猪卵母细胞孤雌激活的初步研究

猪卵母细胞孤雌激活的初步研究 第25卷增刊V Ol_25,Sup. 广西农业生物科学JournalofGuangxiAgric.andBio[.Science2006年9月 Sept.,2006 文章编号:1008—3464(2006)增一0015—03 猪卵母细胞孤雌激活的初步研究 ,谭世俭,石德顺 刘继龙,田国富 (广西大学动物繁殖研究所,广西南宁530005) 摘要:对不同浓度离子霉素以及不同质量(A类或混合类)的猪卵丘细胞一卵母细胞复合体(COCs)对 卵孤雌发育的效果影响进行了初步研究.结果明:(1)A类猪COCs孤雌激活后的囊胚发育率极显着的高 于混合类(30.1l%VS9.09%,P<0.01);(2)采用化学方法激活体外成熟后的猪去透明带卵母细胞,离子 霉素浓度为5~mol/L组激活后得到的卵裂率(80.35%),以及激活后48h发育到4细胞阶段的孤雌胚胎率 (62.5O%)均极显着高于浓度2~mol/L组(分别为62.22和43.33,P<0.01). 关键词:猪;卵母细胞;去透明带;离子霉素;孤雌激活 中图分类号:Q132.11文献标识码:A Primarystudyonparthen0geneticactivationofporcineoocytes IIUji—long,TIANGuo—fu,TANShi—jian,SHIDe—shun (AnimalReproductionInstitute,GuangxiUniversity,Nanning530005,China) Abstract:TWOexperimentswerecarriedoutinthestudy.Experiment1wastostudytheeffect of differentqualityofporcinecumulusoocytecomplexes(COCs)onparthenogenesisdevelop mentafter parthenogeneticactivation.Theeffectofionconcentrationontheparthenogenesisofinvitro maturation(IVM)porcineoocyteswasstudiedinExperiment2.Theresultsasfollows:(1)The blastocystsrate(CR)fromtheclassAporcineoocyteswasgreatlysignificantlyhigherthanthatfrom themixedclasses(30.11VS9.09,P<0.01).(2)Whenionomycinconcentrationwas5/~mol/ I,theCRandthepercentageof4-cellstageembryos48hafterparthenogeneticactivationwere 80.35and62.50~,40respectively,whichweregreatlysignificantlyhigherthanthatusing2mol/1 ion(62.22and43.33respectively,P<0.01). Keywords:pig;oocytes;zona—free;ionomycin;pathenogeneticactivation 在畜牧生产中,利用猪体细胞核移植技术可培育优良的猪种,加速猪遗传改良进程; 在生物医学 上,利用转基因克隆技术生产经遗传修饰的克隆猪,可以提供大量廉价的移植器官, 以补充人类移植 器官的严重不足和生产一些特定的蛋白质等方面具有广阔的前景. 目前体细胞核移植技术己在牛,山羊,小鼠,猪等许多动物上获得成功n],但总体效 率不高,而猪 的体细胞核移植效率则更低,出生活仔数与移植胚的比率仅为1左右.孤雌激活是 核移植技术的关键 环节之一.猪核移植胚胎囊胚发育率低的一个主要原因可能是目前人工激活效率 不高所致.因此,研 究探索有效的猪卵母细胞孤雌激活方法,对提高克隆猪的效率有重要意义. 收稿日期 基金项目 作者简介 通讯作者 2006—08—08 广西回国基金项目(桂科回0448004). 刘继龙(1981一),男,广西岑溪人,硕士研究生. 谭世俭,研究员;E—mail:tansj?gxu.edu.cn. 广西农业生物科学 1材料与方法 第25卷 1.1卵母细胞的采集和体外成熟培养 从屠宰场回收卵巢,保存在加有双抗的30,35.C的灭菌生理盐水中,并在4h内送回实验室.采用 注射器抽取法采集卵巢表面直径约2,6ri1ill卵泡中的卵母细胞.卵母细胞先在含有促卵泡素(FSH)的 TCM一199成熟培养液中培养24h后,换成不含FSH培养液继续培养至48h.培养条件为38.6., 5C().的空气,相对饱和湿度. 1.2卵母细胞的激活 卵母细胞在培养48h后,通过移液枪反复吹打,将已经扩散的卵丘细胞去除,然后移入离子霉素 (Ionom3,cin)激活液培养5min,再移入到浓度为2/~rnol/[的6一二甲氨基嘌呤(6-DMAP)中继续激活 培养3,5h. 1.3微穴的制作 为了防止无透明带的裸卵在培养的过程中发生粘连,本实验采用微穴法(wellofwell,WOWs)来 隔离培养.微穴的制作根据Vajta报道的方法作了一些改进.先将已经加入400INCSU23培养液, 上覆盖400I矿物油的4孔培养皿放入CO.培养箱中预热2h以上,然后手握自行装上手柄的大缝衣 钢针,用力并做顺时针旋转摇动,在培养皿孔的底部均匀分布地压下70,80个圆 锥形的小凹.培养时, 往各个小凹放入一枚裸卵,这样卵与卵之间在培养时就不会相互接触而发生粘连. 1.4激活卵的体外培养 孤雌胚胎的体外培养液为NCSU23.本实验采用微滴法(100I/滴)培养具有完整透明带的猪卵 母细胞,微穴法培养去透明带的猪卵母细胞.将激活后具透明带的猪卵母细胞,以20,30个一组放入 到各个培养液微滴中,每隔48h更换1/2液体.去透明带的猪卵母细胞激活后移入微穴中,每个小穴 放一枚裸卵,进行7d的体外培养,中途不再更换NCSU23培养液. 激活48h后观察卵裂及胚胎的发育情况,第6天观察囊胚发育情况,计算卵裂率和囊胚率. 1.5试验 1.5.1不同质量的猪COCs孤雌激活的效果根据卵母细胞卵丘细胞的有无和数量多少,参照钱云 等__4报道的方法,猪卵母细胞可分为如下三类: A类:5层以上卵丘细胞紧密包裹; B类:5层以下卵丘细胞包裹,卵丘完整无裸露的透明带; C类:裸卵,有极少或无卵丘细胞包裹. 实验将用注射器法抽取的卵母细胞随机分为两组,一组只挑选A类卵母细胞来培养,其他的弃用. 另外一组则不做任何挑选,A,B,C三类卵母细胞混合培养. 1.5.2不同浓度的离子霉素(Ion)激活去透明带卵的效果混合类体外成熟的猪卵母细胞经消化去除 透明带后随机分成两组,分别移入到含离子霉素浓度为5/~mol/[或2>mol/[的激活液中激活,再用 6-DMAP激活处理后,采用微穴法进行7d的体外发育培养. 1.6数据处理 卵裂率,囊胚率均以该组培养卵母细胞为基数计算,实验所得数据以单因素方差分 析进行统计学 处理. 2结果与分析 2.1A类或混合类猪COCs孤雌激活的效果 表1的数据表明,虽然A类卵母细胞激活后的卵裂率与混合类卵并没有显着的差异(88?17VS 83.120//,P>0.05),但A类卵激活后的囊胚率极显着地高于?昆合类(30.11VS9.09%,P<0.01). 增刊刘继龙等:猪卵母细胞孤雌激活的初步研究 表1不同质量的猪COCs的孤雌激活效果 Tab.1EffectofdifferentqualityofporcineCOCsontheirdevelopmentafterparthen0genetic activation 注(Note):A,B,P<0.01 2.2不同浓度的离子霉素激活去透明带卵的效果 从表2的数据可以看出,激活剂浓度的改变对去透明带的猪卵母细胞孤雌激活存在着较大的影响. 激活剂(Ionomycin)的浓度为5ptmol/I组卵母细胞激活48h后的卵裂率(80.35)和发育到4细胞 阶段的孤雌胚胎率(62.50)均极显着地高于浓度为2ptmol/i组(分别为62.22和43.33, P<0.01). 表2不同浓度的Ion激活去透明带卵的效果 Tab.2Effectofdifferentionconcentrationontheparthen0genesisofzona—freeporcineoocytes 注(Note):A,B,(,D?P<0.01. 3讨论 卵丘细胞的完整与否影响着猪卵母细胞的体外成熟与孤雌激活效果.卯母细胞成熟的过程中所需 的营养物质依赖卵丘细胞来提供,两者之间通过缝隙连接进行信号传导,进而调节卯母细胞的生长和 成熟.卵丘细胞的扩散是伴随着卵母细胞质的成熟而同时发生的.而扩散的卯丘可调节物质的通透性, 诱捕卵子排出的有害因子,从而有效地抑制卵子的退化.卵丘细胞可将葡萄糖转化为丙酮酸,为卵母 细胞的生长和发育提供能量.如果两者间缝隙连接被过早破坏,卵母细胞可能停止发育.从本研究的 结果可以看出,来自A类猪卵母细胞的孤雌囊胚率达到了30.1l,而来自混合类卵母细胞的囊胚率只 达到9.09,差异极其显着.这可能是由于混合类有大部分卵子,在体外发育过程中的营养物质供应 相对不足,体外成熟质量差,而造成随后的发育能力降低.据邓满齐等【5报道,猪裸卯的成熟率平均只 有11.4,这也可以说明卵匠细胞在卵母细胞成熟过程中发挥着重要作用.由此可见,在进行猪胚胎 研究时,A类卵母细胞是进行体外发育培养的最佳选择. 激活剂的浓度是影响卵母细胞激活及体外发育的重要因素之一.本实验结果表明,体外成熟的猪 卵母细胞去透明带后,其激活剂浓度的改变,会造成去透明带的猪成熟卵母细胞孤雌激活培养的效果 发生变化.在实验中,激活剂的浓度由9ptmol/I上升到5~mol/I时,激活后的卵裂率由62.22上升 到80.35,激活48h时发育到4细胞阶段的孤雌胚胎率也相应由43.33上升至62.50,这表明了 去透明带的猪卯母细胞对激活剂(Ionomycin,浓度的变化比较敏感.谭世俭等【6采用不同浓度的钙离 子载体A23187液,对去透明带的猪卵母细胞进行孤雌激活研究,其结果表明,猪卯母细胞去透明带后, 对A23187的敏感性增加,以浓度为2.5/2mol/I的A23187获得最佳的卵母细胞存 活率及发育囊胚率. 本试验在激活剂(Ionomycin)浓度为5~mol/I组的激活中,猪卯孤雌发育到4细胞阶 段的胚胎率比浓 度为2~mol/I组的高,显示胚胎的早期发育在一定程度上也受激活条件的影响.因 此,采用浓度为 5~mol/I离子霉素激活可获得比较好的效果. (下转第30页) 广西农业生物科学第25卷 [-36]CHENY,FOOTERH,BROCKETTCC.Effectofsucrose,treha1ose,hypotaurine.taur ine,andbloodserum onsurvivaloffrozenbullspermI-J].Cryobiology,l993,30(4):423—431.' [-37~ [-38~ [39] [40] [41] [-423 [--43] WOELDERSH,MATTHIJSA.ENGEIB.Effectsoftrehaloseandsucrose,osmolalityofthef reezingmedium,and coolingrateonviabilityandintactnessofbullspermafterfreezingandthawing[J].Cryobiolo gy.1997,35(2): 93—1O5. NAUKVA.Changesinmembranepermeabilityandstabilityofprotein— cholesterolcomplexesofsDermatozoa duringtheprocessingofbullsemenI-J].Sel'skokhozyaistvennayaBiologiya.1974,9(1):102 —108. ANCHORDOGUYTJ,RUDOLPHAS,CARPENTERJF,eta1.Modesofinteractionofcry oprotectantswith membranephospholipidsduringfreezing[J].Cryobiology,1987.24:324—331. JOHNHC,LOISMC,JOHNFC,eta1.InteractionsofsugarswithmembranesI-J].BiochimBiophysActa. 1988.947(2):367-384. 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