基因和干细胞治疗

基因和干细胞治疗 基因和干细胞治疗 GeneandStemCellTherapies EugeneH.&,MD jerMLeiden.MD,Phi) 每个人都先天具有相对固定的 遗传信息,加之环境因素的影响共 同决定了个体易罹患的各种疾病. 直至近来,个体的遗传信息是固定 和不可改变的概念仍被广泛接受, 医生对患者可通过改变生活方式, 药物和外科手术治疗由遗传和环境 因素共同导致的疾病.例如,医生 可能会建议一例由于低密度脂蛋白 (LDL)受体基因杂合突变导致的家 族性高胆固醇血症患者戒烟和使用 HMGCo.A(3-羟基.3.甲基戊二酰辅 酶A)还原酶抑制剂(他汀类药物)降 低胆固醇的合成,并实施冠状动脉 搭桥术治疗其冠状动脉粥样硬化 症.尽管在缓解症状和改变疾病进 程方面是有效的,但上述治疗均未 直接针对患者或其后代的遗传学病 . 因 近几年,人类遗传学,细胞生物 学和基因治疗的发展使该类患者的 治疗发生了根本的变化.新千 年的医生不仅用基因组建疗法改善 患者的生活质量,还将用新的治疗 方法以改变患者的遗传结构.人体 基因治疗和干细胞移植是最有前景 的新治疗模式中的两种 本文总结了近年来基因和干细 胞治疗的进展,特别把重点放在治 疗的潜能和为有效治疗疾病所必须 克服的关键问题方面.对新疗法带 来的一些伦理学方面的重要问题也 基因和干细胞治疗对多种人类遗传性疾病殛获得性疾病有着广泛的前景.人类疾 病相关基因的识别和新载体的开发以殛向不同组织导入治疗基因装置的进一步发展将 使基因治疗领域取得重大进步.从以往认为无再生潜力的器官中分离出于细胞,并发 现其具有可塑性.以殛人类胚胎干细胞的产生清楚地明了人类干细胞治疗的可行性. 在载体的开发和干细胞生物学方面仍要做进一步的大量研究工作,才能充分认识这些 治疗方法的全部潜能.同样重要的是,人们还必须面对有关基因和干细胞治疗的伦理 学问题. 进行了讨论.由于本文对文献复习 的广度与范围有限,读者可以参考 其他优秀的,涉猎更广的综述以获 取更多的信息. 基因治疗 基因治疗最简单的定义为对细 胞遗传信息的修改从而取得治疗效 果基因修改可以在培养的细胞中 进行,然后应用于患者(体外方式), 或进行体内细胞修改(体内方式) (图I).最早的基因治疗研究是对 单基因遗传障碍的患者进行缺陷基 因置换,用正常基因的复制品代替 缺陷基因.治疗的病例包括囊状纤 维化患者的呼吸道上皮囊状纤维化 跨膜调控剂(CFTR)基因置换, Duchenne肌营养不良患者的肌细胞 增强蛋白基因置换,家族性高胆固 醇血症患者的肝脏LDL受体基因的 置换 然而,其他研究工作表明,基因 治疗将会主要用于那些遗传学基础 尚未完全认识的复合性或后天性疾 病,通过细胞遗传信息的修正起到 治疗作用.例证包括:细胞毒基因 疗法,如用单纯疱疹病毒胸腺嘧啶 脱氧核苷激酶基因和ganciclorir治 疗癌症;细胞生长繁殖抑制疗法,如 用视网膜母细胞瘤基因导人血管平 滑肌细胞治疗球囊血管成形或支架 置放后的血管再狭窄;以及用血管 基因如血管内皮生长因子(VEGF) 基因治疗缺血性心肌病" 大多数基因治疗由三个相互关 联的部分组成:治疗性基因或其他 核酸(如,RNA分子或合成的低聚核 苷酸),传送治疗核酸到达目标细胞 的载体和传送基因/载体结合物到 达目标活体组织的装置(如,导管, 注射器或支架). 目前这三部分都取得了进展. 人类遗传学家和基因组科学家已经 识别了与许多单基因病相关的基 因,这些疾病范围广泛.从肌营养不 良到高脂血症"及部分癌症"-】. 类似的方法也用于复合多基因病遗 传基础的研究,如糖尿病和阿尔茨 海默病(Alzheimerdisease)人类基 Author^flIIlaUons:HaahoolofPublicHealth fDrsl(ai,andLeiden)andBrighamandWomen'sHos- pita.1(DrKa.Boston,tM.a~s;Veter&rlsAffairsBoston HeafthcareSystemJamaicaPIaJnMa(DrKa/O;and AbbottLaboratories.AbbParkI?(DrLeiden) CorrespondinAuthorandRe~rints:JeffreyM L~denMD.PhD.AbbLabcrateriesDe?ent OfecufiveBldgAP6D,'COAbbottPaRdAb bottPark1L60O64忙mail:ieleuJen@abbotttom) 美国医学会杂志中文版2001年l0月第2o卷第5期 ——————— ———————————————_______?_____?___________-____-?—————__———d?——— l 围I活体内和活体外基因治疗方法 活体内基因转导话体,卜基因转导 一 种活体内的基因治疗方法是直接特治疗性核酸注^患者体内基固包在载件中.用 一种装 置输送到靶器官图中f左)整台到质粒中的基困通过门静脉导管被输送到肝脏中 活悼外 的方法包括从研究的组织获取细胞.在体外用基因进行转导.然后将改变了基因的 细胞重新 注人患者体内体外基因转导可以应用与体内基因转导相同的载体 因组的完成可望发现新的治疗 基因,从而扩充基因治疗的范围,加 速基因治疗的进展.因此,新治疗 基因的不断发现不会限制基因治疗 的发展. 基因治疗载体的开发也取得了 进展.但是,这一领域存在的问题 限制了很多基因治疗的进行理想 的载体应该容易获得,滴定纯度高, 能在活体内高效稳定地转导非增殖 细胞,使转基因长期表达,而不产生 细胞毒性作用,炎症或免疫反应 这样的载体还应该有靶组织特异 性,能使转基因表达并能通过药理 或生理调控转基因的表达. 很遗憾,这种理想的载体尚未 开发出来质粒DNA载体虽然容易 产生和调控,也能在体内和体外稳 定地转导细胞,但这些载体向非增 殖细胞传输转基因的效率低,并能 引起直接针对CpG重复序列的免疫 反应.比较起来,腺病毒载体容易 生产,且滴定度高,能高效地转导多 种类型细胞,但有明显的局部组织 炎症和较强的免疫反应,限制了转 基因表达的持续时间多数逆转录 病毒载体需要细胞增殖才能高效地 转导,因而限制了它们在活体内基 因治疗的用途.但它们在试管内能 有效而稳定地转导增殖细胞,免疫 原性相对较低,这使它们在活体外 的应用很有价值已用表达白细胞 介素2受体链的逆转录病毒载体 在活体外感染患者的造血干细胞, 治愈了2倒X连锁免疫缺陷病的患 儿" 腺相关病毒(AAv)载体和慢 病毒(以人类免疫缺陷病毒:HIV] 为基础)载体是最有前途的基因治 疗载体.与腺病毒相似,这类载体 可以稳定并有效地转导非增殖细 胞,而免疫原性和炎症反应较少. 因此,这两种载体系统可以诱导长 期的,高水平的转基因表达临床 已用表达凝血因子?的AAv载体试 验治疗B型血友病患者,正在进行 美国医学会杂志中文舨2001年10月第2D卷第5期 的临床试验有助于明确该系统的可 用性.慢病毒载体用于人体试验 可能还需要几年的时间 尽管都有应用前景,但目前 AAv和慢病毒两种载体都有缺点. 腺相关病毒载体只能容纳少于4.5 千碱基的转基因片段,且难以大量 复制.慢病毒包含一些残余HW基 因,并且也难复制. 许多基因治疗的实施均要求对 活体内特定的细胞进行靶向转基因 表达,并能通过药物或生理性干预 对其进行转基因表达的调控.这方 面的研究刚刚开始,但在培养细胞 和动物实验方面的初步结果令人鼓 舞.例如,可以改变逆转录病毒和 腺病毒载体表面的膜蛋白或壳蛋 白,以增强对特定细胞类型的基因 转导.同样,通过使用组织特异性 转录调控因素(如,肌肉或肝特异性 转录增强子和启动子),腺病毒和 AAv载体能被改良以在活体特异性 细胞类型进行转基因表达.同时, 使用合成启动子系统雷帕霉素(ra— pamyein,免疫抑制剂——译者注)或 四环素可以调控动物的转基因表 达.同样,在基因治疗载体加人低 氧诱导成分,可用来在体外或体内 产生低氧诱导基因表达. 与基因识别和载体开发的进展 相比,基因传输装置的研究刚刚开 始.有报道称太多数市场销售的基 因传输导管可迅速有效地灭活腺病 毒载体,该报道强调了这方面研究 的重要性因此,在进行临床试验 之前,制作并严格检测基因传输装 置与每个基因治疗载体的兼容性是 至关重要的. 总之,基因识别,载体开发和转 基因调控等领域的进展加快了基因 治疗的发展进程.虽然有报道表明 某些基因治疗临床试验发生了极为 不幸的并发症",但是现在已有人类 基因治疗获得成功的报道.然而, 还有很多工作需要进行才能使基因 治疗既安全又有效.特别需要容易 大量生产的高教价的载体,这些载 体可安全定位到特定类型的靶细 胞,并可产生经调控的转基因表达. 还需要可高效定向传输这些载体到 活体内适当组织的装置最后,还 需要对正常细胞生物学和人类疾病 的生化和遗传基础有更深的认识, 这样才能为常见的人类疾病出 新的基因治疗方法. 干细胞治疗 在正常人类胚胎发育过程中, 全能的受精卵分化出各种各样的细 胞类型并形成成熟的器官.许多成 熟器官,包括骨髓(造血系统),皮肤 和小肠,保留了大量的未分化干细 胞,这些细胞能够自我更新并分化 成至少一种或多种的成熟细胞类 型.在人的一生中这些干细胞使受 损伤或衰老的细胞有可能再生. 医生开发干细胞用于治疗已有 40多年的历史.例如,造血干细胞 移植(即骨髓移植)可以拯救那些骨 髓中某种细胞发生疾病或恶变的患 者的生命.然而,干细胞移植的应 用受到很大限制,因为据认为许多 器官(脑,脊髓,心脏,肾脏)检测不 到于细胞.而且还认为在成年期这 些器官来源的细胞不能重新诱导分 化成不同的细胞系 近来三个发现使干细胞生物学 发生了重大变革,这些发现证明,在 许多人类疾病这些细胞均具临床应 用潜能(图2).首先,在脑和肌肉这 类以前认为缺乏干细胞和再生潜能 的器官中发现了干细胞.例如,在 脑的一些区域存在具有增殖能力的 干细胞,这些细胞在体内和体外都 能分化成熟为不同的神经细胞类 型.动物研究表明,中枢神经系 统的增殖细胞在学习和记忆中起到 一 定作用.而且,这些细胞还可以 被培养并移植到受体的中枢神经系 统中并在那里分化为成熟的神经细 胞.同样,骨骼肌干细胞(成肌细 胞)可以在体外培养并移植到受体 的肌肉组织中,在此它们分化成肌 小管并与自身的肌纤维融台以恢复 损伤的肌肉. 第二,器官特异性成熟干细胞 比最初所认为的有更强的可塑性. 从一种组织分离出的干细胞可以分 化成多种不相关的细胞类型和组 织.例如,最近的动物实验表明,神 经干细胞可以分化成造血细胞系的 细胞.同样,骨髓衍生的干细胞可 以分化成几种非造血系的细胞类 型,包括骨骼肌细胞,,脑中的小 胶质细胞和星形胶质细胞以及 肝细胞.这些发现增加了用骨髓 移植治疗许多种疾病的可能性,如 肌营养不良,帕金森病,卒中和肝脏 衰竭. 也许细胞可塑性的最好证明就 是动物克隆实验1997年,英国的 研究者报道了着名的克隆羊"多 利",就是将乳腺细胞的细胞核注入 到卵细胞中培养而成的.在此之 后又有小鼠,牛和猴用类似的技术 被克隆成功.这些实验表明,终末 分化细胞的细胞核可以重新被诱导 出多能性.因此,用准备受治患者 的小量已分化细胞(如皮肤或肌肉 的活检样品),有可能在体外培育出 特定类型的治疗性干细胞,从而避 免了对移植细胞的免疫反应. 第三,人类胚胎干细胞_4.可以 从早期胎儿中分离出来,使其在体 外分化成一系列不同的细胞类型. 胚胎干细胞是全能细胞,来自早期 受精胚胎的内细胞群.在适当的组 织培养条件下,胚胎干细胞具有无 限复制的能力,同时保持其全能性, 当将其重新植入胚细胞时,以这种 方式培养的胚胎干细胞可以最终生 成成年动物的所有器官. 此外,培养的胚胎干细胞在体 外可以分化成多种细胞类型,包括 造血细胞,骨骼肌和心肌细胞以及 脂肪细胞.这种胚胎干细胞可能具 有重要的治疗潜能.例如,在一种 遗传性人类脱髓鞘病变(Pelizaeus. Merzbacher病)的大鼠模型中,在体 外分化成少突神经胶质细胞和星形 细胞的啮齿类胚胎干细胞被成功移 植并在脑的不同区域生长出髓鞘. 上述结果,以及分离出人类胚胎干 细胞,对于有这种罕见的遗传性髓 鞘缺陷患者有重要的意义.更重要 的是,人胚胎干细胞分化成不同类 型的同质的前体细胞群,这为治疗 各种需要组织修复和重建的疾病, 如卒中,神经退行性疾病,心肌梗死 和肝衰竭等提供了良好的前景. 总之,成熟组织中干细胞的发 现,成熟干细胞和已分化细胞的出 乎意料的可塑性,以及人类胚胎干 细胞的分离都扩大了以细胞为基础 的治疗的潜在应用范围.与基因治 疗类似,干细胞治疗的研究也刚刚 起步.对于如何分离和培养人类干 细胞,如何调节其在体外和体内的 存活和分化(及退行发育)还需要更 多的了解.但是,采用自身细胞为 供体的以细胞为基础的治疗方法为 治疗获得性和遗传性疾病,包括组 织退化和细胞机能障碍,提供了广 阔的前景. 联合治疗 基因和干细胞治疗本身就有望 治疗各种类型的人类疾病,但这两 种方法结合起来对某些疾病的治疗 会更加有效(图2E).例如,将进行 过基因修改的骨骼肌干细胞植入体 内,这种植入所采用的载体可调控 美国医学会杂志中文版2001年lO月第?卷第5期 囤2干细胞治疗脑梗死的可能方法 体外扩增 体 A,从脑获取器官特异性干细胞,体外扩增,重新植^患者体内神经干细胞可能会产生新的神经细胞,以替代由于梗塞而死亡的细胞使患者恢复 丧失的神经功能.B.将从同种异体供体获得的^胚胎千细胞在体外诱导产生神经前体细胞,然后将这些细胞植^患者体内c.获得患者的体细胞 (如皮肤细胞),分离体细胞棱,注人到去核的人卵细胞中.这千细胞会发育成囊胚从囊胚的内层取得细胞进行培养,在体外诱导形成神经前体细 胞.这些细胞可用于修复损临组织而不会有免疫排斥的危险.D,取得患者的骨髓干细胞,将其在体外诱导成神经前体细胞,重新植^患者体内修复 损伤区域E,联台治疗:获得骨髓干细胞,用基因转导的方法改变其基因,体外诱导成神经前体细胞,重新植人患者体内 治疗性蛋白(如红细胞生成素或生 长激素)的表达与分泌,这样,重组 的蛋白就会稳定地进入到系统循环 中".与此相似,缺乏特异基因产物 的肌细胞或肝脏干细胞与缺陷基因 的正常拷贝进行基因重组对治疗遗 传性单基因突变,如血友病和肌营 养不良的患者可能会有敬. 伦理学的考虑 与许多新的治疗方法一样,基 因和干细胞治疗也遇到了很多难 题,引起了伦理学方面争论和关注, 某些观点是涉及所有人体实验的常 见争议,另一些则更为独特,只涉及 基因和干细胞治疗中使用特定基因 和细胞的方法,这些道德上的争论 将会持续下去,极大地影响这些治 疗方法的发展和未来. 所有实验性治疗领域都会出现 上述争论,将基础科学的进展转化 成临床应用是一种艰巨且有风险的 挑战,这对医生和患者双方都需要 时间,信任和耐心.由于临床试验 不能确保成功,及时的公开而坦诚 的交流对于医生,患者和公众问建 立信任是至关重要的热衷于这些 治疗方法的研究者对其远期潜能抱 有过高的期望值,因而在疗效和安 全性等方面作出了不切实际的近期 美国医学会杂志中文舨2001年l0月第20卷第5期 承诺.研究人员和临床医生必须清 楚地告知公众,这些治疗方法还处 于研究的早期阶段,因此不可能在 今后10年内广泛应用.同样,实验 性基因治疗的风险和益处也应坦诚 地告知患者及家属,基因治疗试验 可能发生的不良事件也必须告知患 者,家属以及相关的协调机构. 基因治疗与生物医学研究中的 许多其他领域一样.其主要研究者 受制于现实与既得利益冲突的影 响,其中许多人没有透露从事临床 试验的公司中的经济收益.美国基 因治疗协会建议,从事基因治疗试 验的临床研究者与可能从这些试验 研究机遇及预测:基因和干细胞治疗 重要的研究机遇展望 警病相关掘姐糖脯肥奎嚣薷詈燥疴竹,胖症, 高血压胥莩弄罱薪军#阐明 确定疾病状况的骨干途径治疔干预病理肝逮径罔此用止疾病 耋熹耋基治疗载体,使其能高效篙至絮器耋霎差雾需韶翟翥蠢传输调控表眷…….…"… 开发基因治疗输送装置.使其与基因治疗载基因治疗载体通过导管直接被输送到目标 体匹配并能定位输送细胞或器官 不能进一步分化的细胞(如心肌或神经细 识别不同的终丰丹化器官中的f细胞胞)受到破坏.可以应用干细胞治疗替代丧 失的细胞 使易于分离的干细胞如骨髓细胞分化成受 确定调节干细胞可塑性的分子途径损伤组织的细胞,如烧伤患者的皮肤或卒中 患者的神经细胞 开发高教的体细胞核多能干细胞的桩转移从体细胞核产生的干细胞将分化成损伤组 技术织替代丧失的细胞 由于基因突变而功能异常的病变器官可 开发细胞基治疗的联台方法薯萋瞽蔷蔷孥耋 内以改变整个器官而使患者治愈 结果中获益的公司之间不应有任何 个人的经济利益关系, 对基因和干细胞治疗,人们提 出了几个重要的有针对性的伦理学 问题首先,许多人对于与改变人 类基因构成有关的已出现的,切实 存在的问题感到担忧.人们对选择 最适当特征进行基因修改表示出特 别的关注.例如,几乎没有人不同 意对大多数癌症进行基因治疗(如 果是安全和有效的).但是,用这种 技术来改变身高,体重和记忆则是 有疑问和争论的.其次,人们担心 可能不慎(或有意)改变病菌细胞的 基因构成,会导致基因治疗载体将 病菌细胞系传递到受治患者的后 代.同样,关于于细胞治疗,人们 亦为干细胞的来源问题所困扰,更 具体地说,即采用人的胎儿组织分 离干细胞问题一.在胎儿组织的 治疗潜能和流产和胚胎组织试验的 道德问题之间如何达到平衡是今后 面临的重要的伦理学方面的挑战. 总结 基因和干细胞研究为开发新疗 法为治疗重要的和普遍的人类疾病 提供了良好的前景.还需要做很多 工作才能完全了解这些方法的治疗 潜能.与大多数医疗方法一样,基 因和干细胞疗法也可能遭到不负责 任,不道德的滥用,对患者和社会造 成危害.因此,基因和于细胞治疗 的临床试验必须以完善的基础实验 和动物实验为依据,并按照最高的 医学和道德进行,这是至关重 要的.在科学和医学事实的基础上 进行公开,积极的伦理学讨论,在医 生,患者及公众间进行适时,坦诚的 交流对发挥这些治疗方法的最大潜 能同样是至关重要的. 王彦斌译黄志强棱 JAMA.2001;285:.545—550 参考文献 !Nlu'RC1hebasicscienceofgenetherapyuctSden~e1995;267:518-522edimmunodeficien cy(SOD).X1diseaseScience 3cmnce1993:260:926?93211LosordoDWValePRSymesIFetalGene2000;2豁:669-572 w"m研review6e憎2000;7:2?34.89therapyf0rmyocardialaagfogene~is:initialdinical 僧.1MonahanPE.Sarnu~kiRJAAVvectors:isdin?caj . suitswithdirectcardialinctmnofphV[-~F165successonthehori.r.,Geneer. 2~O;,7:24.30 U 2 c ? hsE : , 1 J ? A 55 $te 1 a 99 sso B leth 2 e 8o0ra/~:…:mrmD.ten.嚣2fo3e 4?GageFHMammalianrleurdlstemcellsScience12Koenig^^.Hofhn~EP.Bert~sonCI. MonacoAP.2oKayMA.MannoCS,Ra~niMvetalEvider~e 2000;287:1433'1438Feene~CKunkelc.,n脚cloningattheDuch.forgenetransferand唧惜 如n0ffactorIXi1hae. ,?VveissmanILTranslatingstemandprogenitorcellennemusculardystrophy(DMD]cDNAandprelimi?mophiliaBpatientsIreatedw811AAVvectorNat ?l0岛to廿Ieclinic:barneandOpport~iesS— nagenomicor@niz~tionofeDMIDeneinn.Gene/2000;24:257.261 eJ3Ce2000;287:1442-1446realandaffectedindividualsCell1987;50:509?51721.Kasah; ~aN【'oAM,FanYWTt.e0fIc恒r. E . KnowlesMHohnekerKW.Zhouz.etalAcon?13.DavisCG,LehrmanMA.Rt~sellDW.Andersono"~agofr~ralc.IsthrouII弘nd.recept~rin. tmIledstud~ofadenoWal.? 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