宫内缺氧对新生大鼠神经元的影响及当归的保护作用

宫内缺氧对新生大鼠神经元的影响及当归的保护作用 宫内缺氧对新生大鼠神经元的影响及当归的保护作用 作者: 岳鹤声 陈旭东 刘红敏 华新宇 余鸿 【摘要】 目的探讨宫内缺氧对新生大鼠海马神经元的影响及当归注射液的保护作用。方法孕期14 d的SD大鼠21只，随机分 为对照组、缺氧组和当归 治疗 组。缺氧组孕鼠自孕第14天开始经尾静脉注射生理盐水8 ml/kg，1次/d，连续7 d，后用低张性缺氧模型致胚鼠宫内缺氧2 h，连续3 d(孕期第14，15，16天);当归治疗组用250 g/L的当归注射液代替生理盐水，其余处理同缺氧组;对照组不缺氧，其余同缺氧组。孕鼠分娩后立即取新生鼠脑，常规 石蜡切片，经神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase，NSE)免疫组织化学 染色后行像分析。结果缺氧组新生鼠海马NSE免疫组化阳性细胞的积分光密度 (Integrated Optical Density，IOD)值较对照组减少〔IOD缺氧组: (4.9? 1.1);IOD对照组: (6.2? 1.6),P0.05〕;当归组新生鼠海马NSE免疫组化阳性细胞的IOD值较缺氧组增加〔IOD治疗组: (6.9?2.6), P0.05〕。结论一定程度的缺氧可刺激海马CA3区神经元变性;当归注射液对宫内缺氧新生大鼠海马CA3区神经元可能具有保护作用。 【关键词】 当归; 缺氧; 神经元; 免疫组化 Abstract: ObjectiveTo study the effect of intrauterin hypoxia on neuron of hippocampus from newborn rats and the protective role of Angelica injection.Methods14d-concving female SD rats(n=21) were divided randomly into three groups:control group(CG)、hypoxia group(HG) and Angelica group(AG).Since the fourteenth days after they were pregnant the rats of HG were injected with normal Saline through caudal vns (within 7 straight days ; 8ml/(kg.d)before intrauterin hypotonic hypoxia (within 3 straight days;on the fourteenth、fifteenth and sixteenth day after pregnancy;2 hours everyday ).Angelica sinensis injection instead of normal saline was injected into the rats in the AG ,and other procedures were the same as the HG.No administration of hypoxia was performed in the CG.Take out their brain tissues immediately of newborn rats after childbirth.The expression of NSE in the hippocampus of newborn rats was studied with immunohistochemistry and the results were analyzed by image processing system.ResultsIOD of NSE positive cells in HG was lower than that of the CG〔IODHG: (4.9? 1.1);IODCG: (6.2? 1.6), P0.05〕;But in AG,them are higher than that of HG〔IODAG: (6.9?2.6),P0.05〕.ConclusionHypoxia can stimulate newborn rats neuron of CA3 of hippocampus into degeneration ,Angelica injection can play a protective role to neuron of CA3 of hippocampus from newborn rats with intrauterin hypoxia. Key words: Angelica; Hypoxia; Neuron; Immunohistochemistry 宫内缺氧是胚胎发育中的常见症，是造成脑瘫，智力发育迟缓及智力低下的重要原因，神经系统是胚胎发育中出现最早的系统之一，且神经元又对缺氧最敏感，因此研究宫内缺氧对神经元的影响具有重要意义。目前国内外缺氧对神经元影响的研究多是在体外状态下进行的，在体的研究大多集中在对生后7,14 d的新生鼠夹闭颈总动脉，给予低氧干预，本实验试图通过建立宫内缺氧模型，观察在体状态下缺氧对新生大鼠神经元的影响，并观察中药当归对缺氧状态的调节，为长期观察缺氧对新生鼠的影响和治疗宫内缺氧提供实验和理论依据。 1 材料与仪器 1.1 材料小鼠抗NSE(CHEMICON公司);多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(棕黄色) 购自武汉博士德生物工程公司。250 g/L的当归注射液购自武汉大学附属第二 医院 药剂科(批号060926)。 1.2 仪器OLYMPUS Bx-70荧光显微镜成像系统(日本OLYMPUS公司);德国莱卡切片机;三气培养箱(美国REVCO公司)。 2 方法 2.1 动物配种与分组健康成年雌性SD大鼠21只(泸州院动物中心提供)，体重220,250 g，分别与一只雄鼠合笼饲养配种，于第2日早晨发现雌鼠阴栓记为妊娠0 d，记下日期，取出雄鼠，单独饲养雌鼠至孕期14 d。将孕鼠随机分为: 对照组5只、缺氧组8只和治疗组8只。 2.2 宫内缺氧新生鼠模型建立缺氧组孕鼠自孕第14天开始在设置好的三气培养箱(氧体积分数130 ml/L，温度: 25?，相对湿度，75%,80%，CO2浓度体积分数: 0.3,0.4 ml/L)内缺氧2h/d，缺氧前1 h经尾静脉注射2 ml生理盐水，连续缺氧3 d(孕14，15，16 d)， 当培养箱控制面板上的数值达到与设置值一致时开始记录缺氧时间;当归治疗组用250 g/L的当归注射液代替生理盐水，其余处理同缺氧组;对照组不缺氧，其余同缺氧组，孕鼠 自然 分娩后立即取新生鼠大脑组织，放入40 g/L的多聚甲醛溶液中固定。 2.3 石蜡切片与免疫组织化学染色每组随机选取20个新生鼠大脑，然后进行常规石蜡包埋，经海马冠状切面切片(片厚4 μm)，切片脱蜡至水，各切片作NSE(1?400) 免疫组化染色(常规链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法)。 2.4 学分析各组间比较用方差分析，两两比较用LSD法检验。统计处理用SPSS13.0完成，P0.05为差异具有统计学意义。 3 结果 3.1 对照组NSE免疫组化反应阳性细胞分布呈区域性，位于锥体细胞层，颗粒层，胞质染为棕黄色，胞质中央为卵圆形或圆形空泡。见图1。 图1 对照组海马CA3区NSE阳性细胞(?)，IHC(SABC), 400× 3.2 缺氧组NSE免疫组化反应阳性细胞分布与对照组相似，与对照组相比缺氧组阳性细胞染色减弱，数量减少(见图2)。其积分光密度值均减小(P0.05)。见表1。 图2 缺氧组海马CA3区NSE 阳性细胞(?)，IHC(SABC)，400× 3.3 当归治疗组NSE免疫组化反应阳性细胞分布与对照组相似，与缺氧组相比缺氧组阳性细胞染色增强，数量增多(见图3)。其积分光密度值增大(P0.05)。见表1。 图3 治疗组海马CA3区NSE阳性细胞(?)，IHC(SABC),400× 表1 各组NSE免疫组化阳性细胞积分光密度(IOD)值。4 讨论 神经系统的早期发生是相当复杂的，也是备受人们关注的胚胎学事件。宫内缺氧是胚胎发育中的常见症，而海马是中枢神经系统对缺氧最为敏感的部位之一，因此，宫内缺氧必然影响胚胎神经系统海马中神经元的生长发育，由于神经元仅能生长不能分裂，这就决定了保护神经元，挽救受损神经元有着重要意义。 研究常常首先要在动物体内进行研究，因此，动物模型的成功建立是医学研究的重要步骤。 本实验在本研究小组前期的宫内缺氧模型的基础上，采用了智能型三气培养箱代替自制的缺氧缸而制成的持续低张性缺氧的动物模型。结果发现，缺氧组新生鼠神经元的NSE免疫组化阳性细胞的积分光密度与对照组之间差异有显着性，说明缺氧后神经元的功能状态发生了改变，提示该宫内缺氧模型是基本成功的，与本实验组的前期方法相比，避免了氧气、二氧化碳浓度、温度和湿度波动对实验结果的干扰，动物在实验中可自由活动，排除了情绪对实验的干扰。 胚胎时期神经元主要来源于神经干细胞的增殖和定向分化，而神经干细胞的增殖受自身基因调控和外来信号调控两种机制的影响[3,4]。经过研究人们发现缺氧作为一种外来信号能诱导神经元死亡，但却能诱导神经干细胞增殖。体外研究发现缺氧能促进NSC的生长和生存，在体研究表明缺血缺氧能增加室下区和齿状回内NSC的数量，本研究小组早期研究发现，低氧可刺激在体胚胎神经干细胞的增殖。Iwai M研究发现，短暂缺血后沙土鼠海马齿状回神经干细胞增殖始于颗粒下层，并最终分化为神经元，海马对缺氧非常敏感，氧浓度降低，复杂的细胞内氧感受系统迅速感受氧分压的变化，诱导适应性机制的出现，以最大程度地减少低氧对脑的损伤。其中关键性调节因子是低氧诱导因子HIF-1，它诱导多种基因表达。需要指出的是，神经系统对低氧最敏感，即使有HIF-1的调节，轻度低氧也可能影响神经元功能。基因表达的上调将导致血管发生、糖酵解、细胞存活以及NSC的生长、增殖并向神经元分化以补充损失的神经元。主要机制有: ?低氧时，血管内皮生长因子 ，促红细胞生成素表达增加，促使神经干细胞克隆数及克隆中的细胞数增加; ?低氧时，BMP调控神经干细胞增殖; ?低氧刺激后，诱导型一氧化氮合酶iNOS在神经干细胞中表达，可能有利于神经轴突生长及建立正确的神经通路，也可能是使神经干细胞从增殖向分化过渡; ?MAPK信号传导途径也参与神经干细胞在低氧时增殖的调控，低氧时，JNK的表达与神经细胞凋亡相关。辛颖等研究发现，新生大鼠缺血缺氧后1 d即可见变性的神经元，3 d变性的神经元增多，5d达高峰，以纹状体受累最重，皮质次之，海马各区易损顺序为CA 1、CA 4、CA 2、CA 3、齿状回，同时GFAP强表达，神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase，NSE)，它是糖酵解过程中催化2-磷酸甘油酸烯醇式丙酮酸的一种生物酶，特异地存在于神经元及神经来源的细胞中，占脑内全部可溶性蛋白的 1.5%，细胞内NSE的分布于免疫组化染色后在光镜下可以看到NSE存在于正常神经元的胞体、轴突和树突。本实验我们用免疫组化方法显示，各组新生鼠脑切片中均有NSE免疫反应阳性细胞。 本实验中，观察到缺氧3d(2 h/d)组新生大鼠免疫组化NSE表达比对照组减弱、阳性细胞减少，积分光密度值减小，说明胚胎海马的神经元出现了坏死和凋亡，导致神经元数量减少，经神经干细胞分化、补充，经缺氧后7 d的补充修复，到出生 时神经元数量仍然明显少于对照组，但神经元的减少究竟是由于神经干细胞向神经元的分化减少还是神经元的坏死或凋亡增加，本实验未进一步深入研究。 当归是最广泛的中药之一。它含有阿魏酸、多种磷脂、人体必需氨基酸和微量元 素等。本实验结果表明，在应用了250 g/L的当归注射液的缺氧的 治疗 组新生鼠大脑NSE免疫反应阳性细胞的积分光密度值较相应缺氧组增多，而NSE又是神经元特异性物，如前所述，轻度的缺氧就能影响神经元的功能，本实验也发现宫内缺氧后新生鼠神经元明显减少，说明当归注射液减弱了缺氧对神经元的损伤，起到了保护作用，其机制有待进一步研究，可能与以下几方面有关[9，10]: ?扩张血管、改善微循环。当归挥发油缓解血管平滑肌的痉挛，扩张血管，从而减少血管阻力，增加外周血流量，改善局部微循环，使胚胎缺氧得以改善; ?对子宫的调节作用。当归抑制子宫平滑肌收缩，降低对宫血管的压迫，增加子宫血流量，从而增加胎盘的物质交换量; ?清除氧自由基和抗脂质过氧化作用。细胞缺血缺氧时发生能量代谢失常、钙超载和氧自由基生成，阿魏酸是当归抗氧化作用的有效成分。综上分析，当归注射液可能通过扩张血管、抑制子宫平滑肌收缩，并通过清除氧自由基，减少神经元的钙超载，从而改善胚胎大鼠脑的缺氧状态，改善神经元的代谢，而起到神经保护作用。 【 参考 文献 】 Horie N，So K,Moriya T,et al.Effects of oxygen concentration on the Proliferation and differentiation of mouse neural stern cells in vitro.Cell MoL NeurobioL,2017,28(6):833. 钟小明,陈旭东,钟 梅, 等. 宫内缺氧对幼年大鼠神经干细胞增殖及学习能力的影响[J].实用儿科杂志，2017，23 (2):146. 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