细菌脂多糖诱导小鼠DC2.4细胞TLR7蛋白的表达.doc

细菌脂多糖诱导小鼠DC2.4细胞TLR7蛋白的表达.doc 细菌脂多糖诱导小鼠DC2.4细胞TLR7蛋白的表达 【摘要】 目的: 探讨细菌脂多糖(LPS)对小鼠树突状细胞(DC)系DC2.4 TLR7蛋白表达的诱导作用。方法: 用RPMI1640完全培养液培养DC2.4细胞, 光学显微镜观察LPS刺激前后的细胞形态特征, RT PCR和Western blot分别测定TLR7 mRNA和蛋白表达。结果: LPS刺激前后, 细胞中均有TLR7 mRNA 转录。LPS刺激前, 细胞较小而透亮, 树突较少, 无TLR7蛋白表达; LPS刺激后, 细胞体积增大, 树突增粗增多, 刺激后12 h、24 h、 48 h, TLR7蛋白均有表达, 且在3个时间点的表达量基本一致。结论: LPS可诱导DC2.4中TLR7蛋白的表达。 【关键词】 脂多糖 DC2.4细胞 TLR7 Toll样受体(Toll like receptors, TLRs)是一种模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs), 可以识别病原体高度保守的结构基序——病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)。近年的研究发现, TLRs在抗感染固有免疫和介导获得性免疫应答中起关键作用[1]。Toll样受体7(Toll like receptor 7, TLR7)主要在树突状细胞(dendritic cells, DC)及巨噬细胞中表达, 可识别单链RNA病毒[2], 在宿主抗单链RNA病毒(如HIV、 HCV、 流感病毒等)的免疫应答中发挥重要作用[3]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是Toll样受体4(Toll like receptor 4, TLR4)的天然配体, 可诱导DC成熟及强烈的Th1型免疫应答[4], 最近Severa等[5]研究发现, TLR3和TLR4的活化可增加DC中TLR7 mRNA的表达, 提示同一配体可能活化多种TLRs, 有利于扩大宿主抗病原微生物免疫应答的范围。DC2.4细胞是源于C57BL/6小鼠骨髓DC的一个永生化DC系[6], 其表面低表达TLR4[7]。为了解LPS对TLR7表达的诱导作用, 我们以DC2.4细胞为靶细胞, 用LPS刺激, 检测TLR7 mRNA和蛋白表达, 为TLRs介导的固有免疫及其信号转导研究提供重要资料。 1 材料和方法 1.1 材料 RPMI1640培养液购自Hyclone公司; 牛血清购自Gibco公司; RT PCR盒子、 TRIzolTM kit购自Invitrogen公司; Western blot发光试剂盒、 羊抗鼠一抗(多克隆抗体)、 兔抗羊二抗、 人抗鼠β actin一抗(单克隆抗体)均购自美国Santa Cruz公司; RIPA液购自中美泰克公司; DNA marker购自天根公司; 蛋白marker 购自TaKaRa公司; 胰酶、 EDTA、 PBS、 LPS均购自Sigma公司; 胰蛋白酶抑制剂cocktail购自Roches公司; DC系DC2.4由美国哈佛大学陈振海博士惠赠, 第四军医大学唐都医院感染科实验室保存。 1.2 方法 1.2.1 DC2.4细胞的培养与LPS刺激 用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640完全培养液培养DC2.4细胞于50 mL培养瓶中, 待细胞长至约80%, 弃培养液, PBS清洗细胞2次, 2.5 g/L胰蛋白酶, 0.2 g/L EDTA消化细胞8,10 min, 血清终止消化后, 以1000 r/min离心5 min, 弃上清, 新鲜培养液重悬细胞, 计数, 按1×108/L的密度接种细胞于2个6孔板中, 37?、 50 mL/L CO2孵箱培养, 待细胞长至50%,60%, 换新鲜培养液, 同时每孔按1 mg/L的浓度加入LPS, 未加LPS的孔作为阴性对照。 1.2.2 引物合成 根据GenBank上小鼠TLR7及β actin基因的序列, 设计如下PCR引物: (1)TLR7引物, 上游链: 5′ CCACCAGACCTCTTGATT 3′, 下游链: 5′ CCAGATGGTTCAG CCTAC 3′。(2)β actin, 上游链: 5′ CCAGAGCAAGAGAGGCATCC 3′, 下游链: 5′ CCGTGGTGGTGAAGCTGTAG 3′。均由上海生工合成。 1.2.3 DC2.4细胞形态的观察与蛋白提取 分别在加LPS前及加LPS后12、 24、 48和72 h用倒置相差显微镜观察细胞的形态特征。冷PBS洗涤细胞后, 用已加入蛋白酶抑制剂(cocktail 1?50)的细胞裂解液冰上裂解细胞20 min, 细胞刮刀剔刮培养孔底部, 收集裂解液, 低温离心, 12000 r/min, 10 min, 吸取上清液并分装于1.5 mL离心管中, 标记, 放-80?保存备用。以胎盘组织提取蛋白作为阳性对照。 1.2.4 反转录PCR(RT PCR)扩增TLR7基因 以胎盘细胞总RNA作为阳性对照[8], 未加TLR7引物的PCR反应体系作为阴性对照, β actin作为内参照。采用3步法RT PCR: (1)总RNA的提取: 分别离心收集DC2.4细胞和胎盘细胞约2×106个, 按照TRIzolTM kit说明书提取细胞总RNA, 用紫外分光光度计测定RNA含量。 (2)cDNA链的合成: 参照Invitrogen说明书由random hexamers primers和SuperScriptTM ? RT反应完成。(3)PCR扩增: 取cDNA 4 μL, Taq DNA多聚酶1.25 U, 上、 下游引物各10 μmol/L, dNTP 2.5 mmol/L, 10×buffer5 μL, 构成总反应体系50 μL。另设一管未加引物的50 μL反应体系作为阴性对照。各管反 应混和物同时在95?加热2 min 30 s, PCR扩增30个循环(95? 30 s, 51? 45 s, 72? 45 s), 最后延伸在72?进行8 min。内参β actin的反应体系及反应条件均与以上相同。反应产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳后用溴化乙啶染色检测, 并以UVI凝胶成像系统摄像。 1.2.5 Western blot 以胎盘细胞提取蛋白作为阳性对照, β actin作为内参照。取前面提取的各个时段的DC2.4蛋白连同胎盘组织蛋白各15 μL, 各加入4×Loading buffer 5μL, 混匀, 100?煮沸5min, 低速离心, 依次加样于100g/L SDS PAGE胶的加样孔中, 第1个加样孔中加入4 μL蛋白Marker。120 V, 2 h, 电泳, 待溴酚蓝跑至凝胶底部时, 取出凝胶, 用硝酸纤维素膜(NC膜)在半干转膜机中进行转膜, 40 mA, 1 h30 min转膜完毕, 对照蛋白Marker条带, 按照TLR7蛋白与β actin蛋白分子质量大小将NC膜剪开, 50 mL/L脱脂牛奶封闭液封闭1 h, 取出膜, 配制20 mL/L脱脂牛奶, 分别加入1?500 羊抗鼠TLR7一抗, 1?500人抗鼠β actin一抗, 4?过夜孵育; TBST洗膜3次, 10 min/次; 重新将膜放入新鲜的20 g/L脱脂牛奶中, 分别加入1?1000“兔抗羊 HRP”二抗, 1?1000“羊抗人 HRP”二抗, 37?摇床孵育2 h; TBST洗膜3次, 15,20 min/次。将洗好的NC膜分别放在干净的平皿中, 取等量显影液A液与B液在离心管中混匀, 用枪头将其均匀撒在NC膜上, 置于凝胶成像仪的暗室中曝光, 显影, 电脑采集图片。 2 结果 2.1 LPS刺激DC2.4前后细胞形态的变化 LPS刺激前, 细胞形态偏圆形、 较小、 透亮, 树突较少。LPS刺激后分别于12、 24、 48和72 h观察细胞, 发现细胞树突增多增粗, 部分细胞体积增大(图1)。 2.2 反转录PCR(RT PCR)检测DC2.4中TLR7 mRNA 经EB染色的15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测, 紫外投射仪观察后凝胶成像系统成像(图2, 3)。胎盘组织阳性对照与DC2.4细胞中均有TLR7 mRNA转录, 其扩增产物大小为314 bp, 阴性对照孔无扩增产物。内参照β actin在胎盘组织与DC2.4细胞中均有扩增产物, 产物大小为437 bp, 与实验设计的目标产物大小一致。 2.3 Western blot分析LPS刺激DC2.4前后TLR7蛋白表达 在胎盘(阳性对照)及LPS刺激后12、 24和48 h的DC2.4 细胞中, 均可见TLR7蛋白表达, 胎盘中表达最强, LPS刺激的DC2.4细胞TLR7蛋白表达相对较弱, 但3个时间的蛋白表达水平相当。在LPS刺激DC2.4前及刺激后72 h, 未见TLR7蛋白表达。 3 讨论 TLRs属?型跨膜蛋白。迄今, 已发现的TLRs家族成员有11种, 它们在细胞内均有一定的分布。TLR1、 2、 4、 5、 6表达于细胞表面, TLR3、 7、 8、 9存在于细胞的胞内体(endosome)。体内免疫细胞如巨噬细胞、 中性粒细胞、 DC均可高水平表达多种TLRs。DC是一群异质性的抗原提呈细胞(APC), 是联系固有免疫和适应性免疫的桥梁。研究发现, TLR7在成熟的浆细胞样DC(pDC)和髓样DC(mDC)中均有表达。 要获得有TLR7表达的成熟DC, 以往大都采用从骨髓细胞或外周单核细胞分离不成熟DC进行培养8,10 d, 再往培养基中添加GM CSF、 IL 4、TNF α、 LPS等诱导其成熟。这种方法既费时又昂贵。也曾有报道用TLRs配体或IFN α刺激不成熟树突状细胞, 可使其表面CD80、 CD86、MHC ?等共刺激分子的表达上调[9, 10], 活化T细胞, 介导适应性免疫。本研究中, 采用小鼠骨髓来源的永生化细胞系DC2.4, 可以克服体外分离培养DC成本高, 费时费力的缺点。该细胞系在普通培养基中即可生长, 且易于大量传代, 适于DC功能及抗感染免疫研究[9]。 本研究结果显示, 未被LPS刺激的DC2.4有TLR7 mRNA转录, 但未见TLR7蛋白表达, 提示DC2.4中TLR7基因只有转录而无蛋白翻译。其原因可能是DC2.4系不成熟DC[7], 其中某些信号系统没有被激活, 导致TLR7 mRNA 翻译蛋白受阻。本实验用TLR4的天然配体LPS刺激DC2.4细胞, 在刺激后的12、 24、 48和72 h分别提取蛋白, Western blot分析, 发现在刺激后12、 24、 48 h均有TLR7蛋白的表达, 但在72 h后TLR7蛋白表达即消失。因此, 我们推测LPS可能通过DC2.4表面的TLR4激活TLR7相关信号途径, 并进一步激活了TLR7 mRNA翻译蛋白途径, 从而诱导TLR7蛋白在DC2.4中的表达, 这种作用大约能维持48 h。上述结果提示, 存在于DC中的TLR4与TLR7在特异性识别病原微生物配体时, 并不是孤立地跟自己特定的配体结合诱导天然免疫应答反应, 而是存在协同作用, 至于TLR4与配体LPS结合后如何引起TLR7蛋白的表达, Severa 等[5]认为可能是由于LPS刺激TLR4后诱导了?型干扰素的表达, 从而进一步激活了干扰素调节因子 1(IRF 1)转录, 而IRF 1基因的绑定位点刚好位于TLR7基因的启动子内, 又激活了 TLR7转录。值得注意的是, 本研究显示DC2.4有TLR7 mRNA转录, 而无TLR7蛋白翻译, 说明LPS刺激TLR4诱导TLR7蛋白表达不仅仅靠IRF 1转录激活引起, 可能还存在其他通路, 但其路径以及TLR4与TLR7间存在怎样的协同作用, 将有待进一步研究。 【