 2.4标准曲线的制备:取混合对照品溶液,自动进 样2,4,6,8,10,12L,按上述色谱条件测定峰面 积.以峰面积积分值为纵坐标,对照品进样体积为横 坐标,绘制标准曲线,得回归方程.大豆苷元:Y一 29952X+424.4,r一0.9999;黄豆黄素:Y一21073 X一809.4,r一1.0000;染料木素:Y一87470X+ 453.0,r一1.0000.结果表明大豆苷元在13.6, 81.6ng,黄豆黄素在8.0,48.0ng,染料木素在 24.0,144.0ng时,与峰面积呈良好线性关系. 2.5精密度试验:精密吸取混合对照品溶液,连续 进样6次,在上述色谱条件下测定对照品峰面积积 分值,其RSD分别为大豆苷元0.69,黄豆黄素 0.98,染料木素0.75. 2.6稳定性试验:取同一供试品溶液,按上述色谱 条件分别在0,2,4,6,8h进样,测得供试品溶液中 大豆苷元,黄豆黄素,染料木素在8h内峰面积的 RSD分别为0.98,1.34%,1.07%,说明供试品溶 液在8h内稳定. 2.7重现性试验:精密称取同一批血脂康胶囊内容 物0.3g,共6份,制备供试品溶液,进样测定.结果 大豆苷元质量分数为89.2/~g/g,黄豆黄素54.4 ug/g,染料木素158.8ug/g,RSD分别为1.17, 1.25%,0.97%. 2.8加样回收率试验:取同一批(大豆苷元89.2 /~g/g,黄豆黄素54.4/~g/g,染料木素158.8ug/g) 的血脂康胶囊内容物0.15g,精密称定,共6份,分 别精密加入混合对照品溶液2mL(其中大豆苷元 6.8~g/mL,黄豆黄素4.0~g/mL,染料木素12.0 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第11期2007年11月?1647? ~tg/mL),按供试品溶液制备方法处理,测定大豆苷 元,黄豆黄素,染料木素的质量分数,计算平均回收 率.结果大豆苷元97.8,黄豆黄素99.1,染料木 素97.9,RSD分别为2.02,1.93,1.84. 2.9样品测定:取3批血脂康胶囊,每批重复测定 3次,外标法计算大豆异黄酮的质量分数,色谱图见 图1,结果见表1 l—,, B 06Il162126j1 t/min 1一大豆苷元2一黄豆黄素3一染料木素 1-daidiein2-glycitein3-genistein 图1血脂康胶囊(A)和混合对照品(B)的HPLC图 Fig.1HPLCChromatogramsofXuezhikangCapsula (A)andmixedreferencesubstances(B) 3讨论 大豆苷元,黄豆黄素,染料木素的紫外最大吸收分 别是247,256,260nm,由于3者中黄豆黄素的量最 小,为提高其检测灵敏度,选择256nm为检测波长. 血脂康胶囊为红曲发酵产品,含大量色素类成 表1血脂康胶囊中异黄酮的测定结果(一3) Table1DeterminationofisoflavonesinXuezhikang Capsula(一3) 分,以甲醇或75乙醇作为提取溶剂时,色素类成 分提取得较多,提取液颜色很深,影响色谱柱寿命. 以乙腈作为提取溶剂,色素类成分提取得少,对色谱 柱损伤小.同时经过试验,使用乙腈加热回流提取3 次能将被测组分提取完全. 大豆异黄酮在各种溶剂中的溶解度较差,0.3g 血脂康胶囊内容物的乙腈提取物完全转溶至5mL 量瓶中也比较困难,选用MeOH—DMSO(1:1)作为 溶剂,可以很好地克服溶解问题,并且对色谱行为没 有影响. 笔者曾检测过样品中相应大豆苷量的情况,结 果发现血脂康胶囊中大豆苷的量极少,推测在发酵 过程中,苷在微生物的作用下转化成了相应的苷元. 根据文献报道E引,苷元的生物活性较苷的生物活性 更强. 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AdvExpMepBoil,1998,439,117-129. 《中草药》杂志被评为"第五届中国百种杰出学术期刊'' 2006年10月27日中国科学技术信息研究所公布了"第五届中国百种杰出学术期 刊"名单,《中草药》杂 志获此殊荣——"第五届中国百种杰出学术期刊".这个名单是按照期刊指标评价 体系对重要指标(影响因 子,总被引频次,他引总引比,基金论文比和即年指标)进行打分的结果,并在近几年 来召开了20余场专家研 讨会,对评价指标不断进行推敲和改进而评出的. 摘引自中国科学技术信息研究所《2005年度中国科技论文统计与分析年度研究 》