大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达_纯化及其黏膜免疫佐剂作用

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核达_纯化及其黏膜免疫佐剂作用 【基础研究】 大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的原核表达、纯化及其黏膜免疫佐剂 作用 崔文禹李媛媛 单璞凌媛李计来徐静 【 摘要 】 目的 原核表达、纯化大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位(eHat-labile enterotoxin B subuni，tLTB)，并评价其黏膜免疫的佐剂作用。方法 从产毒素大肠杆菌 44815 菌株中扩增出 LTB 基因，克隆至质粒 pET-32a(,)中，构建重组原核表达质粒 pET-32a(,)-LTB，转化大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS，IPTG 诱导表达，表达的 LTB 经纯化后进行神经节苷 脂GM1结合活性及黏膜 免疫佐剂活性鉴定。结果 重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组LTB 主要为可溶性表达，表达量约占菌体总 蛋白的 15,;纯化的 LTB 纯度可达 95,以上，可与兔抗 CTB 血清发生特异性反应，且具有G M1结合活性及良好的黏膜免疫佐 剂活性。结论 在大肠杆菌中成功表达了重组 LTB 蛋白，纯化的 LTB 具有良好的黏膜免疫佐剂活性。 【关键词】 大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位;免疫，黏膜;佐剂，免疫 【中国图分类号】Q786 R392-33 【文献标识码】 A 【文章编号】 1004-550(32011)12-1417-04 Prokaryotic Expression，Purification and Mucosal Immunoadjuvantivity of E, coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit CUI Wen-yu，LI Yuan-yuan，SHAN Pu，LING Yuan，LI Ji-Jinglai， (XUNationa l Vaccine , SerumInstitut e， Beijing10002 ，4China) 【Abstract】 Objective To expressE, co li heat-labile enterotoxin B subuni(tLTB)in prokaryotic cells ande valuate its mucos) al immunoadjuvantivity, Methods LTB gene wasm palified fromt oxinogenic E,co l i 44815s train and cloned into plasmid pET-32a (,), The constructed recombpinantlasmid pET-32a(,)-LTB was transformedE ,tcoo li BL21(DE3)pLysS and induced with IPTG,The expresseLTBd was purified then dteermined for ganglioside (GM1)bindinga ctivity and muocsal immunoadjuvantivity, Results Restriction analysis ands equenicng proved that recombipnantlasm id pET-32a(,)-LTB was constructed correctly, The expresseLTB d mainly existed in a soluble form，contained about 15, tofota l somatic protein and showesdp ecific reaction with rabbit serumagai nst CTB，bindingac tivity to GM1 asw ell as high mouscal immunoadjuvantivity, Conclusion RecombinantLTB protein wass uccessfully expresseidn E,co li，which showed high mousacl immunoadjuvantivity afterpur ification, 【Key words】 E,co li heat-labile enterotoxin B subuni(tLTB);Immunization，mucosal;Adjuvant，immune 机体 90,以上的感染发生在黏膜或由黏膜入侵活性，B 亚单位具有与黏膜上皮细胞神经节苷脂 ,3-4,造成，为了防止感染，诱导黏膜表面产生分泌型IgA GM1结合的能 力。A 亚单位为 LT 的毒性部分，(sIgA)非常重要。目前，大多数疫苗都是通过皮下或 B 亚单位无毒性但具有良好的黏膜佐剂活性，可作,5-6,肌肉注射接种，通常无法诱导黏膜 sIgA抗体的产 生， 为黏膜免疫的佐剂。本文克隆了 LT 的 B 亚单位 只有通过黏膜表面接种疫苗才能有效地诱导黏膜 (LTB)基因，在大肠杆菌中表达了重组蛋白，并与流 免疫。黏膜免疫分布于呼吸道、鼻腔、胃肠道、生殖器 感疫苗经鼻黏膜共同免疫小鼠，评价 LTB的黏膜 免 道黏膜表面的各种免疫细胞，这些免疫细胞通过提 疫佐剂活性。 呈抗原，产生 sIgA、IgM、IgG等保护性 抗体，并可诱 ,1,导其他部位的黏膜也产生 sIgA。 大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-labile enterotox) 1. 材料与方法 in，LT)具有较强的黏膜免疫佐剂效应，与其他免疫 1. 1 菌株、质粒及病毒 原共刺激机体后，可增强机体产生特异性抗体的能 大肠杆菌 DH5α、BL21(DE3)pLysS和载 体 pET- 32a(,)均为本室保存;产毒素大肠杆菌 44815购 自 力。LT 是由 A、B 两种亚单位组成的 AB型结构的 5 ,2,六聚体蛋白。A 亚单位具有 ADP-核糖基转移酶 中国食品药品检定研究院;甲1 型流感病毒裂解液 由北京天坛生物制品股份有限公司惠赠。 1. 2 实验动物 作者单位:北京生物制品研究所第三研究室(北京 10002)4, 通讯作者:徐静，E-ma:xj17b,163,cmo il 清洁级 BALB ,c 小鼠， 雌性，4 :6 周龄，体重 纯化重组 LTB 的 Western blot 1. 9 18 : 22 g，由北京天坛生物制品股份有限公司实验 动物中心提供。纯化重组 LTB 经 15, SDS-PAGE后 ，转膜，用 1. 3 主要试剂 5,脱脂奶粉封闭过夜;加入兔抗CTB 血清(1 ? 5 000 限制性内切酶 Nde?、Sal?、T4 DNA连接酶 和 稀释)，室温孵育 1 h;洗膜后，加入 HRP 标记的羊抗 Taq DNA聚合 酶购自宝生物工程(大连)有限公司;质 兔 IgG(1 ? 5 000稀释 )，室温孵育 1 h;洗膜后TMB 粒提取试剂盒和 PCR 产物回收试剂盒购自 Promega 公 司;IPTG 购自北京赛百盛生物工程有限公司;神经 节 法显色。苷脂 GM1 和兔抗 CTB 血清购自 Sigma公司 ;Im, 1. 10 重组 LTB GM1 结合活性的鉴定 mobilized D-GalactoseGel 购自 PIERCE;HRP 标 记 的兔抗鼠 IgG、兔抗鼠 IgA 和羊抗兔 IgG 购自北京中 以 500 ng, 孔 的 GM1 包被 96孔板 ，4?过夜， 杉金桥生物技术有限公司。 同时设未包被 GM1 的对照孔;PBST 洗板次 4， 2, 1. 4 引物设计及合成 BSA 37?封闭 1 h;PBST洗板 4 次，分别加入30 0、 根据 GenBank中 登 录 的 LTB 基 因 序 列(AB- 150 ng的 LTB，37?孵育 1 h;PBST洗 涤 4 次，加入兔 011677. 1)设计引物，序列如下:上游5:′-ATACAT- 抗 CTB 血清(1 ? 5 000稀 释)，37?孵育 1 h;PBST洗 涤 ATGAATAAAGTAAAAT-′3(下划线部分为 Nde?酶 4 次，加入 HRP 标记的羊抗兔 IgG(1 ? 5 000稀释 )， 切位点)，下游:5′-CTTGTCGACTTACTAGTTTTCCA- 37?孵育 1 h;PBST 洗涤 4 次，加 TMB 底物液 37?显色 TACTGATTG3-( 下划线部分为 Sal?酶切位点)，扩′ ,7,15 min;加 2 mol ,L HSO 终止显色，检测 A值。24 450,630 增片段大小 375 bp。引物由上海生工生物工程技术 1. 11 重组 LTB 的 N-末端氨基酸序列分析 服务有限公司合成。将纯化的重组 LTB 送中国医学科学院基础医 1. 5 LTB 基因的扩增 学研究所仪器中心，采用Ed man降解法测定目的蛋 白的 N-末端氨基酸序列。 提取大肠杆菌 44815 基因组 DNA，并以其为模 板，PCR 扩增 LTB基因 。反应条件为:94?预变性 1. 12 重组 LTB 的黏膜佐剂活性分析5 min;94? 30 s，56? 30 s，72s，?共 3030 个循环 ; 最后 72?再延伸 7 min。PCR 产物经 1,琼脂糖凝胶 将 BALB ,c 小鼠随机分 为 组4 :HA 肌肉组、 电泳鉴定。 1. 6 重组表达质粒的构建 HA 鼻黏膜组、HA ，LTB 鼻黏膜组和 PBS 对照组， 琼脂糖凝胶电泳回收 PCR 产物，与载体pE T- 每组 10 只。各组小鼠均免疫3 次，间隔 14 d，免疫剂 32a(，)分别经 Nde?和 Sal?双酶切，回收目的基因量均为 50 μl ,只 (含 HA 5 μg，LTB 2 μg)。初免后第 片段和载体片段，用 T4 DNA连接酶连接 ，连接产物42 天采集外周血(分离血清)和肺黏膜灌洗液，以间 转化感受态大肠杆菌D H5α，挑选单克隆，提取质接 ELISA 法分别测定 HA 特异的 IgG 和 IgA 效价。 粒，双酶切鉴定，阳性菌株送上海英骏生物技术有限 1. 13 统计学分析 公司测序。 应用 SPSS13. 0 统计学软件处理数据，采用非配 对 t 检验对实验数据进行统计学分析，以 P ， 0. 05 1. 7 目的基因的诱导表达 为差异有统计学意义。 将重组质粒 pET-32a(，)-LTB 转化 BL21(DE3) pLysS，挑取单克隆接种于含 Amp(50μ g ,m l)的 LB 培2. 结果 养基中，37?培养过夜，次日以 1 ? 50比例转种 至 含 Amp(50μ g ,ml )的 LB 培养基中，37?培养至菌 体 2. 1 LTB 基因扩增产物的鉴定A值约 0. 6 时，加入 0. 5 mmol, L IPTG 诱导 表 达，600 LTB 基因 PCR 扩增产物经 1,琼脂糖凝胶电泳分 继续培养 4 h。收集菌体，超声破碎，离心后收集 上析，可见 375 bp的条带 ，大小与理论值一致，见图1 。 清和沉淀，经 15, SDS-PAGE分析 。 1. 8 重组 LTB 的纯化 将破菌上清与 Immobilized D-GalacGtoseel 层析 1 M bp 柱结合，用 PBS 洗去未结合的杂蛋白，再用0 . 1 mol, L 2 000 Gly(pH . 23)洗脱，收集洗脱峰，PBS(pH 7. 0)透析 24 h，,20?保存。 1 000 750 500 250 100 1:LTB 基因 PCR 产物;M:DNA marker DL2000 图 1 LTB 基因 PCR 扩增产物电泳图 Fig 1. Electophoreic profile of PCR product of TBrtLgene 2. 2 重组表达质粒的鉴定 时，纯化的 LTB分别以单体和五聚体形式存在 ，表 明所得到的蛋白具有天然构象。纯化 LTB 的纯度可 琼脂糖凝胶电泳分析显示，重组表达质粒 pET- 达 95,以上，见图 4。 32a(,)-LTB 经 Nde?和 Sa?l双酶切，可见 5 388 bp 的载体片段及 375 bp的目的基因片段 ;经Nd e?单 Mr M 1 2酶切，可见 5 763 bp的片段 。见图 2。测序结果与 97 000GenBank序列比对 ，同源性为100 ,，无碱基突变。 66 000 45 000 30 000 bp M112 M2 bp 20 100 15 000 7 500 14 400 5 000 2 500 2 000 1 000 500 M:蛋白质 marker;1:纯化的LT B(pH 2. 3);2:纯化的 250LTB(pH 7. 0) 图 4 纯化重组 LTB 的 SDS-PAGE分析 Fig 4. SDS-PAGEprofil e of purified recombinantLTB M1:DNA marker DL15000;1:质粒经 Nde?单酶切的产 物;2:质粒经 Nde?和 Sal?双酶切的产物;M2:DNAmarker 2. 4. 2 Western blot分 析:纯化的 LTB 可与兔抗 CTB DL2000 图 2 重组表达质粒 pET-32(a,)-LTB 的酶切鉴定 血清反应，LTB 单体或五聚体均在相应的位置可见 Fig 2. Restriction map of recombinant plasmidpET - 单一反应条带，见图 5。表明重组 LTB 具有良好的反 32(a,)-LTB 应原性。 2. 4. 3 GM1结合活性 :ELISA结果 表明，纯化的重组2. 3 表达产物的鉴定 LTB 五聚体可与细胞表面 GM1结合 ，见表 1。 重组菌的表达产物经 SDS-PAGE 分析，在相对 分子质量约 11 700处可见目的蛋白条带 ，大部分存 12 在于破碎上清中，主要为可溶性表达，见图3 。经凝 LTB 五聚体胶扫描系统分析，目的蛋白的表达量约占菌体总蛋 白的 15,。 Mr M1234 97 000 LTB 单体 66 000 45 000 30 0001:纯化的 LTB(pH 2. 3);2:纯化的 LTB(pH 7. 0) 图 5 纯化重组 LTB 的 Western blot分析 20 100Fig 5. Western blotting of purified recombinantLTB 14 400 11 700 表 1 GM1-ELISA检测结 果(x ? s，n ,3 ) Tab 1. Result of GM1-ELISA(x ? s，n , 3) M:蛋白质 marker;1:超声破碎上清;2:超声破碎沉淀; A 组别450 ,63 0 3:诱导的重组菌全菌;4:诱导的空载体转化菌 LTB019 ?0. 050 0. 图 3 表达产物的 SDS-PAGE分析 GM1,LT B(300 ng) 1. 630 ?0. 055 Fig 3. SDS-PAGEprofil e of expressedLTB 1. 370 ?0. 035 GM1,LT B(150 ng) N-末端氨基酸序列:经测定，重组 LTB 的 N- 2. 4. 4 2. 4 纯化重组 LTB 的鉴定 2. 4. 1 SDS-PAGE 分析:溶剂 pH 值分别为 2. 3 和 7. 0末端氨基酸序列为:APQSITELCSE，Y与预期完全一 tivity retention of Escherichia coli enterotoxinLT ,J,, Avian Pathol， 致，表明蛋白表达正确。2006，35(2):134-140 ,2. 4. 5 黏膜佐剂活性:ELISA 结果显示，HA ,LTB ,2, YamanakaH ，Ishibashi D，Yamaguchi ，Net al, Enhancedmuc os) 鼻黏膜组 IgA 抗体效价显著高于 HA 肌肉组和 HA al immungoenicit yof prion proteinfollo wing fusion withB subunit of Escherichia coli heat-labile entertooxin,J,, Vaccin，e2006，24 鼻黏膜组(t 值分别为 4. 539 5 和 7. 589 2，P均 , (15):28152823- , 0. 05)，IgG 抗体效价与 HA 肌肉组差异无统计学意 ,3, Alone PV，Garg LC, Secretory andGM1 receptor bindingrol e of N-termina regon of LTB in brio choerae,J,, Bochem Bophys liVilii义(t ,1 . 033 8，P, 0 . 05)，见图 6。表明 LTB具 有 Res Commun，2008，376(4):770-774 ,良好的黏膜佐剂作用。 ,4, 杜联峰，孙万邦，宋明英, 大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位的原 6核表达及活性鉴定 ,J,, 中国生物制品学杂志，2009，22(5): IgA 461-463 ,IgG 5 ,5, ZhangGG ，Li DX，Zhang HH，et a,l Enhancement of smucal o)10 4immune responseg aainst the M2eHBc ,a ntigen in micewith the oglfusion expression products LTBof andM 2eHBc, through mucsal o 3 immunization route, J,, Vet Res Commu，n2009，33 (7):735- 747 ,2 抗体滴度(,6, Liang S，Hosur KB，Nawar H，Fet al, In vivo andin vitro adju) 1vant activities of theB subunit of typeIIb heat-labile entertooxin (LT-IIb-B5)from Escherichiaco li,J,, Vaccin，e2009，27(32): 0 43024308- , PBSHAHAHA ,LTB 鼻黏膜组 对照组肌肉组鼻黏膜组,7, Ma X，Yao B，Zheng W，et al, Comparative study on chractaeri) zation of recombinaBnt subunit oEf, coli heat-labile entertooxin (rLTB) prepared froEm ,coli and P , patoris ,J,, J Microbiol 图 6 各组小鼠的抗体效价 Biotechnlo，2010，20(3):550-557 ,Fig 6. Antibody titers of micein various groups ,8, Moravec ，TSchmidt MA，Herman E，Met al, Production of Es) cherichiac oli heat labile toxin ( LT) B subunitin soybean seed 3. 讨论 and analysis of its immungoenicit yas ano ral vaccin,eJ,, Vaccin，e LTB 能有效诱导机体局部和全身的体液免疫和 2007，25(9):16471657- , ,9, 雷清，黄思扬，应莲芳，等, 重组大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单 细胞免疫，与抗原共同免疫时能诱生更高效价的IgA ,8-9,和 IgG。LTB 诱导黏膜免疫反应，能够增加上皮 ,10,细胞的渗透性，增强抗原吸收及抗原提呈细胞的 ,11,提呈作用，调节 B 细胞的分化，使 IgA 的形成增 位表达条件的优化及其佐剂作用 ,J,, 中国生物制品学杂志，,12, 加。 2008，21(3):174-177,本文构建的重组表达质粒 pET-32a(,)-LTB 在 ,10, Svennerholm AM, From ch olera to enterotoxigenic Escheri chia IPTG 诱导下能较好地表达 LTB，表达量约占菌体总 coli(ETEC)vaccine developmen,tJ,, Indian J MedRe s，2011， 蛋白的 15,。LTB具有能够与细胞表 面GM1 结合 的 133(2):188-196 , ,11, Lim JG，Kim JA，Chung HJ，et al, Expression of funct ional 特性，而 GM1由半乳糖构成 ，利用这一特性，我们采 pentameric the-laabile enterotoxinB subunit of Escherichia coli 用 ImmobilizedD -Galactose Gel 亲和层析的方法纯 n Saccharomyces cerevisi,J,a, eJ Microbiol Biotechnlo，2009， i化 LTB 蛋白，该方法操作简便，所得蛋白纯度高。由 19(5):502-510 ,于 LTB 与 CTB 具有较高的同源性，用兔抗CTB 血清 ,12, Da Hora V，PConceicaoF R，Dellagostin OA，et a,l Non-toxic 可以检测到 LTB 蛋白，因此，本实验中将兔抗CTB 血 derivatives of LT as potent adjuva,ntsJ,, Vaccin，e2011，29 (8):15381544- ,清作为 Western blo、GMt1-ELISA 的一抗。GM1-ELISA、 ,13, Holmgren J，Adamsson， JAnjuère ，Fet al, Mucosal adjuvants 动物免疫实验结果证实，LTB 能与 GM1结合 ，具有佐 and ntai-infection and ntai-immunopthaology vaccines basedon 剂活性。 cholera toxin，cholera toxin B subunit and CpG DNA,J, , Im) 在黏膜免疫中，鼻黏膜及其相关淋巴组织不仅 munol Lett，2005，97(2):181-188 ,可诱导血清和鼻腔局部免疫反应，而且可诱导系统 ,14, LasaroM A，Mathias-Santos C，Rodrigues J，Fet al, Functional and immunloogical characterization of an atural polymorphic vari) 和多处黏膜局部的免疫反应，是免疫接种探索的新 ,13-14,ant of a het-laabile toxin(LT-I)produced by enterotoxigenicEs) 靶点。综上所述，以 LTB 为佐剂，可增强疫苗的 cherichiac ol(i ETEC),J,, FEMS Immunlo MedM icrobiol，2009， 黏膜免疫效果。 55(1):93-99 , 参考文献 ,1, VassermaYn， Ptcovski J,Genet c detoxificaton and djuvaant-ac) iii (收稿日期:201104--19)