NG2参与炎症反应介导的肾小球系膜细胞增殖

NG2参与炎症反应介导的肾小球系膜细胞增殖 NG2 参与炎症反应介导的肾小球系膜细胞 增殖 5 (华中科技大学同济医学院附属协和医院肾内科，武汉) 摘要:目的 研究 NG2 在肾小球炎症因子产生与系膜细胞增殖中的作用，并探讨其作用的分 子机制。 方法 (1) 培养大鼠肾小球系膜细胞(RMC)，LPS 刺激、Dexamethasone 干预及 siRNA 转染，免疫荧光、PCR、实时定量 PCR 和 Elisa 法检测 NG2、TNF-α和 IL-1β的 10 达，MTT 法检测 RMC 增殖。(2) 新生乳鼠，LPS 刺激，免疫组化、实时定量 PCR 和 Elisa 法检测 NG2、TNF-α和 IL-1β的表达。 结果 (1)大鼠肾小球系膜细胞表达 NG2，LPS 刺激 后肾小球系膜细胞 NG2 表达显著增加，炎症因子 TNF-α和 IL-1β表达上调，且系膜细胞增 殖作用增强。(2) Dexamethasone 可抑制 NG2 和 TNF-α、IL-1β的上调，以及 RMC 增殖水 平的上调。(3) siRNA 下调 NG2 表达后，LPS 刺激引起的 TNF-α、IL-1β的表达下调，RMC 15 增殖水平下调。 结论 NG2 参与肾小球炎症反应的激活，介导炎症因子在肾小球系膜细胞 的表达和释放，并通过炎症因子促进系膜细胞的增殖。 关键词:NG2 蛋白多糖; 炎症因子;肾小球系膜细胞 中图分类号:S941.42+7 NG2 involved in the inflammation mediated mesangial cell 20 proliferation SHI Xiuyan, XIONG Jing (Department of Nephrology，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022) Abstract: Objective To explore the role of NG2 proteoglycan in the proliferation of mesangial 25 cells induced by inflammation. Method Cultured rat mesangial cells (RMC) was stimulated by LPS, and the expression of NG2, TNF-α , IL-1β was measured by real-time PCR, western blot and immunofluorescence, and cell proliferation assay was detected by MTT. Dexamethasome and NG2 siRNA was used to treat the cells with LPS stimulation and observe the changes of above indexes. In vivo experiment, newborn mice were injected by LPS, and the expression of NG2 and 30 inflammation factors was observed. Results The expression of NG2, TNF-α and IL-1β increased in RMC and the proliferation of RMC increased after LPS stimulation. Dexamethasone and NG2 siRNA treatment can ameliorate the produceion of inflammation factors and the proliferatin of RMC. Conclusion NG2 proteoglycan may be involved in the proliferation of mesangial cells induced by inflammation. Key words: NG2 proteoglycan; inflammation factor; mesangial cells 35 0 引言 NG2 是一种重要的硫酸软骨素蛋白多糖大分子，由 1 条相对分子质量为 300000 的核 心蛋白和 1 条硫酸软骨素链组成[1]。NG2 首先在中枢神经系统的少突胶质前体细胞(OPCs) 和周细胞中发现，在调节神经系统的发育如神经细胞迁移和轴突生长等过程中发挥了重要的 40 基金项目:新教师基金(200804871116) 作者简介:史秀岩 (1978.12.21) 女 主治 慢性肾脏病防治 通信联系人:熊京(1976-)，女，主治医师，研究方向:糖尿病肾病的发病机制. E-mail: xiongjing76718@126.com -1- 作用[2]。在祖细胞和肿瘤生物学的研究中，发现 N G 2 作为一个完整的跨膜蛋白，通过调节 细胞内外分子的相互作用，参与了许多细胞功能，如调节细胞增殖和迁移等[3-5]。 我们的前期研究大鼠肾组织及大鼠肾小球系膜细胞系中检测到 NG2 的表达[ 6,7]，且在糖 尿病大鼠模型中发现肾小球系膜区 NG2 表达较正常大鼠明显增多， 并有时序性变化，提示 45 NG2 可能与肾小球系膜细胞增生及肾小球疾病的发生、发展关系密切[8]。为进一步探讨 NG2 在肾小球疾病中的作用 ，本研究拟在已有工作基础之上，通过离体细胞及在体动物实验， 研究 NG2 在肾小球炎症因子产生与系膜细胞增殖中的作用，并探讨其作用的分子机制，为 临床早期阻断肾小球系膜细胞增生及肾小球硬化的进展，寻找新的药物作用靶点。 1 与方法 材料 50 1.1 大鼠肾小球系膜细胞 HBZY-1(武汉大学细胞保藏中心)， 2000TM 转染试剂(美国 Invitrogen)，SiRNA(广州锐博)， PCR 试剂盒(美国 Invitrogen)，Elisa 试剂盒(上海研吉)， MTT 试剂盒(美国 Sigma)，LPS(美国 Sigma)，兔抗 NG2 多克隆抗体(美国 Chemicon)， FITC 标记的羊抗兔多克隆抗体及羊抗兔辣根过氧化物酶 IgG (美国 Pierce)。新生 1天的 Wistar 幼鼠购自华中科技大学实验动物中心。在处理和照顾动物时，华中科技大学动物公共照顾和 55 使用委员会采用了用于动物研究国际准则。 细胞培养和实验分组 1.2 RMC 以 2X105 个细胞,孔种植于 6 孔培养板，用含 10,胎牛血清、100 U,ml 青霉素 和 100 U,ml 链霉素的低糖 DMEM 培养液(D-glucose 5.5mmol,L)，在 37? ，5, CO2 孵 60 育箱中培养。细胞 80,融合时换用低血清(1,胎牛血清)低糖 DMEM 培养液培养 24h，使细 胞同步于 GO 期。然后将细胞分为 3 组:对照组，LPS 组(LPS 1ug/ml)和 LPS+Dex 组(LPS 1ug/ml, Dexamethsone 10nmol,L)。每组设 3 个复孔，孵育 24h 后收集细胞和上清。 动物实验分组 1.3 实验中总共用了 20 只幼鼠(1 天大)。实验组 10 只幼鼠分别腹腔注射 40ul LPS(生理 65 盐水溶解，1ug/ul)。对照组 10 只幼鼠接受同等体积的生理盐水注射。幼鼠(注射 12 小时 后)进行腹腔注射戊巴比妥麻醉，分离肾组织。一侧肾组织 2%多聚甲醛固定 12 小时，制 成 3um 的石蜡切片，另一侧肾组织分离出来的肾小球提取 mRNA 和蛋白质。 1.4 肾组织 NG2 免疫荧光染色 RMC 以 2X104 个细胞,孔种植于 6 孔培养板， 5, CO2 孵育箱中培养 24 小时。然 70 后将细胞分为 2 组:对照组和 LPS 组(LPS 1ug/ml)。加入一抗兔抗鼠 NG2 抗体(1:100)， 37?孵育 30min。PBS 漂洗三次，加入 FITC 标记的羊抗兔多克隆抗体(1:100)，37?孵育 30min。PBS 漂洗三次，甘油封片，共聚焦荧光显微镜下观察并扫描采集图像。 1.5 转染 RMC 将 RMC 按 2×105 个细胞,孔接种于 6 孔培养板细胞 60,融合时，按操作说明分别 75 将 2 种 SiRNA(包括 NG2-SiRNA，阴性对照 SiRNA)及等量 Opti-MEM 与脂质体 Lipofectamine 2000TM 混合，加入无血清的 Opti-MEM 培养液中孵育，6 小时后换用低糖 DMEM 培养液 孵育。24 h 后通过荧光倒置显微镜观察 RMC 中增强红色荧光蛋白的表达，明确转染效率。 -2- 收集各组细胞，PCR 法检测 siRNA 的 NG2 干扰效率。 1.6 实时荧光定量 PCR 法和 PCR 法检测 NG2 mRNA、TNF-α mRNA 和 IL-1β mRNA 的表达 80 各 组 细 胞 或 组 织 RNA 为 待 测 标 本 。 NG2 引 物 序 列 : 正 义 链 5’-TGGGACTGTGACCTGAGATA-3’ ，反义链 5’-GGCTCTGTGGGTGAAATG-3’ 。TNF-α 引物序列:正义链 5’-GCCACCACGCTCTTCTGTC-3’ ，反义链 5’—GCTACGGGCTTGTCA CTCG-3’ 。IL-1β 引物序列:正义链 5’- CCACCTCAATGGACAGAAC -3’ ，反义链 5’- 85 CTTCTTTGGGTATTGTTTGG -3’ 。热循环体系:94?，120 s，变性 cDNA 和激活 Taq DNA 聚合酶;45 个循环包括 95?变性 20s ， 52?退火 20s，72?延伸 20s。溶解曲线分析:温 度从 60?以 0.2?/s 的速度升至 95? ，用于评估扩增的特异性。各样本 NG2 基因的扩增结 果用β-actin 的浓度校正， 2-CT 法计算 NG2 mRNA 表达的倍数变化。 1.7 Elisa 法检测 NG2、TNF-α 和 IL-1β 蛋白的表达 各组细胞培养液或肾组织蛋白抽提液为待测样本，室温下平衡试剂和待测样本 15min， 90 标准品和待测样本分别加入各孔，待测样本中加入生物素标记物，各孔分别加入酶联亲和物， ?孵育 30min，清洗液反复清洗 5 次扣干，加入底物，室温避光 35min，终止液终止反应， 37 酶联免疫检测仪 450nm 读取各孔吸光度值。 1.8 MTT 法观察 LPS 刺激转染的 RMC 增殖情况 以 5X103 个细胞,孔种植于 96 孔培养板，低糖 DMEM 培养液培养细胞至 60,融合。 95 细胞分为 3 组:阴性 SiRNA 转染组，NG2-SiRNA 转染组和 Dexamethsone 组(Dexamethsone 10nmol,L)，每组设 3 个复孔。细胞干预 48 h 后弃去培养液，加入 MTT20 ul(5 g,L)，37 ?孵育 4 h。终止培养，吸弃孔内培养上清液，各孔加入二甲基亚砜 150 ul，避光振荡 10 min。 选择 490 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值。 1.9 100 肾组织 NG2 免疫组化染色 3um 石蜡切片脱蜡，在甲醇中用 3%H2O2 封闭内源性过氧化物酶 30min，微波抗原修 复 10min，1%BSA 室温封闭 1h。滴加一抗兔抗鼠 NG2 抗体(1:100)，4?孵育过夜。PBS 漂洗三次，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(～:100)37?孵育 30min。PBS 漂洗三次，显微 镜下 DAB 显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶(Sigma，USA) 105 封片。均以同等浓度的兔血清 IgG 染色作为阴性对照。 每张免疫组化切片在 200 倍光学显微镜下随机选取 10 个互不重叠的肾小球视野摄像保 存，用 Image pro plus version 6.0 图像分析系统进行分析;用 HIS 模式将阳性目标从背景色 中分离出来，测定面积和吸光度(A),计算平均吸光度(A/面积)，为肾小球 CD2AP 表达 量。 1.10 统计学方法 110 实验数据以 x ?s 表示，计量资料用单因素方差分析检验，用 SPSS 16.0 统计软件进行 分析。 -3- 2 结果 2.1 LPS 刺激 RMC 后 NG2 的表达变化 免疫荧光结果显示，NG2 蛋白分布在 RMC 胞膜上，与对照组相比，LPS 组中 NG2 蛋 115 白表达明显增多，且分布均匀。见图 1。荧光定量 PCR 结果显示，对照组和 LPS 组 RMC 中 NG2 mRNA 相对表达水平分别为(0.22?0.03)和(0.33?0.04)，与对照组相比，差异有 统计学意义(P<0.01)。见图 2。 注:A:对照组 B:LPS 组 120 图 1 LPS 刺激 RMC 后 NG2 免疫荧光染色 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 Con LPS Relative expression of NG2 mRNA(NG2/β-actin) 注:vs Con, P<0.01 图 2 LPS 刺激 RMC 后 NG2 mRNA 的表达变化 125 2.2 LPS 刺激及 Dexamehtasone 干预后 RMC 细胞和培养液中 NG2、TNF-α 和 IL-1β 的 表达变化 荧光定量 PCR 结果显示，与对照组相比，LPS 组 RMC 中 NG2 mRNA、TNF-α mRNA 130 和 IL-1β mRNA 相对表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与 LPS 组相比，LPS+Dex 组 RMC 中 NG2 mRNA、TNF-α mRNA 和 IL-1β mRNA 相对表达水平降低，差异有统计学 意义(P<0.01)。Elisa 结果显示，与对照组相比，LPS 组 RMC 中 NG2、TNF-α 和 IL-1β 蛋 白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与 LPS 组相比，LPS+Dex 组 RMC 中 NG2、 TNF-α 和 IL-1β 蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见图 3。 135 -4- 5 4.5 * 4 3.5 3 * Con 2.5 LPS * LPS+Dex 2 # 1.5 # # 1 0.5 0 NG2 TNF-α IL-1β Concentration (pg/ml) Relative expression of mRNA(/в-actin) Absorbency value 荧光定量测定 RMC mRNA 的表达 注:vs Con, *P<0.01;vs LPS, #P<0.01 500 450 * 400 350 300 Con LPS 250 * LPS+Dex 200 150 * # # # 100 50 0 NG2 TNF-α IL-1β 140 Elisa 测定 RMC 培养液蛋白的表达 图 3 LPS 及 Dex 干预后系膜细胞 NG2、TNF-α 和 IL-1β 表达变化 2.3 LPS 刺激及 Dexamehtasone 干预后 RMC 细胞增殖的变化 MTT 结果显示，与对照组相比，LPS 组中系膜细胞增殖水平升高，差异有统计学意义 145 (P<0.01)。与 LPS 组相比，LPS+Dex 组系膜细胞增殖水平降低，差异有统计学意义(P<0.01)。 见图 4。 1.4 ** 1.2 ## 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Con LPS LPS+Dex 注:vs Con, *P<0.01;vs LPS, #P<0.01 图 4 MTT 检测 LPS 及 Dex 干预后系膜细胞的增殖变化 150 -5- 2.4 转染及 siRNA 干扰效率的测定 Cy3 标记的 SiRNA 转染 RMC 后胞膜可见强 Cy3 荧光，见图 5。PCR 法检测 RMC 中 NG2 的表达，与 Ctrl 及 Ctrl-SiRNA 组相比，NG2-SiRNA 转染组 NG2 mRNA 的表达显著降 低，差异有统计学意义(P<0.01)。见图 6。 155 图 5 SiRNA 转染 RMC 后 Cy3 荧光蛋白的表达 NG2(328bp) β-Actin(300bp) Ctrl NG2-SiRNA Ctrl-SiRNA 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 * 0.4 0.2 0 Ctrl NG2-siRNA Ctrl-siRNA Relative value of gray( NG2/β -Actin) 注:vs Ctrl, P<0.01 图 6 SiRNA 转染 RMC 后 NG2 mRNA 的表达 160 2.5 SiRNA 转染后 RMC 细胞和培养液中 NG2、TNF-α 和 IL-1β 的表达变化 荧光定量 PCR 结果显示，与对照组相比，LPS 组 RMC 中 NG2 mRNA、TNF-α mRNA 和 IL-1β mRNA 相对表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与 LPS 组相比，LPS+SiRNA 165 组 RMC 中 NG2 mRNA、TNF-α mRNA 和 IL-1β mRNA 相对表达水平降低，差异有统计学 意义(P<0.01)。Elisa 结果显示，与对照组相比，LPS 组 RMC 中 NG2、TNF-α 和 IL-1β 蛋 白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)。LPS+SiRNA 组 RMC 中 NG2、TNF-α 和 IL-1β 蛋白表达水平降低，与 LPS 组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。见图 7。 -6- 9 * 8 Control 7 LPS 6 LPS+siRNA 5 * 4 * 3 # 2 # # 1 0 NG2 TNF-α IL-1β Relative expression(/β-actin) 荧光定量测定 RMC mRNA 的表达 170 注:vs Con, *P<0.01;vs LPS, #P<0.01 Con 70 * LPS 60 * * LPS+siRNA 50 # 40 # # 30 20 10 0 Concentration(pg/ml) NG2 TNF-α IL-1β Elisa 测定 RMC 培养液蛋白的表达 图 7 SiRNA 转染后系膜细胞 NG2、TNF-α 和 IL-1β 表达变化 175 2.6 SiRNA 转染后 RMC 细胞增殖的变化 MTT 结果显示，对照组和 LPS 组中系膜细胞增殖分别为(0.651?0.061)和(1.181? 0.059)，差异有统计学意义(P<0.01)。LPS+SiRNA 组 RMC 中 NG2 蛋白表达水平为 (0.481 ?0.038)，与 LPS 组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。见图 8。 1.4 * 1.2 1 0.8 # 0.6 0.4 Absorbency value 0.2 0 Con LPS LPS+siRNA 180 图 8 MTT 检测 SiRNA 转染后系膜细胞的增殖变化 2.7 LPS 刺激及 Dexamehtasone 干预后乳鼠肾组织中系膜细胞 NG2 的表达变化 免疫组化结果显示，NG2 蛋白在肾小球系膜细胞表达，与对照组相比，LPS 组中 NG2 185 蛋白表达明显增多;与 LPS 组相比，LPS+Dex 组表达减少。图像分析半定量结果显示，对 照组和 LPS 组中系膜细胞 NG2 蛋白表达水平分别为(0.1732?0.0362)和(0.5274?0.0421)， 差异有统计学意义(P<0.01)。LPS+Dex 组 RMC 中 NG2 蛋白表达水平为 (0.3429?0.0288)， -7- 与 LPS 组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。见图 9。 LPS LPS+Dex Control 190 肾组织免疫组化染色标记 NG2 0.6 * 0.5 0.4 # 0.3 0.2 0.1 0 NG2 expression(A/area) Con LPS LPS+Dex 注:vs Con, P<0.01 NG2 蛋白表达半定量 图 9 乳鼠肾小球系膜细胞 NG2 蛋白的表达 195 2.8 LPS 刺激及 Dexamehtasone 干预后鼠肾小球中系膜细胞 NG2、TNF-α 和 IL-1β 的表 达变化 PCR 检测示肾小球三种固有细胞中仅系膜细胞表达 NG2。见图 10。肾组织微分离肾小 球，荧光定量 PCR 结果显示，与对照组相比， LPS 组系膜细胞中 NG2 mRNA、TNF-α mRNA 和 IL-1β mRNA 相对表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与 LPS 组相比，LPS+Dex 200 组 RMC 中 NG2 mRNA、TNF-α mRNA 和 IL-1β mRNA 相对表达水平降低，差异有统计学 意义(P<0.01)。Elisa 结果显示，与对照组相比，LPS 组 RMC 中 NG2、TNF-α 和 IL-1β 蛋 白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与 LPS 组相比，LPS+Dex 组 RMC 中 NG2、 TNF-α 和 IL-1β 蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见图 11。 Endo Podo MSC NG2(328bp) β-Actin (300bp) 205 注:Endo:内皮细胞，Podo:足细胞，MSC:系膜细胞 图 10 肾小球固有细胞中 NG2 表达情况 -8- 450 Control * 400 LPS 350 LPS+Dex 300 * 250 200 * 150 # # # 100 50 Concentration(pg/ml) 0 NG2 TNF-α IL-1β 210 荧光定量测定肾小球系膜细胞 mRNA 的表达 注:vs Con, *P<0.01;vs LPS, #P<0.01 450 Control 400 * LPS 350 LPS+Dex 300 * 250 200 * 150 # # # 100 50 0 Concentration(pg/ml) NG2 TNF-α IL-1β Elisa 测定肾小球系膜细胞蛋白的表达 图 11 LPS 刺激及 Dexamehtasone 干预后鼠肾小球系膜细胞 NG2、TNF-α 和 IL-1β 表达变化 3 讨论 215 本研究发现大鼠肾小球系膜细胞表达并分泌 NG2，在肾小球内 NG2 仅表达于肾小球系 膜细胞及其基质，NG2 参与肾小球炎症反应的激活，且通过炎症因子 TNF-α 和 IL-1β 等促 进系膜细胞增殖。LPS 刺激后肾小球系膜细胞 NG2 表达显著增加，炎症因子 TNF-α 和 IL-1β 表达上调，且系膜细胞增殖作用增强。SiRNA 下调 NG2 表达后，系膜细胞中炎症因子 TNF-α 和 IL-1β 减少，系膜细胞增殖作用减弱。 220 免疫荧光和 PCR 检测发现，大鼠肾小球系膜细胞表达 NG2，NG2 在系膜细胞表面分布， 并首先证实在肾小球三种固有细胞中 NG2 仅在系膜细胞及其基质中表达。NG2 是一种重要 的硫酸软骨素蛋白多糖大分子，具有完整的跨膜结构，核心蛋白包括一段长的胞外区(2224 个氨基酸)，单跨膜结构(25 个氨基酸)和一个短的胞内区(76 个氨基酸)[9]。近年来的 研究发现，NG2 除表达于中枢神经小胶质细胞外，还表达于血管平滑肌细胞/周细胞、角膜 225 周细胞、黑色素瘤细胞等多种间叶细胞[10-12]。本课题组前期的研究证实 NG2 也存在于大鼠 肾组织，在肾小球系膜细胞和系膜基质发现 NG2 的表达[13]。本研究在离体试验中，NG2 在 -9- 体外培养的鼠系膜细胞(RMC)表面均匀分布，用大鼠细胞系在肾小球内皮细胞、系膜细 胞和足细胞三种固有细胞中检测 NG2 mRNA，结果发现 NG2 仅在系膜细胞中表达，在内皮 230 细胞和足细胞内不表达;在体试验中，乳鼠肾组织免疫组化染色进一步证实肾小球内 NG2 只在系膜细胞及其基质中表达。 本研究发现系膜细胞分泌 NG2。体外培养的鼠系膜细胞(RMC)进行 Elisa 检测，RMC 培养基中发现 NG2 表达，且在乳鼠肾组织的肾小球中在系膜细胞及其基质发现 NG2 表达， 该发现说明系膜细胞表达且旁分泌 NG2。NG2 胞外区含有蛋白酶裂解位点，可从细胞表面 [9]，这可能是系膜细胞分泌 NG2 蛋白的机制。系膜细胞作为肾小球周细胞，具有合成 释放235 作用维持肾小球结构并参与肾小球功能的调节，可能通过旁分泌 NG2 作用于周围细胞发挥 其调节功能。 肾小球疾病多由感染诱发和加重，LPS(Lipopolysaccharide)是革兰阴性杆菌的产物， 在研究肾小球肾炎、急慢性肾损伤及自身免疫病肾损伤等肾脏病变时用于诱导肾脏炎症模型 [9,14-16] 。近年来，已在中枢神经系统小胶质细胞中证实 NG2 参与炎症反应的激活[17]。因此本 240 研究中，将 LPS 作为刺激物探讨 NG2 与肾小球系膜细胞炎症之间的关系。离体实验中 LPS 刺激后 RMC 及其培养基中 NG2 表达均显著增加，在体实验中 LPS 刺激后鼠肾小球 NG2 表 达显著增加，两者证实 LPS 上调系膜细胞 NG2 表达。进一步研究发现，LPS 上调 NG2 表 达同时炎症因子 TNF-α、IL-1β 表达上调，而 Dexamehtasone 可抑制 LPS 刺激引起的 NG2 和 TNF-α、IL-1β 的上调。TNF-α 和 IL-1β 是肾脏炎性损伤的标志[18]，因此上述结果提示， 245 NG2 参与肾小球炎症反应。为了明确 NG2 在肾小球炎症中发挥的作用，本课题组用 siRNA 下调 NG2 表达。发现 siRNA 成功转染 RMC 后系膜细胞及其培养液中 NG2 表达下调，LPS 刺激引起的系膜细胞及其培养液中 TNF-α、IL-1β 表达随之下调。因此，本组资料说明 NG2 参与肾小球炎症反应的激活，调节炎症因子在肾小球系膜细胞的表达和释放。 在肾小球疾病中，炎症因子介导肾小球系膜细胞增殖，TNF-α 和 IL-1β 引起肾小球系膜 250 细胞增殖最主要的炎性因子[19,20]。在中枢神经小胶质细胞、血管平滑肌细胞/周细胞、角膜 周细胞等多种间叶细胞中研究发现，NG2 与细胞的增殖、存活和组织硬化密切相关[10-12]。 因此我们设想，NG2 可能通过激活肾小球炎症反应介导肾小球系膜细胞的增殖。本研究用 MTT 法检测 RMC 增殖情况，结果发现 LPS 刺激后 NG2 表达上调及 TNF-α、IL-1β 表达上 调时，RMC 增殖水平上调;而该作用可被 Dexamehtasone 抑制，且在 SiRNA 下调 NG2 表 255 达及继之出现 TNF-α、IL-1β 表达后，RMC 增殖水平下调。上述结果表明，NG2 通过炎症 因子 TNF-α、IL-1β 调节系膜细胞的增殖。 4 结论 肾小球炎症反应参与各种急性和慢性肾脏疾病发病和病理过程，肾小球系膜细胞增殖肾 脏病早期的主要病变，也是多种急性和慢性肾小球疾病共同的病理改变，而肾小球炎症反应 260 及肾小球系膜细胞的过度增殖在肾小球硬化的发生、发展中起着重要作用。本研究证实， NG2 参与肾小球炎症反应的激活，介导炎症因子在肾小球系膜细胞的表达和释放，并通过 炎症因子调节系膜细胞的增殖。因此，我们认为 NG2 表达上调与肾脏疾病密切相关，NG2 可能成为肾脏疾病新的治疗靶点。当然其具体病理机制尚需进一步研究。而且在肾小球中系 膜细胞旁分泌 NG2 ，因此我们推测 NG2 除作用于系膜细胞外，可能还作用于内皮细胞等 265 周围细胞，有待进一步研究。 - 10 - [参考文献] (References) [1] Stallcup WB, Beasley L, Levine J. Cell-surface molecules that characterize different stages in the development 270 of cerebellar interneurons[J]. Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology, 1983, 48:761-764. [2] Karram K, Chatterjee N, Trotter J. NG2-expressing cells in the nervous system: role of the proteoglycan in migration and glial-neuron interaction[J]. Journal of anatomy, 2005, 207 (6): 735-744. [3] Stallcup WB. The NG2 proteoglycan: past insights and future prospects[J](Journal of neurocytology, 2002, 31:423-435( [4] Belachew S， Chittajallu R， Aguirre AA. Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are 275 intrinsically muhipotent and generate functional neurons[J](The Journal of cell biology, 2003,161:169-186. [5] Burg MA，Grako KA，Stallcup WB(Expression of the NG2 proteoglycan enhances the growth and metastatic properties of melanoma cells[J](Journal of cellular physiology, 1998, l77:299-312( [6] Xiong J, Wang Y, Zhu ZH. NG2 proteoglycan increases mesangial cell proliferation and extracellular matrix production[J]. Biochemical and biophysical research communications, 2007, 361 (4): 960-967. 280 [7] 熊京, 汪洋, 朱忠华, 刘建社. NG2 基因小发夹结构 RNA 抑制高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖[J]. 中华肾 脏病杂志, 2007, 23 (9): 565-569. [8] 熊京，汪洋，朱忠华(NG2 蛋白多糖在糖尿病大鼠肾脏组织表达的改变[J](中华肾脏病杂志, 2007, 23: 125-l26( [9] Nishiyama A, Lin XH, Stallcup WB. Generation of truncated forms of the NG2 proteoglycan by cell surface 285 proteolysis[J]. Molecular biology of the cell, 1995, 6:1819-1832. [10] Goretzki L, Burg M, Grako K. High affinity binding of bFGF and PDGF-AA to the core protein of the NG2 proteoglycan[J]. The Journal of biological chemistry, 1999, 274:16831-16837. [11] Grako K, Ochiya T, Barritt D. PDGF alpha receptor is unresponsive to PDGF-AA in aortic smooth muscle cells from the NG2 knockout mouse[J]. Journal of cell science, 1999, 112:905-15. 290 [12] Ozerdem U, Stallcup W. Pathological angiogenesis is reduced by targeting pericytes via the NG2 proteoglycan[J]. Angiogenesis. 2004; 7:269-76. [13] Xiong J, Wang Y, Zhu Z. NG2 proteoglycan increases mesangial cell proliferation and extracellular matrix production[J]. Biochemical and biophysical research communications, 2007, 361(4):960-7. [14] Bascands JL, Bachvarova M, Neau E. Molecular determinants of LPS-induced acute renal inflammation: 295 Implication of the kinin B1 receptor[J]. Biochemical and biophysical research communications, 2009, 386(2):407-12. [15] Bruemmer D, Collins AR, Noh G. Angiotensin II-accelerated atherosclerosis and aneurysm formation is attenuated in osteopontin-deficient mice[J]. The Journal of clinical investigation, 2003, 112(9):1318-31. [16] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 300 2(-Delta Delta C(T)) Method[J]. Methods, 2001, 25(4):402-8. [17] Gao Q, Lu J, Huo Y. NG2, a member of chondroitin sulfate proteoglycans family mediates the inflammatory response of activated microglia[J]. Neuroscience, 2010, 165(2):386-94. [18] Lichtnekert J, Kulkarni OP, Mulay SR. Anti-GBM glomerulonephritis involves IL-1 but is independent of NLRP3/ASC inflammasome-mediated activation of caspase-1[J]. PLoS One, 2011, 6(10):e26778. 305 [19] Wang R, Wan Q, Zhang Y. Emodin suppresses interleukin-1beta induced mesangial cells proliferation and extracellular matrix production via inhibiting P38 MAPK[J]. Life sciences, 2007, 80(26):2481-2488. [20] Cooker LA, Peterson D, Rambow J. TNF-alpha, but not IFN-gamma, regulates CCN2 (CTGF), collagen type I, and proliferation in mesangial cells: possible roles in the progression of renal fibrosis[J]. American journal of physiology, Renal physiology, 2007, 293(1): 157-165. 310 - 11 -