几种胶体金技术详解

胶体金免疫技术详解 随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA和斑点免疫层析分析DICA。本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。 金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术，是于1971年建立的一种信号显示技术。此技术最初用于免疫电镜检查，由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。此后，此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。近10多年来，利用硝酸纤维素膜（NC）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。 胶体金是指金微小粒子（0-100nm）分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶，用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。 与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在渗滤或层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，故需时间较长。故此技术做到了名副其实的POCT。 原理：     将氯金酸（HAuCl4）用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒（胶体金），标记金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）或抗体，用于免疫印迹、免疫组织化学定位或快速免疫渗滤、免疫层析实验。金标记免疫渗滤技术的原理同一般的免疫斑点试验，也是用已知抗原或抗体包被NC膜，再用金标记抗体或抗原来进行快速快速测定，阳性时斑点呈胶体金的红色。改进之处为采用了渗滤装置，更加简便。金标记免疫层析则是利用NC膜条状纤维的毛细管作用，使样品在涌动中与金标记物及包被在NC膜上的抗原或抗体结合，出现呈色的阳性信号。 胶体金的制备： 在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界线十分清楚。金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电的排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定的胶体，所以称其为胶体金。胶体金的制作方法有白磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例（即增加或减少还原剂的量）可得到所需不同直径的金颗粒。 但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一，所以目前常用后两种方法，以柠檬酸三钠还原法为例。 Frens标准方法： （1）取0、01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL. （2）约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色，大约再过70s，蓝色突然转变为亮红色， （3）继续煮沸约5分钟后结束反应。 （4）冷却后用0.1MK2CO3溶液调至所需PH值。 （5）此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。 该法制备得到的金颗粒直径约为41nm，如前所述，要想得到更大或更小的金颗粒，该方法依然可行，唯一不同的是需要改变加入还原剂的量。另外，采用此标准方法所需反应时间最短。 附注：有研究者已经注意到影响胶体金质量及其稳定性的几种因素，制备过程中器具若全部使用干净的玻璃器皿，溶液一律用0.2µm滤膜过滤后使用，水用玻璃三蒸水，推荐使用超纯水，采取这些措施后制得的胶体金很稳定。这些措施表明即使很微量的污物都会对胶体金制备带来不良影响。虽然经常可见推荐使用硅化玻璃器皿的说法，其实使用普通玻璃器皿同样也能制出高质量高稳定性的胶体金。 免疫金的制备 胶体金与抗原（或抗体）的结合物称为免疫金或胶体金标记物，在免疫组织化学技术中，又习惯称之为金探针。 胶体金标记蛋白的原理是：在碱性条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与蛋白质所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合，这种结合对所标记蛋白的生物学活性无明显影响。环境pH和离子强度是影响胶体金与抗原（抗体）吸附的主要因素，胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及浓度等也影响蛋白质的吸附。 一般制备方法为：1、胶体金pH的调整（用K2CO3或HCL溶液调节pH至选定值。原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可以略偏碱。但各标记物的最适反应pH往往需多次试验才能确定）；2、蛋白质最适标记量的确定（将待标记蛋白作一系列稀释后各取一定量加入装有一定量胶体金的试管中，然后分别加入NaCl溶液，混匀静置数小时，对照管与加入蛋白量不足的管颜色会由红变蓝，而蛋白量足或超过的管保持红色不变，其中含蛋白最低的一管即为稳定胶体金所必须的最适标记量。以此比例并增加10%-20%即为标记全部胶体金溶液所需的蛋白总量）；3、标记过程（在电磁搅拌棒下将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，反应一定时间后加入BSA并调整至pH8.5，放置室温继续反应数分钟）；4、离心去除未结合的蛋白质（各粒径的金粒子所需的离心转速与时间均不一样。离心后去上清液，将沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮，恢复至原体积后再离心。如此洗涤2-4次，以彻底除去未结合的蛋白质）。 NC膜 硝酸纤维素膜(nitrocellulosefiltermembrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。 国内NC膜的分类主要有两种：135s和180s。分类是依据现在大部分厂商用的4cm膜平均水的层析时间。换算为孔径就是135s=8um，180s=6um。 那么从这个公式中可以看出，在通过同一长度位置时，金溶液通过的速度是快速膜>慢速膜。那么通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短，读数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢，也就灵敏度高。同时还有一个问是，反应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。所以这里就有一个读数时间/反应灵敏度/非特异性结合的均衡。综合以上，结论为膜孔径越小灵敏度越高。但是同时也减慢了跑板速度，增加了非特异性结合的机会，也就是假阳性的升高。所以要按照试验结果挑选适合实际项目的膜，找到合适的平衡点至关重要。根据专家研究135s的一般用在双抗体夹心法，180s的一般用在竞争法。 胶体金免疫分析技术 1、斑点金免疫渗滤试验 原理：胶体金免疫渗滤分析（DIGFA）原理与操作步骤基本与ELISA相同：加    样品于固定有配体（抗体或抗原）的硝酸纤维素膜上，通过渗滤在膜中形    成抗体-抗原复合物，洗涤渗滤后，再加液体的胶体金标记抗体。当结果    为阳性时，在膜上固定有抗体-抗原-胶体金标记抗体复合物而呈现红色斑    点。 技术类型：1、双抗体夹心法用抗体结合在微孔膜中央，滴加待检标本，若标本中待测抗原与膜上抗体上结合，然后滴加金标抗体，再加洗涤剂洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。 2、间接法用抗原包被在微孔膜上，滴加待测标本，滴加洗涤剂洗涤后，滴加金标抗抗体，加洗涤剂洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。该法由于血清标本中非目的性的IgG的干扰，易导致假阳性结果，临床上运用较少。 装置示意图装置分解图 2、斑点金免疫层析试验 原理：斑点金免疫层析实验（DICA）是胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结    合的以微孔滤膜为载体的快速固相膜免疫分析技术。与胶体金免疫渗滤实    验的过滤性不同，DICA中滴加在膜一端的标本溶液受载体膜的毛细管作    用向另一端移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体    膜上某一区域的抗体（或抗原）结合而被固化，无关物则越过该区域而    被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判定实验结果。 技术类型：1、双抗体夹心法如上图所示，G处为金标记抗体（免疫金），T处为包被抗体，C处包被抗金标抗体，B处为吸水纸。测试时A端滴加待测标本，通过层析作用，待测标本向B端移动，流经G处时将金标抗体复溶，若待检标本中含有待测抗原，即形成金标抗体-抗原复合物，移至T区时形成金标抗体-抗原-抗体复合物，金标抗体被固定下来，在T区显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标记抗体移至C区被抗金标抗体捕获，呈现红色质控线条。 2、竞争法如上图所示，G处为金标抗体，T处包被标准抗原，C处包被抗抗体，测试时待测样本加于A端，若待测标本中含有待测抗原，流经G处时结合金标抗体，当混合物移至T处，因无足够游离的金标抗体与膜上的标准抗原结合，T处无棕红色线条出现，实验结果为阳性，游离金标记或金标记复合物流经C处，与该处的抗金标抗体结合出现棕红色的质控带，若标本中不含待测抗原，金标抗体则于T处膜上的标准抗原结合，在T处出现棕红色的线条，实验结果为阴性。 3、间接法为了消除待测血清标本中大量的非特异性IgG与特异性IgG竞争结合金标记抗人IgG，降低试验敏感性，胶体金间接免疫层析法测抗体常成反流免疫层析法。 测试卡可分为左右折叠的两部分，右面中央纵向贴有NC膜条为膜上包被有抗原线T，E处为含能与蛋白结合的有色染料的样本加样区，F处为吸水材料；左面中央开有观察窗口B，C处固定有金标记羊抗人抗体，A、D处为吸水材料。测定时先将缓冲液加在D处层析至C处使金标物复溶，然后将标本加在E处使其与染料一起在膜的层析作用下向F端移动，若标本中有待测抗体存在，则于膜上抗原结合形成抗原抗体复合物，待有色染料延伸至膜上标记线G处，在F处加缓冲液，合上测试卡，A的强大吸水作用使膜上液体反向移动，标本中非特异性IgG及无关物被洗回E处，随后而来的金标羊抗人抗体与抗原抗体复合物结合，出现棕红色线条。无棕红色线条出现则表明血清中无特异性抗体。该法有效的排除了非特异性抗体对测试的干扰。 临床应用 应用范围包括感染性疾病抗原、抗体检测，如HBsAg、疟原虫抗原、TB—Ab、HP—Ab、HIV—Ab等；各种蛋白质抗原检测，如AFP、CEA、肌红蛋白、肌钙蛋白、尿微量白蛋白、OB等；激素检测，如HCG、LH、FSH、TSH等；药物检测，如吗啡、可卡因等。适用范围一般为定性试验。 样本： 样本采集后应尽快分离血清或血浆以避免溶血。检测时应尽量使用新鲜的样本。样本若不能及时送检，可在2°-8°冷藏3天。长期保存需冷冻于-20°C，忌反复冻融。发臭、溶血、脂血、细菌污染等异常样本请勿使用。 注意事项： 以GICA为例，它将几种组分优化组合成一个整体的免疫层析分析条，许多条件及条件的组合都会影响到它的质量，包括：（1）硝酸纤维素膜的性能和质量，膜孔径大小及均一性，选定膜孔径的适宜性，结合配体（抗原或抗体）容量的大小，非特异吸附性能，亲水性及液体的流动性和流动速度的均一性等；（2）捕捉配体的量及质量（配体的纯度，亲和力及滴度）及在膜上配体的包被量和均一性。配体划线位置的固定一致性；（3）固相金标记膜中的胶体金和配体的含量和比度，条间的均一性，固相标记物的稳定性，复溶性，复溶速度及流动性，所含缓冲物质的种类及有效促溶剂的使用等；（4）各种膜，甚至包括样品垫是否经过预期处理以减少非特异吸附。 以上条件都可以综合影响胶体免疫层析的质量控制，主要包括：灵敏度，阴阳性界限值（cutoff）的准确性和一致性及层析条间的重复性等。（1）灵敏度：因测定主要针对正常人体液中不存在或含量很低的生物活性物质的定性结果。高灵敏度及其重复性是最重要的质量控制指标。为此，生产厂家在保证分析条的各种优化条件外，还应提供能确证灵敏度的标准品，供操作者检验其灵敏度和重复性。另外，还应配有相应的阳性及阴性对照血清以供对照之用。（2）阴阳性界限值的准确性和重复性：避免发生假阴性或假阳性的结果，保证结果的正确。生产厂家应提供确定界限值的标准品，最好还要提供低于或高于界限值的标准品（注明浓度），以供使用者对结果的判断。 所有试剂板均应于干燥环境下恢复至室温再拆封使用。 应用的重点和展望     临床应用的重点应放在：急需快速诊断以便进行治疗的急重症，如协助确诊急性心肌梗死的急性心梗标志物就是很好的例子。有普查意义的检查和流行病学调查：如各种传染病（病毒性肝炎，艾滋病，性病及其它各种流行病）流行病调查；某些肿瘤（如前列腺癌，结肠癌，肝癌，乳腺癌）的普查及预防检查；围产期的健康普查等。它可以作为快速的初筛普查手段，对阳性和可疑的结果再进一步做更细的可靠的检查。 今后的发展： （1）全面提高质量。突出质量控制的保证，为进一步发展打好基础。 （2）提高检测的灵敏度。目前检测的灵敏度都低于相应的定量免疫分析，应尽量缩小差距。除使用各种优质的原料，如膜条，高纯度高亲和力的配体（特别是配制好的优质单抗），优质高比度的标记配体以及先进的工艺外，还应引进信号放大系统，例如生物素-链亲和素系统，用链亲和素作为膜上的捕捉配体，分别用生物素化和胶体金标记的配制良好的优质的特异性单抗与分析物形成免疫复合物。应用链亲和素与生物素结合的四价性及极高的亲和常数，可明显提高灵敏度。此外，链亲和素-生物素系统还可以作为一种通用的分析系统，检测不同的抗原。由于链亲和素价格较贵，也可用高质量的抗生物素抗体作为通用的检测系统。 （3）实现半定量和定量化。①可通过精确控制膜上捕捉配体的量，使用多条平行捕捉配体线的方法，通过显色条带的数目，判断分析物的浓度区间，得到半定量的结果；②应用反射的光密度计测量显色带或斑点的颜色强度，换算成浓度值，实现定量的估算。德国宝灵曼生产的肌钙蛋白-T及相应的测量仪（stripreader）即可显示出免疫层析条上肌钙蛋白-T的量。香港研制的FABP胶体金免疫渗滤分析也配有定量分析仪，可进行定量测定。二者均成为患者床旁诊断急性心肌梗死的快速灵敏方法。 （4）检测多种分析物。同一个膜上可同时测定几种有相关意义的分析物，如乙型肝炎不同的抗原及抗体。国外已有同时测几种心梗标志物及测定多种毒品的胶体金免疫分析。 （5）建立检测全血的方法。主要针对急重症快速诊断之用，以减少分离血清的时间。德国宝灵曼生产的人肌钙蛋白GICA便采用全血检测方法。检测全血的方法对自检，患者床旁检查和边远地区的普查都有实际应用意义。