羊水细胞的荧光原位杂交用于胎儿染色体疾病的产前诊断

羊水细胞的荧光原位杂交用于胎儿染色体疾病的产前诊断 中山大学 硕士学位论文羊水细胞的荧光原位杂交用于胎儿染色体疾病的产前诊断 姓名:黄珈 申请学位级别:硕士 专业:妇产科学 指导教师:游泽山 20040520 羊水细胞的荧光原位杂交用于胎儿染色体疾病的产前诊断 中文摘要 羊水细胞的荧光原位杂交用于胎儿染色体 疾病的产前诊断 七年制硕士研究生:黄珈 导 师:游泽山 副教授 中山大学附属第一医院妇产科 摘要 染色体疾病是导致新生儿出生缺陷最多见的一类遗传性疾病。我国新生活婴的染色体异常发生率为,(,,,。由于多数染色体病还无法治疗，故只有进行及时的产前诊断四,,,,, ,,,,,,,,,)，终止异常妊娠，才能达到优生目的。 ,,,,年第,届世界围产医学会议上，产前诊断组专家认为，当今产前诊断仍以羊膜腔穿刺羊水细胞培养为基本手段。传统的羊水细胞遗传学诊断有许多无法克服的局限性，如取材时间有限，培养耗时长(,,,,天)，技术较难掌握，羊水细胞培养时产生的假嵌合体现象等。而且，单纯显带方法不能检出光学显微镜下不能识别的染色体微缺失。近年来建立的荧光原位杂交(,,,,,,,;,,, ,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,，,,,):技术，应用荧光标记的特异性,,,探针与中期染色体相关区带或间期核的相关染色体进行原位杂交的定位识别方法，将分子生物学和细胞遗传学技术相结合，可以很好地克服上述局限性。将其应用于未培养的羊水间期细胞，大大地提高了染色体综合征的产前诊断检出率。可于羊膜腔穿刺后,, ,内快速诊断胎儿染色体特定异常。 在染色体病导致出生缺陷的患儿中，,,,是由于,,号、,,号、,,号、,与,染色体的非整倍体造成的。故应用五种染色体特异性探针对未培养的羊水间期细胞进行,，,,，即可发现大多数胎儿的染色体异常。 本研究分两部分进行。第一部分是建立问期羊水细胞的,，,,技术。第二部分是应用,，,,技术进行胎儿染色体数目异常的产前诊断。 羊水细胞的荧光原位杂交用于胎儿染色俸疾病的产前诊断 中文摘要 第一章多色荧光原位杂交用于未培养羊水细胞染色体检测方法的建立 本实验收集孕,,，,,,，周的羊水样本,,例及正常人外周血,例。选用美国,,,,,公司的,,,,,,双色探针，,,,,,探针，,,,,,探针。羊水间期细胞的,，,,步骤包括:样本预处理、变性、杂交、洗脱和荧光镜下观察结果。计算样本杂交率，记录镜下显示的核型信号。 结果:从细胞标本制备到原位杂交结果检测，整个实验过程在,,小时内完成。,，,,结果显示,例男性(,,)，,例女性(),()，均为正常二倍体。与临床追踪,,,,符合。 ,,例羊水间期细胞样本平均杂交率,,(,,?,,(,,，比间期白细胞杂交率,,(,,要低(,,,(,,)。孕,,周以前羊水杂交率,,(,,?,(,,，孕,,周以后羊水杂交率,,(,,?,,(,,，,,周后的羊水杂交率明显低于前者(,,,(,,)。 ,,,、,,号、,,号探针平均杂交率分别为,,(,,?,,,,、,,(,,?,(,,、,,(,,?,(,,。,,号探针杂交率均低于,,,探针和,,号探针(,。，,,(,,，,,,,,(,,)。 ,,例样本均另留,(,,,羊水，置,”,冰箱保存,周后再行,，,,检查。留置样本与新鲜羊水样本在杂交率上无统计学差异(,。,,,(,,，, ,,,,(,,)。两者杂交信号显示的结果完全一致。 第二章羊水细胞的,，,，,在产前诊断中的应用 研究对象包括因高龄孕妇、血清学筛查异常、胎儿畸形等各种产前诊断指征而行羊膜腔穿刺、脐带穿刺，染色体核型分析的孕妇,,例。 ,,例未培养羊水细胞都行,,,、,,号、,,号探针的,， ,,分析，镜下观察若,,,,的杂交核出现非整倍体信号则该样本判断为非整倍体。所有病例均在盲法设计下，与染色体核型分析结果比较。 结果:细胞遗传学发现，染色体数目异常,例，结构异常,例，染色体常态变异,例。,,例中,(,,,(,,,,)是染色体数目异常，占,超发现胎儿畸形组的,,(,,。 ,,例标本共有,,,个杂交区域，总的平均杂交率为,,(,,?,(,,。,,周前、,,周后、,,周后的羊水标本杂交率分别为,,(,,士,(,,、,,(,,?,(,,、,,(,,?,(,,。随着孕周增长，杂交率呈下降趋势(,,,(,,)。 ,?( 羊水细胞的荧光原位杂交用于胎儿染色体疾病的产前诊断 中文摘要 ,例染色体非整倍体，,，,,诊断出其中,例;另,例异常是罗伯逊易位型,,三体因没有,,号探针而未能诊断。其中，三例,,三体中,个信号的显示率分别为,,,、,,,、,,,。两例,,三体中,个信号的显示率分别为,,,、,,,。,例,,,核型中,,,信号显示率,,,。 ,,例整倍体羊水样本，,，,,诊断为,,,,,,,,,,核型的,,例，,,,,,,,,,,核型的,,例，与细胞培养核型分析完全符合。,,例男胎,,核型平均显示率,,(,,?,(,,。,,例女胎,,核型平均显示率,,(,,?,(,,。,,例整倍体中，,个;,,(,,信号平均显示率,,(,,?,(,,:,个;,,(,,信号平均显示率,,(,,?,(,,。,,例中，,例,号染色体倒位，,例染色体次缢痕增长，,例,,号染色体短臂随体柄增长，,，,,结果判断均为正常二倍体核型。 ,,例羊水样本肉眼有母血污染，占,,(,,，均能成功进行,，,,分析。 另外抽取,,例用,,,,,,和,,,,,探针进行超快速,，,,实验，加,,,探针后的杂交孵育时间缩短为,,,,,。此,,例,，,,分析结果与核型分析完全符合，杂交率无明显降低(,。声,(,,，, ,,,,(,,)。 与核型分析金相比，对染色体数目异常的诊断，,，,,敏感性,,(,,(,,,)，特异性,,,,(,,,,,)，假阴性率,,(,,(,,,)，阳性预测值,,,,，阴性预测值,,(,,，准确率,,(,,。针对特异探针而言，敏感性、特异性、准确率均达,,,,。 结论,(用未培养的羊水细胞行,，,,分析是可行的、可靠的。本研究中，针对特异探针 而言，染色体非整倍体的诊断准确率达,,,,。该技术简便快速，能在,,小时 内出结果。,(本研究的畸形胎儿组中非整倍体畸变高达,,(,,。提示胎儿畸形合并胎儿染色体 异常的几率高。,(间期细胞,，,,的杂交率与探针类型、靶细胞种类及羊水孕周有关。外周血白细 胞杂交率比羊水细胞高;,,,探针比,,，探针杂交效率高;随孕周增大，羊水 细胞杂交率呈下降趋势，但不会影响结果判断。羊水问期,，,,可用于孕晚期的 (?，( 羊水细胞的荧光原位杂交用于胎儿染色体疾病的产前诊断 中文摘要 快速产前诊断。,(母血污染的羊水标本不会影响,，,,的诊断。未处理的羊水标本在,。,保存,周 不影响,，,,的诊断结果。,(应用,,,探针可以对间期羊水细胞进行超快速,，,,，,小时内获得可靠结果。 关键词:荧光原位杂交羊水间期细胞染色体疾病产前诊断 ?，,? 羊水细胞的荧光原位杂交用于胎儿染色体疾病的产前诊断 英文摘要,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ;,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,;,,, ,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,;,,,,,,, ,,,,,;,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,:,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,:,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,; 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,,,,, ,,, ,, ,,,,; ,，,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,(,，,, ,, ,, ,, ,,,,,, ,,,,,,, ;,, ,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,;;,,,,,,,,( 羊水细胞的荧光原位杂交用于胎儿染色体疾病的产前诊断 英文摘要,(,,,,,,,,,,, ,，,, ,,, ,,, ,,,,,, ,,,;,,, ,, , ,,,,,( ,,,,,,,,:,,,,,,,;,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,, ,,;, ,, ,,,;,,,， ;,,,,,,,,, ,,,,,,,，,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,，,( 羊水细胞的荧光原位杂交用于胎儿染色体疾病的产前诊断 前 言 羊水细胞的荧光原位杂交用于胎儿 染色体疾病的产前诊断 前言 染色体病(;,,,,,,,,,, ,,,,,,,)或染色体畸变综合征(;,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,)是一大类严重的遗传病，通常伴有生长发育迟缓和智力发育障碍，同时也是导致流产与不育的重要原因。一般估计染色体畸变见于,(,,(,(,,的活产婴儿，,(,,的胎儿。自发流产儿的胚胎约,,,有染色体异常，说明染色体畸变常是致死性的，仅少数出生并存活。现今已知的染色体病超过,,,种，已报告的染色体数目和结构异常在,万种以上。但最常见的染色体数目异常为染色体,、,、,,、,,、,,号。 染色体疾病是导致新生儿出生缺陷最多见的一类遗传性疾病。患儿多有严重智力障碍，而且这些疾病可通过人类繁衍不断传递，给家庭及社会均带来严重负担。我国新生活婴的染色体异常发生率为,(,,,,,,。由于多数染色体病还无法治疗，故只有进行及时的产前诊断，对确诊有异常的终止异常妊娠，才能达到优生目的。因此由人类遗传学、生化免疫、分子生物学和临床医学紧密结合起来的产前诊断(,,,,,,,, ,,,,,,,,,)正在世界各地及我国蓬勃发展。 ,,,,年,,,,,, ,,和,,,, ,, ,,〔,〕首次对羊水细胞培养成功进行胎儿核型分析和,,,,年,,,,,,，,,【,】于产前报告第一例先天愚型及半乳糖血症后，开创了遗传病产前诊断的先河。,,,,年代后这些技术广泛应用于临床。纵观产前诊断的发展趋势，大致有早、快、准和无创伤的几个特点。产前诊断技术可分为侵入性和非侵入性两种。侵入性的检查有羊膜腔穿刺、绒毛活检、脐带穿刺、胎儿镜等，非侵入性的检查有,超检查、母血生化检查、核磁共振、宫 颈管脱落细胞检查及从母赢中分离胎儿细胞等。 (,)超声波检查 由于超声诊断安全简便无损伤、无痛苦、可多次重复，并能及时得出结果，故已成为目前产前诊断的常规方法之一，在国内外得到最为广泛的使用。随着超声技术迅速发展，受过专,？,,,,练的专职人员已能将,,,以上 羊水细胞的荧光原位杂交用于胎儿染色体疾病的产前诊断 前 言的胎儿结构异常诊断出来。,,,,,(,(,,,,报道〔,』，胎儿超声影像图出现下列主要异常表现之一，提示其为非整倍体的风险较高，可以考虑进行侵入性检查，主要异常表现包括神经管畸形、心脏畸形、脑膨出、前脑无裂畸形、水囊状淋巴管瘤、,,,,,(,,,,,,综合征、颈项皮下透明层增厚，,,,,等。此外，一些次要超声影像指征如心脏内强回声灶、肠管强回声光团、股骨短、脉络丛囊肿、轻度肾盂扩张、单脐动脉等也与非整倍体综合征有一定关系。 (,)母血清生化筛查 产前母体血清标志物筛查对胎儿无创伤，虽然不能作出诊断，但能最大限度减少羊膜腔穿刺等创伤性检查，而又尽可能少漏诊染色体畸变胎儿。孕妇血清中的标记物如,,,、,,,、, ,,与染色体综合征相关。在妊娠中期，三者均明显降低时，提示胎儿很有可能是,,三体;,,,、斗,,低，,,,高则提示,,三体可能。国外研究表明，迄今为止,,,,(,仍为早孕期筛查,,,,?,综合征胎儿的首选血清标记物，检测的敏感孕周为,—,,周，,,,,?,综合征胎儿的母血,,,,(,含量显著低于正常组。如果把筛查的假阳性定在,,时，检出率可达,,,,,，。 (,)孕妇外周血富集胎儿细胞 现已证明:胎儿细胞在妊娠,,天时就已出现在母血中【,〕。这些细胞通过胎盘屏障进入母血循环，主要有三种:滋养叶细胞、有核红细胞和淋巴细胞。母血中有核细胞与胎儿细胞谋壤 嘉 保埃担海钡剑保埃梗海薄,壳岸嗍 д呷衔 ザ 泻撕煜赴 窃懈就庵苎 凶钍视诟患 炕 糜诓 罢锒系奶ザ 赴 ,釉懈就庵苎 懈患 炕 ザ 赴 姆椒ㄓ腥 郑好芏忍荻壤胄姆ā?庖叽胖榉掷敕ǎǎ停粒茫樱?土魇较赴 羌剖 际酰ǎ疲粒茫樱 庑?椒ǘ夹枥 孟赴 砻婊蛳赴 诘囊恍?匾炜乖 鞅昙牵 秆 械奶ザ 赴 掷氤隼矗 儆茫疲桑樱取?校茫壹际跫跋拗菩云 铣ざ榷嗵 裕ǎ遥疲蹋校螅? 治鼋 幸糯 д锒稀,壳翱烧锒咸ザ 员稹?旧 畸变(包括数目及结构异常)、,,,多态性、胎儿,,,血型、囊性纤维化、镰型细胞贫血、地中海贫血、血友病甲等【,,。 (,)经富颈收集胎儿细胞 研究证实妊娠早期，滋养细胞可脱落至富腔进而达到宫颈管内。因此通过宫颈管及宫腔冲洗、抽吸和蘸取收集宫颈脱落细胞的滋养层细胞用来检测胎儿细胞的,,,，作为非侵入性妊娠早期产前诊断的手段。从绒毛的发生可以推测，经宫腔收集脱落滋养层细胞的时间是从绒毛侵袭性生长 、,( 羊水细胞的荧光原位杂交用于胎儿染色体疾病的产前诊断 前 言进入宫腔到宫腔消失。文献报道运用不同方法收集到胎儿滋养层细胞为孕,,,,周到,,,,,周之间即】。,,,,,,,,等【„,】对,,例孕,,,,周的孕妇用巴氏细胞涂片刷获取子宫颈管内胎儿细胞并结合,，,,方法，有效地进行胎儿性别的早期产前诊断。他们认为此方法相对安全。随着,，,,等分子生物学技术的发展，可以进行孕早期染色体数目异常的检测，但诊断的精确性还有待于大样本研究验证。 (,)羊膜腔穿刺(,,,,,;,,,,,,,)羊水是一种能反映胎儿各项功能和某些病症的特殊液体，羊水中含有从胎儿的皮肤、胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道的粘膜脱落细胞。,,,,年，,,,,,,,,,,〕应用羊膜腔穿刺方法报道了首例,, 三体的产前诊断，至今仍为产前诊断最可靠的技术之一。常规羊膜腔穿刺术通常在孕,,,,,周进行，最佳穿刺时间为,,,,,周。此时羊水量多达,,,,,，穿刺时进针容易，且不易伤及胎儿:对胎儿生长发育一般不会造成危害，且羊水中有活力的细胞比例高，细胞培养成功率高。羊水细胞诊断染色体异常的可靠性约为,,,,,,〕。羊膜腔穿刺术失败率为,(,,,,(,,，并发羊膜炎、胎盘早剥的机会少，羊水栓塞罕见【”,。 常规羊膜腔穿刺一般在妊娠,,周以后，在妊娠,,周前进行的羊膜腔穿刺称为早期羊膜腔穿刺术(,,,,, ,,,,,;,,,,,,,，,,,)，近年来发展较快。其优点是取材时间早，但是由于获取的羊水量少，获得胎儿细胞数少，羊水细胞培养难度较大。而且，有报道早期羊膜腔穿刺抽吸羊水过多会引起胎肺发育不良、新生儿马蹄内翻足出生率上升,,,,。 (,)脐带穿刺术(;,,,,;,,,,,,,) ,,,,年,,,,,,等„”,首次报道超声引导下经皮脐血管穿刺取血技术，国内何超等,,,,年也报道于脐蒂处抽取胎儿血作产前诊断，其成功率达,,(,,【,“。随后广泛应用于胎儿疾病的产前诊断。这项技术在我国已远较国外普及，成功率高，也较安全。可在,超引导下于孕中期、孕晚期 (,,,,,周)进行。脐血可作染色体或血液学各种生化检查，亦可用于因羊水细胞培养失败，或在错过绒毛和羊水取样时机下进行。我们医院的资料显示【,,】应用此方法进行,,,例脐静脉穿刺，总穿刺成功率,,(,,。脐带穿刺一般较安全，但仍有出血、感染、流产等并发症发生，手术操作并发症的风险约为,,,,,,,,,,,,〔, ,,，与其相关的胎儿丢失率约,,,,,。其它并发症包括穿刺部位出血、脐带血肿、胎膜早破、胎盘早剥和绒毛膜羊膜炎等发生率约,,。反复的脐带穿刺可致穿刺 (,( 羊水细胞的荧光原位杂交用于胎儿染色体疾病的产前诊断 前 言点出血造成胎儿急性贫血，严重者可致胎儿及新生儿死亡。脐血管痉挛、胎心持续过缓亦可造成胎死宫内。有学者报道脐带穿刺后胎心减速发生率在,(,,,,,,，与穿刺针进入脐动脉、胎儿失血、脐带血肿有关【,,，,,，,,〕。对于这些资料差距大的原因可能与病例选择、样本数、胎心缓慢标准，穿刺后胎心监护情况，以及操作者经验差别等有关。 (,)绒毛细胞检查(;,,,,,,,; ,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,，,,,),,,,年，,,,,,,用直接法成功地进行了绒毛组织的染色体核型分析，并用于临床产前诊断口,,。早期绒毛组织检查通常在孕,,,,周进行，经宫颈或经腹从胎盘边缘取少量绒毛组织进行培养，并作染色体核型分析。两种方法在安全性和有效方面没有显著性差异〔,,〕,吸取绒毛量通常在,,,,,,,左右，不要超过,,,,,。样品采集后的细胞遗传学分析可分为直接法和培养法。直接法是基于细胞滋养层细胞自然的有丝分裂，在,,,,,内直接提取染色体进行检查。大多数实验室采用过夜孵育的方法。培养法是将绒毛间质在培养液中培养，约需,,,,出结果。直接法优点是可以快速报告结果，并最大程度减少母体底蜕膜的污染，其染色体组型分析成功率可达,,,〔,,,。用绒毛细胞做染色体分析，由于胎盘嵌合性的影响，可能有假阳性或假阴性，对嵌合体诊断可靠性不如羊水细胞学，如发现嵌合体必须以羊水染色体核型分析复核。国外有报道孕,,,周以前取绒毛会发生胎儿肢体短缺〔,,，,,,,,，故多不主张孕,周前的绒毛活检。绒毛活检比孕中期羊膜腔穿刺更易引起流产，特别是经宫颈活检流产率高。但有报道，,,,与早期羊膜腔穿刺相比，其胎 儿丢失率低于后者【,,】。 (,)植入前诊断(,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,)植入前诊断是利用微操作技术和,,,扩增技术对胚泡植入前进行检测。目前已有用酶超微量分析测定,,,,,诊断,,,;,—,,,,,综合征;用,,,技术作镰形细胞贫血、甲型血友病、性别检定、,,,、,一地中海贫血等单基因的产前诊断。 (,) 胎.