6-巯基嘌呤的代谢

6-巯基嘌呤的代谢 6,巯基嘌呤的代谢 与硫嘌呤甲基转移酶的遗传多态性 项目完成人:牟德海 郑家概 闫世平 辜英杰 喻凌寒 项目完成单位:中国广州分析测试中心 广东省化学危害应急技术重点实验室 1、6-巯基嘌呤的代谢 硝基咪唑硫嘌呤(azathiopurine)和6,巯基嘌呤(6-mercaptopurine)早在50年代就用于治疗白血病，是治疗儿童急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)最为广泛应用的药物之一。在ALL的化治疗中，硫嘌呤类药物是缓解后维持治疗的主要药物，同时也用于治疗肠炎、系统性红斑狼疮、风湿关节炎和抑制器官移植病 [1-6]人的急性排斥。硝基咪唑硫嘌呤的生物活性依赖于其代谢产物6,巯基嘌呤。6,巯基嘌呤随后在细胞内通过合成代谢转化为一系列6,硫鸟嘌呤核苷(6-thioguanine nucleotides，TGNs)代谢产物，TGNs作为鸟嘌呤核苷的拮抗剂参入DNA和RNA分子，进而通过抑制DNA的复制和RNA的达而发挥细胞毒作用(图和图2)。 硝基咪唑巯嘌 呤 5-甲基-4-硝基-5-硫咪唑 6,巯基嘌呤 (无活性) 硫嘌呤甲基转移酶 黄嘌呤氧化酶 (TMPT) (XO) 次黄嘌呤鸟嘌呤 磷酸核糖转移酶 甲基硫嘌呤 (HGPRT) 6,硫尿酸 (无活性) 6-硫次黄嘌呤核苷一磷酸 硫嘌呤甲基转移酶 (TMPT) 次黄嘌呤核苷磷酸脱氢酶(IMPD) 或 鸟嘌呤核苷一磷酸合成酶(GMPS) 6,甲基巯基嘌呤核苷 6,硫鸟嘌呤核苷 [7] 图1. 硝基咪唑硫嘌呤和6,巯基嘌呤的代谢 380 SCHSCHSCH3SCH333 NNNNNPPNNN NNNNNNNNNHNH22PHOHOPCHCHCHCH2222OOOO OHOHOHOHOHOHOHOH6-methyl-thioguanosine6-methyl mercaptopurine 6-methyl-thioguanine6-meyhyl-thioinosinemonophosphateribosideribosidemonophosphate 6,甲基巯基嘌呤核苷 6,甲基硫次黄嘌呤核苷一磷酸 6,甲基硫鸟嘌呤核苷一磷酸 6,甲基硫鸟嘌呤核苷 SHSHSHTPMTTPMTSHTPMTTPMT NNPHNNP2NNNN NNNNNNNNNHNH22PPHOHOCHCHCHCH2222OOOO OHOHOHOHOHOHOHOH6-thioguanine6-thioguanosine6-thioinosine6-mercaptopurineribonsidemonophosphatemonophosphateriboside 6,巯基嘌呤核苷 6,硫次黄嘌呤核苷一磷酸 6,硫鸟嘌呤核苷一磷酸 6,硫鸟嘌呤核苷 HGPRTHGPRTSHSCHSCHSH33 TPMTNNTPMTNNNNNN NNNNNNNNNHNHH22HHH6-methyl-thioguanine6-thioguanine6-mercaptopurine6-methyl-mercaptopurine 6,硫鸟嘌呤 6,甲基硫鸟嘌呤 6,甲基巯基嘌呤 6,巯基嘌呤 SHXOguanaseNN NNOHH 6-thioxanthine6,硫黄嘌呤 XOSH NNHONNOHH 6-thiouric acid 6,硫尿酸 [8] 图2. 6,巯基嘌呤的代谢产物 TPMT: thiopurine methyltransferase(硫嘌呤甲基转移酶)，HGPRT:hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)，XO:xanthine oxidase(黄嘌 呤氧化酶)，guanase:鸟嘌呤酶 381 在血浆和组织中硝基咪唑硫嘌呤被转化为6,巯基嘌呤和无活性的S,甲基,4,硝基,5,硫咪唑(S-methyl-4-nitro-5-thioimidazole)。6,巯基嘌呤可以通过几种酶途径进行代谢。(1)在硫嘌呤甲基转移酶(thiopurine methyltransferase，TPMT)途径中，6,巯基嘌呤被转化为无活性的甲基硫嘌呤(methyl-thiopurine)代谢产物。(2)在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase，HGPRT)途径，6,巯基嘌呤作为次黄嘌呤的类似物而被HGPRT作为底物转化为6,硫次黄嘌呤核苷一磷酸(6-thioinosine monophosphate，TIMP)。随后TIMP在次黄嘌呤核苷一磷酸脱氢酶(inosine monophosphate dehydrogenase，IMPD)和鸟嘌呤一磷酸合成酶(guanine monophosphate synthetase，GMPS)作用下被转化为硫鸟嘌呤核苷一磷酸(thioguanosine monophosphate，TGMP)，TGMP在磷酸激酶的作用下形成6,硫鸟嘌呤核苷二磷酸(6,thioguanosine diphosphate，TGDP)和6,硫鸟嘌呤核苷三磷酸(6,thioguanosine triphosphate，TGTP)。TGMP，TGDP和TGTP统称为硫鸟嘌呤核苷(TGNs)。TIMP和TGMP也可以在TPMT作用下转化为甲基硫次黄嘌呤核苷一磷酸(methylthioinosine monophosphate，MeTIMP)和甲基硫鸟嘌呤核苷一磷酸(methylthioguanosine monophosphate，MeTGMP)。(3)在黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)途径，6,巯 [7-10] 基嘌呤被转化为6,硫尿酸。 2、硫嘌呤甲基转移酶 在DNA合成中TGNs整合到肿瘤细胞DNA和RNA分子中，影响DNA的复制及RNA的表达而发挥抗肿瘤作用。TIMP和TGMP的甲基化产物MeTGMP和MeTIMP能够抑制磷酸核糖焦磷酸化氨基转移酶(PRPP-AT)的活性，而PRPP,AT是细胞从头合成嘌呤步骤中的关键酶。因此，抑制PRPP-AT的活性就阻断了肿瘤细胞遗传信息的表达。也就是说，6,巯基嘌呤的细胞毒作用来自两个方面:一是代谢产物6,TGNs整合进入DNA和RNA从而抑制DNA的复制和RNA的表达;二是代谢产物MeTGMP和MeTIMP抑制嘌呤的从头合成。TPMT是6-MP代谢的关键酶，它催化TIMP转化为MeTIMP从而抑制嘌呤的从头合成，也催化6,MP转化为6,甲基巯基嘌呤(MeMP)，使硫嘌呤类药物失去活性而解毒。 在6,巯基嘌呤的代谢过程中，存在两种酶与HGRPT竞争，从而减少细胞中6,TGNs的含量:一种是黄嘌呤氧化酶，它将6,巯基嘌呤转化为硫尿酸，尽管这也是6,巯基嘌 382 呤失活的一个重要途径，但黄嘌呤氧化酶在个体之间的差异并大;另一种是硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)，它使6,巯基嘌呤转化为甲基硫嘌呤而失活。研究表明，TMPT的活 [9]性在个体之间的差异是很大的。不同的病人对硫嘌呤类药物的反应不同，即治疗效果和毒性反应不同，就是由于个体之间TPMT活性不同造成的。 已经发现细胞内硫鸟嘌呤的浓度与TPMT的活性成负相关。缺乏野生型TPMT并具有高浓度变异体TPMT的病人能累积高浓度的硫鸟嘌呤代谢物而导致致死性的骨髓毒性。具有中等活性TPMT活性的病人，较少积累硫鸟嘌呤核苷，但与具有正常TPMT活性的病人相比，这些病人仍然有较高的发生骨髓和其他毒性的危险。因而，约有10%的病人用硝基咪唑硫嘌呤治疗时发生硝基咪唑硫嘌呤诱导的骨髓毒性的危险增加。在治疗前如果医生了解病人TPMT的状态，这种危险是可以减小或避免的。相反，如果病人的 [7, TPMT活性很高，则可能对硫嘌呤类药物没有响应，因为他们很快就从人体被清除掉了9, 10]。参见图3。 正常TPMT酶活性的病人 6-巯基嘌呤 TPMT 其他酶 野生型 活性和有潜在无活性代谢物 毒性的代谢物 6-巯基嘌呤 TPMT酶活性改变的病人 TPMT 其他酶 野生型 无活性代谢物 活性和有潜在 毒性的代谢物 [7]图3. 硫嘌呤甲基转移酶缺乏对6,巯基嘌呤代谢的影响 3、硫嘌呤甲基转移酶的遗传多态性 TPMT的活性受TPMT酶系统的遗传多态性影响，在病人之间是各不相同的，86.6%的病人TPMP活性高，11.1%的病人有中等活性的TPMT，另外0.3%的病人缺乏TPMT。在具有正常TPMT活性的病人中发现的大多数TPMT被称为“野生型”TPMT。在低活 383 性TPMT病人中发现了高浓度的TPMT“变异体”(TPMT 2，TPMT 3A，TPMT 3B，TPMT 3C):TPMT 3A变异体的病人完全失去了TPMT催化活性，TPMT 3B变异体的病人的 [5, 7]TPMT的催化活性减少到1/9，TPMT 3C变异体病人的TPMT活性减到1/1.4。编码TPMT的基因位于人类染色体的6p22.3，其长度约34 kb，包括10个外显子和9个内含子。TPMT 2、3A、3B和3C等位基因的变异见图4。 图4. TMPT基因的等位变异 到目前为止，国外研究者已在该片段上共发现20种突变基因型，其中5种突变型肯定影响TPMT的活性，另有3种可能影响TPMT活性。现在，研究者已确定部分基因型， [11, 12]如TPMT 2、3A、3B和3C，这四种基因型已占低TPMT活性者的95%。TPMT 2突变是TPMT基因238位点上的鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)发生颠换，即G238C,从而导致第80个密码子上丙氨酸(Ala)由脯氨酸(Pro)取代(即Ala,Pro)，这种突变使其酶活性低于正 [13]常100倍。TPMT 3A 突变型基因在阅读框内发生两个位点的碱基颠换(G460A和A719G)，导致第154个密码子的Ala由苏氨酸(Thr)取代(Ala,Thr)，和第240个密码子上的酪氨酸(Tyr)由半胱氨酸(Cys)取代(Tyr,Cys)，这种突变当在酵母体内COS,1 [14]细胞以杂合子表达时，其酶活性低于正常200倍。已证实这与TPMT突变蛋白产物水解加速有关，这些TPMT突变蛋白由TPMT 2及TPMT 3A编码，半衰期为15分钟，而 384 野生型(即TPMT 1)基因编码蛋白半衰期为15 h。TPMT 3B突变为TPMT基因上460位点的鸟嘌呤由腺嘌呤取代(即G460A)，从而导致第154密码子的Ala由Thr取代，使其酶活性下降9倍。TPMT 3C变异为719位点上的腺嘌呤由鸟嘌呤取代(即A719G)，从而导致第249个密码子上的Tyr由Cys取代，这使其酶活性为正常酶活性的1/3。TPMT 4-8 [15]突变型也相继被阐明。 近年来随着6,MP药代动力学和药物遗传学研究的深入开展，人们已初步认识到TPMT基因型与6,MP毒性的关系。TPMT活性缺乏的病人接受常规剂量6,MP可能导致严重的甚至危及生命的骨髓抑制。Evans等人最近进行了一项关于儿童ALL中不耐受6,MP者TPMT基因型和表型关系的研究，结果发现TPMT活性缺乏及其杂合子者在有毒性反应患儿中占优势，比率达65.2%，而正常人群中仅为10%，但是通过适当调整这 [16]些患儿的6,MP剂量可避免急性毒性反应。在St Jude儿童医院的一项研究表明:在服用足量6,MP长达2.5年的疗程中，2种TPMT缺乏的基因型只完成7%化疗时段，而杂合子及纯合子TPMT野生型患者完成化疗时段分别为65%、84%;同时发现TPMT野生型、杂合子及纯合子的TPMT变型基因患者中，化疗必须减少剂量的以纯合子的TPMT突变型基因患者最多。杂合子患儿较野生型患儿更不耐受6,MP毒性而不能完成化疗[17]。最近英国的一项研究表明:在维持治疗阶段，TPMT野生型和杂合型人群中因不耐受6,MP毒性而终止治疗的百分率差异无显著性，但是在纯合子TPMT突变型基因患者 [18]中因不耐受6,MP毒性而终止治疗者达53% 。 因而，为了提高6,巯基嘌呤对儿童急性淋巴细胞白血病的治疗效果，减少其毒副作用，必需了解6,MP在不同个体中的代谢情况，根据病人个体对6,MP代谢情况的不同给以不同的用药剂量和治疗方案，也就是进行个性化治疗。了解6,MP在体内的代谢情况，一种是患者用药后测定其红细胞中TGNs的浓度，一种方法是在治疗前先测定患者红细胞中TPMT的活性即表现型，第三种方法是分析患者TPMT的基因型。 参考文献 [1] Cuffari C, Hunt S, Bayless TM. 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