孕期及哺乳期抵剂量三丁基锡暴露对子代小鼠生殖、内分泌系统的影响

孕期及哺乳期抵剂量三丁基锡暴露对子代小鼠生殖、内分泌系统的影响 孕期及哺乳期抵剂量三丁基锡暴露对子代小鼠生殖、内 分泌系统的影响 分类号: 竹 单位代码: 密 级: 学 号: ?移 岬 ? 矗目. 茹.办孑 硕士学位论文 论文题目。孕其及嘲瓮期懒刍】覆三了甚确象霪 对代小双望殖、勺莼,芦系统酌景多’啕 丁 心 辑 杪 云丁 ; 沙仨 ?. 侈』丁丫丁/ ‖一 /讥吖芒秒二‘尸 分 /; 作 者 专 业 导 师 合作导师 伽 年岁月砷日原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不 包含任何其他个人或集体已经发或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 日 期:皿鱼:当 论文作者签名:曼旌旦交 关于学位论文使用的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论 文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名:墨整坚导师签名: 论文作者签名:翌笠型导师签名:中文摘 要..英文摘要 符号说明 材料与方法?。 结果??。 讨论??。 ? 结论??。 参考文献??.. 致谢攻读学位期间发表的论文目录??.山尔人学硕学位论文. ’?.??.??..?.. ? ;??..??.. ? 山尔人学硕十学位论文 孕期及哺乳期低剂量三丁基锡暴露对子代小鼠 生殖、内分泌系统的影响 ? 研究生: 吕艳朋 导师: 李杰教授 合作导师:司纪亮研究员 中文摘要 有机锡化合物. 是锡元素和碳元素直接结合所形成 的金属有机化合物。通式。.,为烷基或芳香基,主要有烷基锡 化合物和芳香基锡化合物两类。有机锡化合物被广泛用于催化剂、稳定剂、农用 杀虫剂、杀菌剂以及日常用品的涂料和防霉剂等。由于使用广泛,有机锡类化合 物已对全球环境尤其是水体环境造成了严重污染。有机锡化合物可经呼吸道、 消化道和皮肤吸收【。三丁基锡,是有机锡化合物中重要的一 种,已有的研究显示对哺乳动物可产生免疫毒性、神经毒性、生殖毒性等。 目前关于低剂量有机锡化合物暴露的影响研究很少,尤其对子代的影响研究较 少,本实验通过对孕期及哺乳期低剂量暴露的孕鼠及其两代仔鼠的生长发 育的观察及早期神经行为学和生化指标的测量,研究了对两代仔鼠生殖、 内分泌系统的影响。 目的 研究孕期及哺乳期低剂量暴露对两代子鼠生长发育、早期神经行为和 生殖及内分泌系统的影响,以评估孕期及哺乳期低剂量三丁基锡暴露对人类后代 可能产生的影响。 方法山东人学硕十学位论文 .实验动物处理 将清洁级健康妊娠小鼠随机分为、、 染毒组和阴性 / 对照组玉米油,每组只。从妊娠第天起,采用经口灌胃方式进 行染毒,每天次,直至哺乳期结束,灌胃剂量按照每天称量的体重计算。代子 鼠饲养天,同一剂量组内交叉配种。仔鼠在出生后第天断 奶。 .子代行为学指标的观察与记录 仔鼠出生后记录仔鼠数量、雌雄数量及体重,观察有无畸形及死亡情况。仔 鼠出生后第天、、、、、天时称量仔鼠体重,开始观 察仔鼠睁眼情况,开始观察阴道张开情况,开始观察雌鼠初潮情 况。从开始观察包皮分离情况。仔鼠断奶后每周称量一次体重,计算体 和悬崖憎 重增加量。、、、、测量仔鼠翻正时间 ,、测量仔鼠前肢握力实验时 恶反应时间 间,、测量仔鼠垂直网试验时间,、、、、测量仔鼠负 ? 趋地性反射时间,从出生后第天开始观察仔鼠听觉惊愕反射,并记录出现听 觉 惊愕反射阳性时的日龄。 .组织中生物标志物的测定 时各剂量组随机抽取雌雄各只仔鼠,取脑,胸腺、睾丸、附睾或 子宫、卵巢,称重并计算脏器系数。雄性小鼠观察精子活力、精子计数和精 子畸 形率等指标,应用流式细胞术分析代小鼠精子质膜完整性及精子染 色质状态。应用技术分析雄鼠睾丸和雌鼠卵巢中雌激素受体 及雌激素受体.蛋白的表达,及下丘脑中芳香酶蛋白的表达。 结果 本实验结果显示,对孕鼠具有毒性作用: /和 /剂量 组母鼠孕期体重增加量与对照组相比显著降低户姐仿。对孕鼠的毒 性作用不明显,各剂量组母鼠孕期体重增加量与对照组相比无显著性差异。 对妊娠结果的影响:代和代各染毒组母鼠产仔数量、仔鼠哺乳期 死亡率和仔鼠雌雄比例与对照组相比均无显著差异?。 山东人学硕十学位论文 .实验动物行为学的改变 染毒导致仔鼠的早期神经行为发育迟缓, /剂量组在 时及 /和“/剂量组在时翻正反射时间比对照组显著延迟尸 姐?,各染毒组在及时的悬崖憎恶反应时间与对照组相比显著 ? 延迟尸姐?, 上/剂量组前肢握力时间及垂直网试验时间均明显缩短尸 姐酊。各染毒组在时及 /和 ./剂量组在时的负趋 地性反射时间与对照组相比显著延迟姐酊,各染毒组出现听觉惊愕反射阳 性时的日龄与对照组相比显著延迟尸姐?。 .实验动物发育指标及生物标志物的改变 代雄性小鼠各染毒组精子畸形率与对照组相比显著升高. .;各染毒组包皮分离时间与对照组相比显著延迟姐;各染毒组精 子计数有减少的趋势,应用流式细胞术分析表明代雄鼠附睾中精子 质膜形态及染色质结构也发生了显著变化:代 上/剂量组仔鼠包皮分离 时间与对照组相比显著延迟尸姐?;各染毒组仔鼠精子计数与精子畸形率与 ? 对照组相比无显著差异.。分析显示,雌激素受体. 和.蛋白和芳香酶蛋白在睾丸和卵巢内的表达均是随着浓度升高逐渐 减弱,并呈剂量一效应性关系。 结论 、孕期及哺乳期低剂量的暴露可产生母体毒性,使孕鼠体重增加量降低。 并影响子代小鼠的生长发育,对子代小鼠产生内分泌干扰作用,可以使代雌 性小鼠性早熟、代雄性小鼠性发育迟缓。 、孕期及哺乳期低剂量的暴露可导致仔鼠的早期神经行为发育迟缓, 这可能是作为内分泌干扰物对仔鼠内分泌干扰及的神经毒性共同作用 的结果。 、孕期及哺乳期低剂量的暴露影响了子代小鼠精子发生,精子质量、并对 雄鼠附睾中精子质膜形态及染色质结构产生影响。 山东人学硕十学位论文 、孕期及哺乳期低剂量的暴露使雌激素受体.和.在子代睾丸 或卵巢组织内的表达及芳香化酶蛋白在脑、睾丸或卵巢组织内的表达水平降 低。 、孕期及哺乳期低剂量的暴露导致子代小鼠生长发育迟缓、精子质量下降、 早期神经行为发育迟缓,这可能是由于抑制了雌激素合成关键酶及雌激素 ? 受体。 关键词:三丁基锡;生殖毒性;内分泌干扰;围生期;雌激素受体 ? 人学硕十学位论文 英文摘要、肌. :.,, , ..., , . . ? , :? . . : . ,、、、 / , ? .. ,.. 山东人学硕十学位论文 .. ,,,, , , 百 . . ,,,, ., . . , ,, . . . ?伐 伍. , : : ,./ 姚/姐. ... . ? , . / / ./ ./ . ,, / , 、.婶. ,/..灸。鲥 ; ;. ., , 四 . :. .? . . .. , , . ?. . , , ,邪 . :; ; ; ; 山东人学硕七学位论文 符号说明 三丁基锡 ? 二丁基锡 一丁基锡 三丁基氯化锡 氧化三丁基锡 三苯基锡 出生后第天 孕后第天 微克每千克体重 ./。 雌二醇 睾酮 聚氯乙烯 昆明小鼠 乙酰胆碱酯酶 苯酚 卵泡刺激素 促黄体生成激素 环境内分泌干扰物 乙烯雌酚 包皮分离 ? 每日总摄入量 , 每日容许摄入量 世界卫生组织 联合国环境规划署 流式细胞术 海事组织 粮食和农业组织 受体 受体 ? ? 成的金属有机化合物。通式 合物和芳香基化合物两类。 其基本结构有一取代体、二取代体、三取代体和四取代体指的数目。锡产 量中的.%用于合成有机锡化合物。 有机锡化合物主要用途为用作催化剂、稳定剂如二甲基锡、二辛基锡、 四苯基锡、木材防腐刹、农用杀虫剂、杀菌剂如二丁基锡、三丁基锡、三 苯基锡以及日常用品的涂料和防霉剂等。有机锡稳定剂 是热稳定剂中的一种。主要特点是高效,具有高透明性,耐热性优良,并耐硫 化 污染【】。主要用在食品包装膜和其他透明制品上。在自然环境中,这些化 合物与热、光、水、氧、臭氧等的作用,会迅速分解。进入生物体后,小肠或皮 肤易吸收,特别是三取代体最易被吸收,分布在肝、肾和脑等部位。体内以肝为 ? 主的微粒体药物代谢酶系统脱烷基、脱芳香基的速度很快。三取代体的生物学半 衰期为. 天,经脱烷基化成为二取代体、一取代体而难以通过脑.血液关卡, 在脑内留存时间稍长。三丁基锡和三苯基锡对昆虫、细菌、藻类等的毒性大。三 甲基锡和三乙基锡对哺乳动物毒性大。有机锡化合物随碳元素增多其毒性降低, 故三丁基锡和三苯基锡常用于农药和渔具防污剂,增大了向环境的释入量。有机 锡化合物可在海洋环境中长期沉积于底泥中,已有研究显示,在限制有机锡使用 年后的海水和底泥中三丁基锡的含量无明显降低【】。 有机锡化合物例如三丁基锡被广泛应用于轮船的防浊涂料,杀虫剂、防 腐剂和稳定剂等。由于其分布广泛、高疏水性、存在的持久性,生物富集作用和 ? 在食物链中的生物放大作用以及对人类健康和环境的有害作用已引起广泛关注 。人类可以通过多种渠道暴露于有机锡,比如,被有机锡污染的饮食海鲜、 贝类等,蔬菜水果上残留的杀虫剂,经过防腐处理的木材,工业废水以及纺织 品等【】。有机锡化合物是锡和碳元素直接结合形成的金属有机化合物。有机锡化 合物有四种类型:一烃基锡化合物、二烃基锡化合物、三,其中为烃基,可为烷基 三丁基苯甲酸锡;三丁基氯 化锡;三丁基亚油酸锡;三丁基氟化锡;三丁基甲基丙烯酸锡;三丁基环烷酸锡。 由于有机锡化合物的广泛使用,大量的有机锡化合物通过各种途径进入环境系 统,不可避免地对环境产生一定程度的污染。有机锡化合物对人类、其它动物以 及生态系统的危害也越来越受到全球范围内环境、医学和社会学者的广泛关注。 本研究选择三丁基锡作为研究对象,一方面是由于三丁基锡是制造杀虫剂、 消毒剂、防污剂最常用的一种成分;另一方面研究证实三丁基锡可以通过食物链 富集。野生动物和人类组织中检测到的有机锡在. 。等【检测 了加拿大个城市的主要超市的软体动物产品,在被检测的份样品中有 份样品的浓度高达 /以上。所以,人类不可避免的要暴露于。由于 青春期尚未性成熟,生殖器官正在发育,所以,青春期对玎的内分泌干扰作 ? 用会更敏感。在人类肝脏和血液中检测到高浓度的丁基锡,在波兰 人肝脏中检测到丁基锡的含量为每克肝脏湿重. ,而在日本人的肝脏 中为 ‖矿】,在美国人血液中检测到的浓度高达. /。可 以在食物链中蓄积,在台湾海域中的鱼体内检测到浓度高达. /湿 重【】。亚洲和大洋洲国家的居民,估计最大丁基锡暴露量为. 酣,该剂量 比美国和日本人的暴露量低很多。研究证实啮齿类动物在出生前或出生早期 接触性激素可导致性器官及性功能产生永久的不可逆的改变【】。这提示 啮齿类动物在妊娠期和出生早期可能对性激素干扰物质最为敏感。 可使软体动物牡蛎产生畸变,并导致其内分泌失调,还使牡蛎生长延迟,免疫 功 能紊乱【。被认为使啮齿类动物免疫下降,但目前尚无证据表明有机锡对 ? 哺乳动物具有致癌和致畸作用。 本研究选择清洁级健康昆明小鼠为研究对象,实验中测定了子鼠早期神经行 为学指标,测定了精子活性、畸形率,应用流式细胞术检测了精子质膜完整性及 精子染色质状态,应用技术分析了两代子鼠部分组织中芳香化 酶和雌激素受体蛋白的表达水平。 山东人学硕十学位论文 和悬崖憎恶 早期神经行为学指标包括测量仔鼠翻下时间 ,仔鼠前肢握力实验时间,仔鼠垂直网试 反应时间 验时间,测量仔鼠负趋地性反射时间,观察仔鼠听觉惊愕反射等。这些指标反映 了暴露对子鼠早期神经系统发育及运动协调能力的影响。 ? 精子活性和精子畸形率反映了雄性小鼠的生育能力。精子活性即精子活动能 力,精子活动力低下,是导致男性不育主要原因之一。精子活性主要与精液 值、精液粘稠度、精子形态等因素有关,畸形精子是指头、体、尾的形态变异, 头部畸形有巨大头、无定形、双头等;体部畸形有体部粗大、折裂、不完整等; 尾部畸形有卷尾、双尾、缺尾等。精子质膜完整性及精子染色质状态更精确地从 微观上反映了精子的质量情况,本实验将荧光染料的灵敏性和大通量的特 点相结合【 ,使对精子质膜完整性的了解更精确。保持质膜完整是精子成活的 基本条件之一,质膜破损会导致精子内环境的失衡,最终死亡。由于质膜最初 破 损时,精子仍然保持游动能力,在精液常规检测中仍视为正常的精子,而染 色会清晰地划分出已死亡和即将死亡的精子,也会将因质膜破裂已死亡的精 子和 ? 因运动能力差而原地不动的精子区分出来,已有研究也表明精子质膜完整率 与精 子活动率呈正相关。 雌激素受体是核受体超家族 ,成 员,是一类由配体激活的转录因子。与配体结合后发生构象变化,和 形成同源或异源二聚体.参与靶器官、组织的增殖和分化的调控,发挥配 体各自的促进和抑制作用【】。 人和哺乳动物体内雌激素的合成需芳香化酶的参与,而雌激素与特异受体 .和.结合后才发挥生物学效应。芳香酶,即细胞色素芳香化 酶,能催化雄激素转化为雌激素,是雌激素合成最后一步限速 ? 酶。芳香酶是微粒体细胞色素的一种复合酶,由血红蛋白和还 原型辅酶组成,由编码合成,是平衡雄激素和雌激素的关键性的 调节因素【 。免疫组织化学研究表明大鼠垂体芳香酶表达具有性别差异,雌性 大鼠芳香酶的表达还随着动情周期而发生改变,卵巢切除后垂体芳香酶 表达增加,应用可阻断此效应。这一研究表明雌激素可负反馈调节芳香酶的 免疫学终 暴露剂量来研 为更好的评估 .孕期及哺乳期染毒对小鼠妊娠结果的影响研究 在母鼠妊娠第天到哺乳期结束时以不同浓度的对母鼠灌胃染 毒。观察记录母鼠孕期及哺乳期体重增长情况; 母鼠妊娠后观察记录孕期及哺乳期体重增长情况; 观察及母鼠产仔数量,仔鼠出生体重,雌雄比例等的影响,探讨 对母鼠及雌性子鼠妊娠结果的影响; ? ?.孕期及哺乳期染毒对小鼠生长发育及神经行为的影响 观察染毒对代仔鼠体重增长、翻正时间、悬崖憎恶反应时间、前肢 握力时间、垂直网试验时间、负趋地性反射时间、听觉惊愕反射的影响,评 估孕期及哺乳期暴露对子代小鼠生长发育及早期神经行为发育的影响; 仔鼠在时断奶,断奶后雌雄分笼饲养。在时各剂量组随机 抽取只,通过测定小鼠的体重增长情况、主要脏器重量及其系数以探讨 在孕期及哺乳期暴露对子代小鼠生长发育的影响; ?.孕期及哺乳期染毒对代雄性小鼠生殖、内分泌系统的影响 ? 通过观察代小鼠包皮分离时间、睾丸重量及其脏器系数、附睾精子计数、 精子畸形率和精子活力来探讨对代雄性小鼠生殖系统的影响; 应用技术,检测代小鼠睾丸组织中的雌激素受体?,雌 激素受体及芳香酶的蛋白表达; 应用流式细胞术,检测代雄性小鼠精子的质量、活性及染色质情 山东人学硕学位论文 况。 ?.孕期及哺乳期染毒对代雌性小鼠生殖、内分泌系统的影响 通过观察代雌性小鼠阴道张开时间,初潮时间,来研究对代雌 性小鼠生殖系统发育的影响: 应用.技术,检测代小鼠卵巢组织中的雌激素受体,雌 激素受体及芳香酶的蛋白表达; .孕期及哺乳期染毒对砣代雄性小鼠生殖、内分泌系统的影响 通过观察代小鼠包皮分离时间、睾丸重量及其脏器系数、附睾精子计数、 精子畸形率和精子活力来探讨对代雄性小鼠生殖系统的影响; 应用技术,检测代小鼠睾丸组织中的雌激素受体伐,雌 激素受体及芳香酶的蛋白表达; .孕期及哺乳期染毒对代雌性小鼠生殖、内分泌系统的影响 通过观察代雌性小鼠阴道张开时间,初潮时间,来研究对代雌 性小鼠生殖系统发育的影响; 应用?技术,检测代小鼠卵巢组织中的雌激素受体,雌 激素受体及芳香酶的蛋白表达; 材料与方法 实验试剂与主要仪器 ? .实验试剂 纯度?%美国公司,玉米油,台盼蓝美国公司, 薯红,焦碳酸二乙酯购自上海生工生物工程公司;鼠单克隆抗 体.鼠单克隆抗体??,芳香酶兔多克隆抗体 ,争抗体购自公司;辣根过氧化物酶 山东人学硕学位论文 ,标记的山羊抗兔、抗鼠二抗购自公司; 显色试剂、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺.、四 甲基乙二胺,,’,’一,、甘氨酸、 丽春红 、巯基乙醇、’.二氨基联苯胺 ,,、钒酸钠、碘乙酸、无水焦磷酸钠、苯甲基磺酰 ? ,、 、 氟 均为美国公司产品;吐温、牛血清白蛋白 ,,为公司产品;线感光胶片,美国公司产品; 由美国 膜为美国公司产品; 公司生产。一 和 均为德国 公司生产。为美国公司产品。碘化丙锭,、吖啶橙., 购自公司。其它试剂均为国产或进分析纯试剂。 ? .主要仪器设备 超低温冰箱 美国 公司 .磁力搅拌器 上海司乐仪器厂 一.电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 .放免丫计数仪 中国科技大学中佳公司 .低温离心机 德国 公司 .型电热恒温干燥箱 上海精宏实验设备有限公司 扫描仪 德国公司 ? .电动玻璃匀浆机 宁波新芝生物科技股份有限公司 垂直电泳槽 北京市六一仪器厂 转移电泳槽 北京市六一仪器厂 .转移电泳仪 北京市六一仪器厂 实验室级专用超纯化水机 台湾颐洋企业发展有限公司 尔人学硕十学位论文 北京市六一仪器厂 上海电子天平仪器厂 苏州净化设备公司 上海天平仪器厂 日本三洋公司 电子天平 上海梅特勒.托利多有限公司 型酶标仪 芬兰雷勃分析仪器有限公司 超速离心机 美国 公司 ? 型摇床 德国公司 江苏海门市麒麟医用仪器厂 旋涡混合器 .型脱色摇床 北京市六一仪器厂 电子游标卡尺 青海电子衡器厂 多功能冷冻水平离心机 德国 有限公司 多功能数字图象分析仪 美国公司 光学显微镜 日本公司 恒温水浴箱 上海医疗器械七厂 秒表 公司 微量移液器 公司 荧光分光光度计. 日本岛津公司 粤华牌光摄影暗盒 汕头市粤华医疗器械有限公司 自动平衡微型离心机 北京医用离心机厂 实验方法 ? .实验动物及处理 选择清洁级健康成年昆明小鼠,雄性只,体重孓 ,雌性只,体 重 。由山东大学实验动物中心提供许可证号鲁。 适应一周后,按雌:雄为:比例同笼配种。此后每天分别于::时及下 山尔人学硕十学位论文 午::检查阴道栓,出现阴道栓者记为妊娠第天 。将妊娠 小鼠随机分为组,分别为、、 染毒组和一个阴性对照组玉 / 米油,每组只。从妊娠第天起,采用经口灌胃方式进行染毒,每 天次,直至哺乳期结束,每天调整的灌胃量,灌胃剂量按照当天称量的 体重计算。仔鼠在出生后第天断奶。动物饲养温度??, 湿度?%,自然光照,普通饲料喂养,玻璃瓶喂水。 代子鼠饲养天,至性成熟,每组每窝随机抽取雌鼠只,雄鼠. 只,按雌:雄比例为:比例同一剂量组内交叉配种,防止近亲交配。此后每天 分别于:~:时及下午:检查阴道栓,出现阴道栓者记为妊娠 第天 。仔鼠在出生后第天断奶。 .孕鼠及子鼠发育指标的测量 .. 染毒对孕鼠孕期体重变化及孕期长短的影响 雌鼠怀孕后每日称量其体重,分娩后第一天称量其体重。计算孕鼠体重变化 ? 及孕期长短。 .. 染毒对孕鼠产仔只数、仔鼠死亡率及雌雄比例的影响 仔鼠出生后 内计数产仔数量,仔鼠死亡数量。根据肛门生殖器距离判 断雌雄,计算雌雄比例。并观察胎鼠的头部形状、眼、耳、鼻、口、舌、腭、 上 下颚、唇裂、眼睛、四肢、指趾等是否有畸形,及有无血肿、肛门闭锁、疝 等外部特征。 .. 染毒对仔鼠体重变化的影响 仔鼠出生后第天,、、、、、 时称量其体重,并记录。 ? .. 染毒对子代雌性小鼠体重增长的影响 仔鼠在断奶,断奶后每周称量一次体重,即、、、 及时各称量一次,计算体重增加量。 山东人学硕学位论文 .子鼠行为学指标的测量 .. 染毒对仔鼠翻正时间的影响 翻正时间的测量方法: 、、、时测量仔鼠翻正时间和悬崖憎恶反 ? 应时间,每只仔鼠每个指标连续测量次,取均值。翻正时间的测量方法:将仔 鼠仰卧四肢向上,背向下在水平的桌面上,测量其由仰卧翻到正卧四肢均 向下,背向上所需要的时间。并进行评分:分:?,分:?, 分:?,分:?,分:? .. 染毒对仔鼠悬崖憎恶反应时间的影响 悬崖憎恶反应时间测量方法:将仔鼠放在桌面上,使其头部及前肢贴在桌边 上,同时开始计时,当仔鼠离开桌边至身体与桌边平行的时,停止计时,该时 间 为该仔鼠的悬崖憎恶反应时间。每只仔鼠每次最大允许时间为秒,仔鼠睡着 或坠落的均记为秒。 ? . 染毒对仔鼠垂直网测试时间的影响 垂直网测试方法:在仔鼠出生第、天时进行。将仔鼠小心地放到一张 垂直网上,记录从放上到掉下来的时间。 .. 染毒对仔鼠悬吊试验的影响 在仔鼠出生第、、、、及天时进行。使仔鼠双前肢抓住一悬空 离桌平面高度 的水平电线直径约. ,记录仔鼠由抓握电线开始至 掉下的时间,记录时间单位为秒。 .. 染毒对仔鼠负趋地性反射时间的影响 负趋地性反射 的测量方法:在仔鼠出生第、、、 ? 及天时进行。将仔鼠头向下放在一块倾斜度为。的铁丝网平面上,测定 动物恢复重心的能力,观察动物从放上平面到回转。并开始往上爬所需的时 间,记录单位为秒。 . 染毒对仔鼠听觉惊跳反应的影响 天开始进行 退,突然跳起 .. 染毒对子代雌性小鼠阴道张开时间的影响 从时开始观察仔鼠阴道张开情况,并记录张开时的日龄。 .. 染毒对子代雌性小鼠初潮时间的影响 仔鼠阴道张开后第天开始观察初潮情况,观察方法:每天固定时间: .:以.%的胎盘蓝溶液山冲洗阴道.次,做成涂片,晾干后 倍镜下观察,首次出现脱落有核上皮细胞的即为初潮。记录初潮时的日龄及 体重。 .. 染毒对子代雌性小鼠脏器系数的影响 时,各剂量组随机抽出雌性小鼠,仔鼠处死后,取脑、胸腺、子宫 ? 及卵巢并称重,计算脏器系数。 脏器系数:堕霉霪掣×% 体重 . 染毒对子代雄性小鼠生殖功能影响指标的测定 .. 对子代雄性小鼠包皮分离时间的影响 从时开始观察包皮分离情况,记录包皮分离时的日龄。 .. 对子代雄性青春期小鼠脏器重量及脏器系数的影响 ? 时,各剂量组随机抽出雄性小鼠,处死后,取脑、肝脏、脾脏、 肾脏、胸腺、睾丸和附睾,并称重。计算脏器系数。 .. 对子代雄性小鼠精子计数和精子畸形率的影响 精子计数:山东人学硕十学位论文 取之前.?保存不超过周的右侧附睾尾,加 生理盐水后迅速水浴 至室温。再用眼科剪将其纵向剪开,于室温静置分钟。然后用吸管吹打 次,用目过滤筛滤除组织碎片后制得精子悬液。用吸管取一滴填充至血细胞 计数板的两个计数池内,静置分钟。先将计数板置于低倍镜下找到计 数板中心方格,选择精子分布较均匀的计数池,再转换成高倍镜进行计 ? 数。于高倍镜下计数中央大方格中的个中方格对角线个或角个加中间 个内的精子。为避免重复和遗漏,在计数时应按一定的顺序进行,压在双线 上的精子只计两条边,即只计上方和左侧线上的精子,而压在下方和右侧线 上的 精子均不计入。不完整的精子只计精子尾。将个中方格内的精子数相加,记 为 ,按照下列公式计算每克附睾尾所含精子数: 每克附睾尾精子数儋。寄篓笔罢 精子畸形率 取精子计数时制得的精子悬液一滴,稀释倍后涂片,于空气中彻底干燥。 然后用甲醇固定 以上,再干燥。用.%薯红染色 ,用水轻冲,晾干。 ? 在低倍镜下找到背景清晰、精子重叠较少的部位后,换用高倍镜 顺序检查精子形态。计数结构完整精子,精子有头无尾轮廓不清或头部与其 他精子或碎片重叠,或明显是人为剪碎者,均不计算。每只小鼠随机检查 个精子不少于个。畸变精子的判定参照相关文献,畸形精子的类型 可分为无定形、无钩、香蕉头、胖头、双尾、双头等。计算精子畸形率。 .. 染毒对子代雄性小鼠精子质量的影响 精子活力测定颈椎脱臼处死小鼠后,立刻取左侧附睾,置预热的 中纵向 剪开,用吸管吹打次制成精子悬液。以上操作均在?恒温水浴箱中进行。 在室温条件下,立即取一滴悬液置于清洁载玻片上,盖上盖玻片,镜检,时间 不 超过分钟。目测活动精子数占视野内精子总数的百分率,按照从划分为 个等级,对应活动精子所占百分率。要求整个过程由同一人完成,需在较短 时间内更换多个视野,对精子活动等级做出总体评估。 硕学位论文 精子计数及精子畸形率测定方法同第一节中精子计数及畸形率的测定方法。 ..应用流式细胞术测定精子质量 精子质膜完整性分析 ? 颈椎脱臼处死小鼠后,立刻取左侧附睾,置预热的? 中纵向 剪开,用吸管吹打次制成精子悬液。取“上述精子悬液。与终浓度为 的. ./的和溶液充分混匀后,避光孵育,加 /离心 去除未结合的染料,加适量的调节 /, . 精子密度为/,上机检测精子质膜完整率和平均荧光强度。 精子染色质状态分析 颈椎脱臼处死小鼠后,立刻取左侧附睾,置预热的? “中纵向 剪开,用吸管吹打次制成精子悬液。取山上述精子悬液与终浓度为“/ 的溶液充分混匀后,?避光孵育 ,加 的. /, ? . /离心 去除未结合的染料,加适量的调节精子密 度为 /,上机检测精子红色、绿色荧光的含量和。 结果判定标准 测定图中为绿色荧光,为红色荧光,通过分析各象限的比率 可以了解精子所带荧光的颜色和含量。 精子质膜完整性分析 可以通过质膜与染色质结合发绿色荧光,只有通过破损的质膜才 ? 能进入精子内部淬灭,并与结合发红色荧光,因此为活精 子,为死精子,为精子处于从活到死的过渡状态。 精子染色质分析 由于与双链核酸结合发绿色荧光,与单链核酸结合发红色荧光,因此右色荧 光的染色质单链 含量 含量的动物 样品处理方法: 称取约. 左右睾丸组织,用剪刀剪成碎末,按质量体积比:加 ., 入预冷的匀浆缓冲液% ., . ,, ,蛋白酶抑制剂. ,, 和 碘 / ,磷酸酶抑制剂 乙酸,采用电动玻璃匀浆器冰浴中匀浆, 上下匀浆次。然后 将匀浆液转移至离心管中,在冰浴中放置 。?,, 离心 ? ,小心吸取上清,转移至管中分装,作为组织上清样品备用。 离心得到的沉淀用适量匀浆缓冲液重新悬起,用振荡器混匀,作为组织沉 淀样品备用。样品都保存在.?低温冰箱中。 ..测定卵巢中雌激素受体及雌激素受体含量的动物 样品处理方法: 称取约. 左右卵巢组织,用剪刀剪成碎末,按质量体积比:加 入预冷的匀浆缓冲液% ., ., . , , ,蛋白酶抑制剂. ,碘 ,磷酸酶抑制剂 , 和 / ? 乙酸,采用电动玻璃匀浆器冰浴中匀浆, 上下匀浆次。然后 将匀浆液转移至离心管中,在冰浴中放置 。?,, 离心 ,小心吸取上清,转移至管中分装,作为组织上清样品备用。 离心得到的沉淀用适量匀浆缓冲液重新悬起,用振荡器混匀,作为组织沉 淀样品备用。样品都保存于.?低温冰箱中。山尔人学硕十学位论文 ..测定脑中芳香酶含量含量的样品处理方法: 称取. 左右的脑组织,按质量体积比:加入预冷的匀浆缓冲液 ,, , , ,.,. , / ,冰浴中匀浆, ,取上清。分装后保存于? 次,然后?, 离心 低温冰箱中。 ..蛋白含量测定 利用喇蛋白定量试剂盒,分别测定经过上述两种方法处理的样品中蛋 白含量。 具体步骤:待测样品先按:比例稀释。分别取“蛋白标准液分别含 有标准蛋白 、 、 、 、 、 、 和 预先稀释过的样品,加入到孔板中,每个做个平行样。然后每孔分别 加入 混匀。用保鲜膜包裹 工作液试剂:试剂:,震荡 ? 孔板,放入培养箱中?孵育 。然后冷却至室温,用酶标仪在 处测定各孔吸光度,根据蛋白标准液含量及其吸光度绘出标准曲线,计算出 样品蛋白含量。 蛋白定量标准曲线: ? ..测定雌激素受体及芳香酶含量 电泳试剂的配制 、交联剂:甲叉双 /浓盐酸为 , 、浓缩胶缓冲液. ,.,.: :. ;加水至 ; 。配制后用试纸测试 为. 、%十二烷基硫酸钠 ,常温保存。 ,加水至 、上样缓冲液: :%:. 浓缩胶缓冲液:. ; ;一巯基乙醇.:. %甘油纯甘油.,水.:.;%溴酚兰:.;加水.,总体 积:.。 、%过硫酸胺 加水 。 ,,现用现配. 、电泳缓冲液,.: ? :. 。 ;甘氨酸:.;: ;加水至 、 染液 考马斯亮蓝:. ;甲醇:;冰乙酸:;加水至。 。 脱色液,甲醇: ;冰乙酸: ;加水至: : 、分离胶 : %分离胶::. 分离胶缓冲液:. ;%: 。 ;:. ;%:肛;: ;总量 : ,总 、%浓缩胶 浓缩胶缓冲液:. ;%: :%: ;.:. ? ;: ;:. 、: 嘶:. . ;加水至 ; ;浓: ;调至. 、: ,加. ~.%,【加“ /水、转印缓冲液: :. :加水至 。 ;:. ;甲醇: 、丽春红染液储存液:。使用 丽春红: ;三氯乙酸: ;磺基水杨酸: ;加水至 液:储存液:水: 步骤 、准备玻璃板:将玻璃板超声振洗后用蒸馏水煮玻璃板,进一步去除表面的 胶, 橡胶皮条用?水洗。酒精棉球擦洗,要保证有两个面干净消毒,朝里 对放,自然晾干。 、酒精棉球擦洗橡皮套内侧,擦净孔梳子,组装玻璃板。 、用%琼脂糖封边,先封未插入橡皮套一侧玻璃板,然后翻转再封另一侧。 、将组装好的玻璃板放入电泳槽中,矮板朝向负极,对角线拧紧。 ? 、配置 %的分离胶 用 的枪头引流倒分离胶灌注至离矮板上缘约锄距离梳齿下缘, 加 水饱和的正丁醇,然后聚合约分钟,凝胶面与正丁醇界面间出现 一条折光线时,表示聚合完成。 、从玻璃板较高一侧倾斜倒去正丁醇,然后用滤纸条吸干残留的正丁醇。配 制 。 %浓缩胶 、插上梳子,再拧紧,用枪头从孔大的一侧加浓缩胶,用吸管从玻璃板上缘加 满孔,梳孔下有气泡时刻倾斜电泳槽赶出不断补加至聚合完好。聚合 分钟后拔掉梳子,在孔中倒入电泳缓冲液,用 塑料注射器针头扶直胶孔。 、准备样品及标准分子量蛋白上样量约鹇蛋白 ? 样品与上样缓冲液、蒸馏水混合,置于薄泡沫上于沸水中煮分钟,取出冷 却至室温。 、上样: 上样前,用注射器吸出孔中的电泳缓冲液,用微量注射器加样。上样完后, 先在样品上加少量电泳缓冲液,以免大量加进缓冲液时冲乱样品表面。如有 空置、在瓷盘中提前泡好硝酸纤维素薄膜甲醇过膜后再泡,滤纸,分钟以上。 电泳到达终点时,关掉电泳仪开关,回收电泳缓冲液,打开电泳槽,取出玻璃 板, 拆开橡皮套,轻轻掰开玻璃板,用刀片切去浓缩胶,在一侧切去一个角作为标 记, 切去兰色带以下的胶。 、组装三明治膜水下操做,尽量用手,不用镊子,防止弄破胶、滤纸和硝纤 膜 将塑料格框平铺,加海绵挚提前用手赶走气泡,避免导电不良,放两张 处理好的 的滤纸要一张一张的放,尽量赶走所有气泡,对齐,放已 ? 处理好的硝酸纤维素膜从负极向正极转印,故应靠近正极:切去一角以方便 辨 认加样顺序及正反;小心放上凝胶,再放上两张滤纸,放一海绵垫,最后夹紧 塑料格框。放置顺序为:正极海绵垫张滤纸一硝酸纤维素膜~凝胶~张滤 纸~海绵垫负极。 、将三明治膜置于转膜盒中,倒入升转印缓冲液,转印小时,要求稳压 。 、连接并打开冷凝循环水,进水管接正极侧,打开电源,恒压,持续小时。 、拆开三明治,取出硝酸纤维素膜,小心放入塑料盒中,倒入少许的丽春红染 液,随即到出,看膜上是否有条带为非特异性条带,如没有条带则不用再加 抗体。 ? 、先用双蒸水冲洗膜,然后用冲洗条带直至洗去红色为止. 、用%脱脂奶粉封闭缓冲液毫升封闭,震摇分钟,以减少非特异性 蛋白着色。脱脂奶粉封闭缓冲液: ,混匀,现用 脱脂奶粉至 现配。山东人学硕十学位论文 封闭缓冲液中:稀释,充分混匀,倒入装有 、加“一抗于 硝纤膜的塑料盒中,充分浸泡硝纤膜,盖上盖,?过夜。 、取出硝纤膜,放入塑料盒中,用 振荡洗涤~分钟,次。 封闭缓冲液中充分混匀,加入硝纤膜, 、加斗二抗:稀释与 充分浸泡室温小时。 、取出硝纤膜,放入塑料盒中,用 振荡洗涤,~ ,次。 曝光 中,用 .取出硝纤膜放入 的发光液、液各./. 枪头 反复浇硝纤膜约分钟,取出硝纤膜,吸干过多液体,保鲜膜包裹硝纤膜,置于 曝光盒中曝光,显影、定影。 、曝光胶片,用水充分洗涤,?干后扫描图像保存备进一步分析。 扫描:打开 击预览, 对预览区域扫描,存贮为格式的图片。 分析的电泳图片 .用凝胶定量软件 执行步骤: .创建泳道: .打开要分析的电泳图片。 会 .选择“ ’’。如果电泳图片比较标准, 自动识别出每条电泳泳道的位置,而且将各个泳道的路径用一条红线标画出 来; 通过“. 下级各个子菜单提供的功能对泳道框架位置、大小等进 行调节;调节方法就是通过鼠标的拖放来实现。在不能自动识别的情况下, 就会弹出对话框告诉它不能识别泳道。这时需要手工绘制电泳泳道。 ? ’’来实现。用鼠标电泳图片 方法和上面一样,同过“ 上顺着待标记的泳道的中轴线拖放绘制出该泳道的标记红线。 .不同泳道的背景排除: 选择“ ?命令。选择该命令后,鼠标即变成一个绿色 打 的“一,将鼠标移到打算进行背景排除的泳道,点击左键,其中“ 文 对话框 除 .创建条带: .电泳条带的识别:识别方式同样分为自动识别和人工识别。自动识别的 时候选择“? 会自动弹出一个“ ...命令。这时 ? ”的对话框。 .高斯建模与结果分析: 进行高斯建模:执行“”命令,在 弹出的对话框中钩选“,对所有泳道进行高斯建模。执行完高斯建模以后 使用“. ”命令观察结果。最后,计算、记录,“ 的值。 统计分析 数据以表示,用.软件包对数据进行处理分析。采用单因素方 差分析 ,若方差齐,组间两两比较采用检验,若方差 不齐,则采用’ 检验。.为差异有统计学意义。雌雄比例及围 生期死亡率采用检验;悬崖憎恶反应时间×后经对数转换,进行单因素方差 分析。.为差异有统计学意义。 ?响 照组相比显著降 相比无显著性差 、仔鼠雌雄比例 与对照组相比均无显著差异??。见表..、表.. 表.. 染毒对母鼠孕期和哺乳期体重、孕期、雌雄比例的影响,孑? ? 注:与对照组/相比,口.?雌雄比例经检验.:一:出生后第天母鼠 与仔鼠体重之和与妊娠第天的母鼠体重之差 表.. 染毒对母鼠孕期和哺乳期体重、孕期、雌雄比例的影响,? ? 注::出生后第天母鼠与仔鼠体重之和与妊娠第天的母鼠体重之差 .. 染毒对母鼠产仔数量、仔鼠睁眼时间及围生期死亡率的影响 两代染毒组母鼠产仔数量及仔鼠哺乳期死亡率与对照组相比均无显著差异 .仿;代肛/和腭/剂量组仔鼠睁眼时间比对照组显著延迟 尸.?。代只有肛/剂量组仔鼠睁眼时间比对照组显著延迟尸山东人学硕十学 位论文 产仔数量只 睁眼时间 死亡率死亡/存活 染毒剂量岖瓜 ? 注:‘与对照组/相比,.;死亡比经检验.,无显著性差异 表.. 母鼠产仔数量及仔鼠睁眼时间及围生期死亡率的影响,孑? ? 注:‘与对照组眺相比,《.;死亡比经检验..,无显著性差异 .. 染毒对仔鼠体重的影响 代肛/和 /剂量组在、、和时体 重与对照组相比显著降低尸.,.,各染毒组在、和 时体重与对照组无显著差异酊,代 /剂量组在时体重 与对照组相比显著降低姐?各染毒组在、、、、 和时体重与对照组无显著差异.?。见表..、表.. 表.. 染毒对代仔鼠体重的影响孑? 注:’与对照组 /相比,.;”与对照组 ‖【相比,尸..口 表.. 染毒对代仔鼠体重的影响? 山东人学硕学位论文 剂量 仔鼠体荤 峙,【 .. .::. .:. .. .::. .士. .?. .士. .:. .伍印. .::. .士. .柱. .士. .::. .:. .士. .. .士. .士. .. .. .士. .印. .士. .士. .. .. ? .. 染毒对仔鼠体重增长的影响 代仔鼠 /和 ./剂量组到、到 的体重增加量与对照组相比显著降低《.,.。“/剂量组 到的体重增加量与对照组相比显著降低尸姐?;各染毒剂量组 到,到的体重增加量与对照组相比无显著改变口酊。 代仔鼠各染毒剂量组仔鼠在哺乳期的体重增加量与对照组相比无显著差异 尸 。见.表..、表.. 表.. 染毒对仔鼠体重增长的影响? ? 注:‘与对照组 /相比,.,”与对照组 /相比,. 表.. 染毒对仔鼠体重增长的影响? .. 染毒对仔鼠翻正时间的影响仔鼠各染毒组在、时的翻正时间与对照组相比无 显著变化 ?, /剂量组在时及 /和 /剂量组在 时翻正试验时间比对照组显著延迟.酊。见表.. 染毒剂量 代仔鼠翻正反射评分 。..士: 。.. ..士:,..幸..士,..。,..啦:。.. 。 .土. .士.幸 .士.? .士. 注:’与对照组 /相比,. .. 染毒对仔鼠悬崖憎恶反应的影响 各染毒组在及时的悬崖憎恶反应时间与对照组相比显著延迟 .。姐酊, /和 剂量组在时悬崖憎恶反应时间 比对照组显著延迟尸如.,., /剂量组在时悬崖憎恶反 应时间比对照组显著延迟尸.?。见表.. 表.. 染毒对仔鼠悬崖憎恶反应时间的影响? ? 注:’与对照组 /相比,. 相比,.;”与对照组 .. 染毒对仔鼠前肢握力实验的影响 肛/剂量组在时前肢握力实验时间比对照组有显著差异 .各染毒组在时的前肢握力实验时间与对照组相比无显著变化 山东人学硕十学位论文 傀?。见表.. 表.. 仔鼠前肢握力实验结果? 仔鼠前肢握力时间 染毒剂量 / .?. .?..?..?..?. .?. .?.’ .. 注:’与对照组 /相比,. .. 染毒对仔鼠垂直网试验时间的影响 /剂量组在时垂直网试验时间比对照组显著缩短姐仿, 各染毒组在时的垂直网试验时间与对照组相比无显著变化尸.。 见表.. ? 表.. 代仔鼠垂直网试验结果? 注:。与对照组 ‖相比,. .. 染毒对仔鼠负趋地性反射时间的影响 ? 各染毒组在时及 /剂量组在时的负趋地性 /和 反射时间与对照组相比显著延迟.酊,各染毒组在、、 时的垂直网试验时间与对照组相比无显著变化。见表.. 表.. 代仔鼠负趋地性反射时间结果?山东人学硕十学位论文 染毒剂量 代仔鼠负趋地性反射时间 /.. ... .. ... ....士. .士. ... .:. .士...?...? ... ... 。. .士..士. .士. .. ... 注:‘与对照组‘/相比,.; .. 染毒对仔鼠听觉惊愕反射的影响 在孕期及哺乳期染毒导致仔鼠各染毒组出现听觉惊愕反射阳性时的 日龄与对照组相比显著延迟妃?见图.. 图.. 代仔鼠听觉惊愕反射结果 .‘与对照组 瓜相比,. .. 对雄性小鼠包皮分离时间和精子计数、精子畸形率的影响 代各染毒组仔鼠包皮分离时间与对照组相比显著延迟奶.;各染 毒组仔鼠精子畸形率比对照组显著升高尸弧.;各染毒组仔鼠包皮 分离时体重与对照组相比无明显差异尸.;各染毒组精子计数有减少的趋 势,但与对照组相比无统计学意义.。代 /剂量组仔鼠包皮