伤口分泌物涂片与实时荧光定量PCR对产气荚膜梭菌快速诊断的意义

伤口分泌物涂片与实时荧光定量PCR对产气荚膜梭菌快速诊断的意义 伤口分泌物涂片与实时荧光定量PCR对产 气荚膜梭菌快速诊断的意义 ? 913? ? 短篇论着? 伤口分泌物涂片与实时荧光定量PCR对产气荚膜梭茵 快速诊断的意义 陈丽丹,石玉玲,李林海,孙朝晖,唐玲玲,王露霞 【摘要】目的比较涂片镜检查找革兰阳性粗大杆菌与实时荧光定量PCR这两种方法对快速诊断产气荚膜梭茵 的意义.方法选取疑似气性坏疽且伤12分泌物涂片镜检发现革兰阳性粗大杆菌的患者16例,取其伤口分泌物进行实 时荧光定量PCR及细菌培养.结果16例涂片镜检查到革兰阳性粗大杆茵的患者中,有6例实时荧光定量PCR为阳 性并培养出产气荚膜梭菌.结论与传统的涂片方法相比,实时荧光定量PCR方法能更准确,更灵敏地诊断产气荚膜 梭茵. 【关键词】气性坏疽;伤口分泌物;涂片;显微镜检查;实时荧光定量PCR;梭茵,产气荚膜 【中图分类号】R633.2【文献标识码】B【文章编号】1007—9572(2012)03—0913-02 RoleofWoundSecretionSmearsandReal—timeQuantitativePCRinRapidDiagnosisofClostridiumPerfringens CHENLi—dan,SHIYu—ling,LILin—hai,eta1.GeneralHospitalofGuangzhouCommandofP,Guangzhou510010, China 【Abstract】 ObjectiveTocompareusingsmearexaminationinsearchinggrampositivebacillusmethodwithreal—time quantitativePCRmethodinrapiddiagnosisofclostridiumperfringens.Methods16patientswithsuspectedgaseousgangrene whowerealsofoundgrampositivebacillusbytheexaminationofwoundsecretionsmearweFeassignedtoreceivereal——timequan?- titativePCRandbeperformedwoundsmearbacteriologicalculture.Results6outofthe16patientswereconfirmedpositiveby real—— timequantitativePCRandatthesametimetheirwoundsmearbacteriorlogicalculturewasalsofoundclostridiumperfrin— gens.ConclusionReal— timequantitativePCRismoreaccurateandsensitiveforrapiddiagnosisofclostridiumperfringens comparedwiththetraditionalmethodofsmearexamination. 【Keywords】Gasgangrene;Woundsecretion;Smears;Microscopy;Real— timequantitativePCR;Clostridiumper- fringens 产气荚膜梭菌属于厌氧梭菌属,镜下 为革兰阳性粗大杆菌,两端钝圆,能形成 芽孢,是引起气性坏疽最常见的病原体. 由于该病发展迅猛,诊断和治疗稍有延误 即可致身残甚至危及生命,因而快速,准 确地检出产气荚膜梭菌是保存伤肢和挽救 患者生命的关键.本研究以临床疑似气性 坏疽且伤口分泌物涂片镜检查到革兰阳性 粗大杆菌的患者为研究对象,探讨涂片法 与荧光定量PCR法对产气荚膜梭菌快速 诊断的意义. 1资料与方法 1.1一般资料选取2009年8月_2OlI 基金项目:全军医学科学技术研究"十一 五"重大专项(08Z009) 作者单位:510010广东省广州市,广州军 区广州总医院检验科 年8月在广州军区总医院,广东省人民医 院,南方医院,广州市第一人民医院住 院,怀疑产气荚膜梭菌感染且伤口分泌物 涂片镜检查到革兰阳性粗大杆菌患者16 例为研究对象.其中男11例,女5例, 年龄17,52岁,平均36.5岁,致伤原因 均为车祸. 1.2设备与试剂革兰染液由BASO公 司生产:API生化鉴定试剂盒和VITEK一 2全自动微生物分析仪由法国梅里埃生 产;RocheLightcyeler480全自动荧光定 量PCR扩增仪,细菌模板提取试剂盒由 罗氏诊断产品(上海)有限公司生产; Real—timePCR反应试剂由ABI公司生 产.质控标本:产气荚膜梭茵株 ATCC13124购于美国菌种库;大肠埃希 菌标准株ATCC25922为检验科细菌室保 存菌株. 1.3鉴定方法 1.3.1细菌培养及鉴定取l6例患者的 伤口分泌物进行需氧菌及厌氧菌的培养, 普通需氧菌采用VITEK一2仪器鉴定,芽孢杆菌及厌氧菌采用API生化鉴定试剂盒 鉴定. 1.3.2实时荧光定量PCR(1)从伤 口分泌物中提取DNA,制备模板.(2) 探针的序列为:5一[FAM]TCATCAT- TCAACCAAAGGAGCAATCC『TAMRA1 — 3,弓I物1序歹0为:5一CGCATA— ACGTI'GAAAGATGG一3,引物2序列为: 5一CCTTGGTAGGCCGITI'ACCC一3.(3) PCR体系:5p,1缓冲液,1ldNTPs,引 物1,2各1Ixl,0.6Ixl探针,0.2lTaq 酶及2l细菌DNA模板,无菌双蒸水补 足体积25l.(4)RocheLightCyeler480 全自动实时荧光定量PCR扩增仪,程序: ? 9l4? 95?5rain,95oC15S,5520S,72 ?2OS,55?时采集荧光,重复40个循 环.阳性对照为产气荚膜梭菌 ATCC13124;阴性对照为大肠埃希菌 ATCC25922. 2结果 2.1实时荧光定量PCR结果16例伤口 分泌物涂片镜检发现革兰阳性粗大杆菌患 者,其伤口分泌物经实时荧光定量PCR 检测阳性者6例. 2.2细菌培养鉴定结果16例患者中培 养出需氧芽孢杆菌8例;厌氧菌8例,其 中产气荚膜梭菌6例,生孢梭菌和坏疽梭 杆菌各1例(见1,图1,2). 表1伤口分泌物涂片革兰染色镜检与PCR检 测及细菌培养的结果比较 Table1Woundspecimencultureresultscompare withsmearsandreal—timequantitative PCR 标本橥崔检测PCR细菌培养 1Gb一 2G+h一 3G+hGC一 4G+bC—b一 5GbGC一 6GbGc一 7Gb(有芽孢)一 8Gb(有芽孢)一 9Gb(有芽孢)一 l0G+b(有芽孢)一 11Gb+ 12G+b+ 13Gb+ 14Gb(有荚膜) 15Gb(有芽孢) l6GbGCGb+ 蜡样芽孢杆菌 蜡样芽孢杆菌 粪肠球菌,巨大芽孢杆菌 奇异变形杆菌,肺炎克雷伯, 蜡样芽孢杆菌 迟缓芽孢,金黄色葡萄球菌 坏疽梭杆菌(厌氧),戊糖片 球菌,溶血隐秘杆菌 芽孢杆菌 梭菌属某些种 生孢梭菌(厌氧),弗氏柠檬 酸杆菌,鸟肠球菌 极小棒状杆菌,蜡样芽孢杆菌 产气荚膜梭菌 产气荚膜梭菌 产气荚膜梭菌 产气荚膜梭菌 产气荚膜梭菌 产气荚膜梭菌,粪肠球菌,大 肠杆菌 注:Gb=革兰阳性杆菌,G—b=革兰阴 性杆菌,Gc:革兰阳性球菌 3讨论 气性坏疽是一种严重的,以肌肉组织 坏死为特征的急性特异性感染疾病,其主 要的病原体为产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens),又称魏氏杆菌,约占80%, 其次为败毒梭菌(Clostridiumsepticum), 诺维梭菌(Clostridiumnovyi),溶组织梭 菌(Clostridiumhistolyticum),双酶梭菌 (Clostridiumbifermentans),谲诈梭菌 (Clostridiumfallax)等.过去,气性坏 疽多由战伤引起,目前多与外伤,手术, 皮肤感染,烧伤,肿瘤等相关,地震后亦 常有本病流行.由于本病发展迅速,预后 较差,因而快速且准确地鉴定产气荚膜梭 菌对气性坏疽的诊治具有重要意义.临床 上对气性坏疽早期诊断的依据为:伤后, 术后伤口出现剧烈疼痛,伤口周围有捻发 音,局部创面有恶臭性血性分泌物;坏死 肌肉组织及创面分泌物涂片镜检有大量革 兰阳性杆菌;X线,CT,MRI检查坏死 肌肉内有积气.最终确诊的依据是伤 口分泌物培养出产气荚膜梭菌或其他引起 气性坏疽的厌氧梭菌.然而厌氧菌的培养 鉴定至少需要4d以上的时间,容易延误 病情,且并非每个检验科都具备厌氧菌培 养的条件.因而一般认为伤口分泌物涂片 镜检找到革兰阳性粗大杆菌是早期诊断的 重要依据. 本研究以疑似气性坏疽且伤口分泌物 涂片镜检发现革兰阳性粗大杆菌的患者为 研究对象,取其伤口分泌物做细菌培养及 实时荧光定量PCR检查,并对比了3种 检查方法的检测结果.所选的16例患者 的伤口分泌物涂片镜检均找到革兰阳性粗 大杆菌,且形态没有明显的差异,其中有 8例培养出需氧芽孢杆菌,8例培养出厌 氧菌(产气荚膜梭菌6例,生孢梭菌1 例,坏疽梭杆菌1例).回顾涂片镜检结 果,产气荚膜梭菌的涂片有的有芽孢,有 的有荚膜,有的芽孢荚膜都没有;而其他 如蜡样芽孢杆菌同样可以出现芽孢,镜下 难以区分.临床上通常将症状疑似气性坏 疽(如有捻发音及伤口肿胀)患者的伤 口分泌物送检涂片,若查到革兰阳性杆菌 基本可断定是产气荚膜梭菌感染.然而从 本研究看来,涂片为革兰阳性粗大杆菌的 有可能是致病的其他厌氧芽孢杆菌,也可 能是伤口污染的芽孢杆菌.因而为避免误 诊需要寻求准确性更好的诊断方法.实时 荧光定量PCR方法是针对产气荚膜梭菌 的16srDNA设计引物及探针,特异性好, 灵敏度高.在这16例患者中有6例伤 口分泌物PCR阳性,与培养的结果完全 一 致.该法耗时较短,整个过程只需3h, 能满足临床快速准确诊断气性坏疽的要 求.特别是发生地震等重大灾难或事故 时,能进行大批量的筛查,可节约人力物 力,也有利于医生快速诊断,及时保留伤 肢和挽救患者生命. 图1伤口分泌物中的产气荚膜梭菌 Figure1Clostridiumperfringensinwoundsecre— tion , 一| _瓣 鬻《?- , - — 冁 参考文献 1陈军,卢洪洲.气性坏疽的诊断与治疗 [J].诊断学理论与实践,2009,8(1): 111—113. 2秦文,李国勇,曾月东.创伤气性坏疽早 期诊治体会[J].中国中医骨伤科杂志, 2007,15(1O):27—28. 3陈庆永,王春友.早期伤口分泌物涂片检 查对创伤性气性坏疽早期诊断的作用[J]. 中华急诊医学杂志,2006,15(9):781— 783. 4石玉玲,曾兰兰,陈丽丹,等.产气荚膜 梭菌实时荧光方法的建立[J].生物技术 通讯,2010,21(3):389—392. (收稿日期:2011—1O一23; 修回日期:2012—02—06) (本文编辑:王俊懿)