Survivin磷酸化在口腔黏膜下纤维性变及其癌变组织中的表达（可编辑）

Survivin磷酸化在口腔黏膜下纤维性变及其癌变组织中的达（可编辑） 口腔医学 年 月第 卷第 期, . , . , . 磷酸化在口腔黏膜下纤维性变及其癌变组织中的表达 周晌辉‘,李力力。,蒋海鹰,王 颖’,陈顺金 ,吴晓珊 ,翦新春 摘要 目的 检测凋亡抑制蛋白 活性形式?? 位磷酸化 ? 在口腔黏膜下纤维性变及其癌 变组织中的表达,探讨 在 癌变过程中的作用及意义。方法 应用免疫组化 法检测 例正常口腔黏膜组织、 例 组织及 例 癌变组织中 ? 的表达,并以 分析 ? 的表达。结果 正常口腔黏膜上皮 组织中无 ? 表达; 癌变组 ? 阳性表达率 . %高于 组 . % ;而 早、中、晚期 组间 ? 阳性表达率无显著性差异。验证了免疫组化的检测结果。结论 ? 在 癌变过程中可能起促 进作用,为 早期诊断和治疗提供理论依据。 、 关键词 ;磷酸化;口腔黏膜下纤维性变;癌变 中图分类号. 文献标识码文章编号 ?? ? , , ,,,删, . 脚 州,船 , , “,, : , . ? , . ? . . ? . % . % .., , ..,? . . :;; ; , , : ? 在 癌变发生发展过程中的作用。 口腔黏膜下纤维性变 , 发病机制复杂,其癌变率可高达 %~ % 。 资料与方法与多种肿瘤恶性演进的临床病理特征显著相 . 一般资料 关。在前期研究中本小组已经确定在 选择年 月一 年 月期间,在中南大 癌变过程中的表达呈逐渐升高趋势 。但有关 学湘雅医院口腔颌面外科病房住院的癌变患的活性形式?? ? 苏氨酸 位 瑚一 者 例。患者均为男性,年龄 ~ 岁,平均 , 磷酸化 ?的研究鲜有报道。 岁;其中舌癌 例,颊癌 例,牙龈癌 例,口底癌 本研究利用免疫组化和方法检测 ? 例。选择该科门诊未癌变患者 例,其中 在及其癌变组织中的表达,以此推测其 早期 例,中、晚期各 例,均取颊黏膜上皮组织。 基金项目:国家自然科学基金资助项目 例患者中,男 例,女 例,年龄 ~ 岁, 作者单位: 中南大学湘雅医院 腔颌面外科,长沙; 中南 平均 . 岁。所有病例未接受放、化疗等特殊治 大学肿瘤研究所分子生物室,长沙 ; 中南大学基础医学院 疗。另选取无口腔黏膜疾病,无槟榔、烟、酒等嗜好, 病理学系,长沙 ? 通信作者:翦新春: 身体健康的志愿者正常颊黏膜上皮组织 例作为 ?: . 正常对照组,并签署知情同意书。正常对照组、未癌 口 2 0 0 9 2 2 S t o m a l 2 2 0 腔 医 学 年 月 第 2 9 卷第 期 t o o V 0 1 . 9 N o . 2 F e b . 0 9 6 2 g y , , , 一 ? O F O S F 10 0 m 1 m l m m HE 变 S 组 与癌 变 癌 变 组 标 本 均 等 分 成 两 份 , 加 入 细 胞 裂 解 缓 2 0 o l /L P 冲液 [ g 一 一 4 % 8 0 cc E S 10 0 m m o l /L 0 . 5 0 . 份经 甲醛 固定 , 另 份 置 超 低 温 冰 箱 冷 , 氯 化 钠 , % 脱 氧 胆 酸 钠 , 5 F m m l/ 二 E D T 4 。 所 有 送 理 查 诊 OS 的 临 o L 已 四 乙 A 1 % N P 0 2 0 % 冻保存 标 本 病 检 确 , 床诊 胺 酸 , , 甘 油 P i n b o r 3 0 S 1 断及 病 理 分期按 标 准进 行 。 和蛋 白酶 抑 制 剂 ] , 超 声 粉 碎 , 沸 水 浴 变 性 0 g g m i 12 0 0 r a i m i 1 . 2 主要 器 试 n 0 r / n 心 15 n 上 仪 与 剂 , 离 去 除 细 胞 碎 片 , 清液 一 B CA 5 0 迷 你 双 垂 直 电泳 槽 北 京 市 六 仪 器 厂 , 转 印 中蛋 白 浓 度 用 法 测 定 , 取 蛋 白 上 样 馏 到 ? 一 ? B i o R a d 公 司 酸 纤 维 素 M i l l i 1 2 % 的 S D S 聚 丙 酰 胺 凝 。 室 电泳槽 , 美 国 , 硝 膜 烯 胶 , 电 泳 , 转 膜 温 一 ? o r e S P 9 0 0 0 D A B 5 % 1 h S u r v i v i n 公 司 , 美 国 。 免 疫 组 化 试 剂 盒 、 的脱 脂 奶 粉 孵 育 , 用 抗 抗 体 和 抗 p P ? ? ? i 4 显 北 司 。 人 S u r a c t n ? 入 色试 剂 盒 京 中杉 金 桥 公 兔 抗 B 抗 体孵 育 , 过 夜 。 最 后 加 辣 根 过 氧 化 P v i v i n 111r3 4 二 1 h X 抗 体 以 及 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 羊 抗 物酶 标 记 的 鼠 抗 室 温 9呼育 , 化 学 发 光 检 测 , 一 二 S a n t a C r u z 显 、 。 鼠 、羊 抗 兔 抗 公 司 , 美 国 , 鼠 抗 8 光 片 曝 光 、 影 定影 a c t i n S i m a B C A 1 . 5 公 司 , 美 国 。 检 测 试 剂 盒 和 化 学 发 统计 学 方 法 g P S 1 . 试 E C L P i e r c e 。 采 用 S S 3 0 件 包 两 组 样 的 差 光 剂 盒 公 司 , 美 国 软 , 间 本 率 异 0 ? 1 . 3 S P S u r v i v i n a 0 . 0 5 免疫 组 化 法 检 测 的表 达 比较 用 检验 , 检验 水 准 。 P Y 4 经 % 甲醛 后 石 蜡 埋 常 规 标本 固 定 , 包 , 切 片 , 2 结 果 4 z m S P 三 D A B 片厚 。 步 法 检 测 , 微 波 抗 原 热 修 复 , / 2 . 1 显 色 。 已 知 阳性 的切 片做 阳性 对 照 免疫 组 化 检 测 结 果 , 苏木 素复染 用 , 一 ? P B S 2 . 1 . 1 S u r v i v i n 口 上 代替 抗 作 空 白对 照 。 在 各 组 腔 黏 膜 皮 的 表 达 分 P ? 2 S u r v i v i n 切 片 经 的 理 科 医 师 双 阅 片 布 蛋 白 主 要 表 达 于 细 胞 核 中 , 为 粗 细 所有 由 位有 验 病 盲 , P 一 × 4 0 0 5 不 不 的 褐 胞 也 着 色 每张切片 在 高倍 镜 下 观 察 个 同视 野 , 计 棕 黄色 或 色颗 粒 ; 质 有 表 达 , 但 较 0 口 5 0 细 胞 。 以 胞 和 核 内 出 现 棕 黄 色 褐 色 浅 。 正 常 腔 黏膜 上 皮 组 织 中未 发 现 阳 性 细 胞 图 数 个 质 胞 或 ? 比 强 1 。 O S F 组 织 中 S u r v i v i n 阳 染 色 较 颗粒 为 阳性 细 胞 ,按 照 阳性 细胞 所 占百 分 及 染 色 在早 、 中期 , 性 P 。 根 阳 细 为 5 级 :阳性 比 弱 , 基 底层 、 棘 层 可 见 散 在 的 胞 质 、 胞 核 染成 棕 黄 色 度分级评分 据 性 胞率分 例 ? ~ ~ r v i v 5 % 0 5 % 2 4 % 1 2 5 % 4 9 % 2 2 、 3 O S F 织 S u i n 为 分 , 为 分 , 为 分 , 的 阳性 细 胞 图 。 晚期 组 中 , P ~ 7 5 3 7 5 4 5 0 % % 为 分 , % 为 分 。 根 据 染 色 强 度 分 阳性 染 色 加 深 , 部 分 基 底 层 、 棘 层 及 粒 层 细 胞 的胞 核 一 4 + + + + + + 及 可 色 颗 密集 而 以 核 阳性 为 级 :无 , 弱 , 中等 ,强 ,分 胞 浆 内 见 褐 粒 , 均 匀 , 胞 为 ~ 一 ? 0 3 0 1 4 O S F S u r v i v i n 阳 别记 为 分 。 上 述 两 项 相加 , 得 分 、 记 为 , 主 图 。 而 在 癌 变 组 织 中 , 性 P 2 3 + 4 、 5 + + 6 7 + + + 。 成 癌 细胞 、 上 细 胞 胞 核 及 胞 质 、 为 , 为 , 、 为 细 胞 片分 布 , 大部 分 皮 ? r n B u r v i v i n 5 1 . 4 W e s t e l o t 检 i贝 4 S 的表 达 呈 深 褐 色 , 间质 细 胞 则 不 染 色 图 。 P 一 8 0 ? 标 本 经 超低 温 冰箱 冷 冻保 存 后 , 每个 取 ? ? ? r r v v i n OS F 图 l S u r v i v i n 正 口 腔 膜 上 图 2 S u v i v i n 在 O S F 早 期 上 皮 图 3 S u i 在 中期 上 皮 在 常 黏 P p p X 4 0 s P X 4 0 0 无 达 S P × 4 0 0 组 织 表 达 s P 法 0 组 织 中的表 达 法 皮 组 织 中 阳 性 表 法 中的 - - - i i n s i n F i 1 N o o s i t i v e e x r e s s i o n o f S u r v i v i n F i 2 P S u r v i v i n e r e s s i o n i n F 3 P S u r v i v e r e s i o n x p g p p p g x p g i r m a l r a l o s a l t h l i a l e a r s t a e o f O S F e i t h e li a l m o d e r a t e l a d v a n c e d s t a e o f O S F n n o o m u c e i e l y g p y g p i l s u e s P x 4 0 0 e i t h e l i a l 6 s s I l e s S P X 4 0 0 t i S S e s S P × 4 0 0 t i s S p 口 2 0 0 9 2 2 9 2 S t o m a t o l o V 0 1 . 2 9 N o . 2 F e b . 2 0 0 9 腔 医 学 年 月 第 卷 第 期 g y , , , 6 3 ? r v F 图 4 S u i v i n 在 OS 晚期 上 皮 ? P 5 S u r v i v i n OS F 组 织 呈 图 在 癌 变 中 p X 4 10 组 织 的 表 达 s P 法 中 4 强 达 S P 法 × 0 0 阳 性 表 - F i P u r v i v i n x r e s s i i n s t a 4 S e o n a d V a n O e d e g p g F i 5 T h e o s i t i v e e r e s s i o n o f S u r v i v i n p g x p ~ o f O S i t h l i a l t i s s u e s S P × 4 0 0 F e e p i n O S C C t i s s u e s S P X 4 0 0 ~ r v i n Q 旺 Q 鲤 2 . 1 . 2 组 口 腔 上 S u i v 的 达 阳性 各 黏膜 皮 表 率 P N l E l M l A l T l N 2 髓 ? A 2 T 2 ? 10 口 S u r v i v i n 例 正 常 腔 黏 膜 组 织 上 皮 细胞 中 表 - - - - - 一 P . _ - 一 一 s m ~ _ 0 4 0 OS F 2 0 达 均 为 阴性 , 阳 性 率 为 。 例 组 织 中 , 例 有 -_ - - - - - h . c 血 1 5 0 . 0 % O S F 早 阳 性 阳性 表达 , 阳性 率 为 ;其 中 期 率 为 N 口 E O S F M OS F :正 常 腔 黏 膜 上 皮 组 织 ; : 早 期 上 皮 组 织 ; : 中 3 0 . O 3 /10 OS F 4 6 . 7 % 7 /15 OS F % , 中期 阳 性 率 为 , A OS F T OS F 期 上 皮 组 织 ; : 晚 期 上 皮 组 织 ; : 癌 变 组 织 4 2 6 6 . 7 % 10 /15 。 O S F 组 织 晚期 阳 性 率 为 例 癌 变 N N o r m a l o r a l m u c o s a l e i t h e l i a l E OS F e i e h e l i a l t i s s u e s i n e a r l : ; : p p y 9 7 . 6 OS F 4 l 现 阳 达 阳 性 达 % 。 中 ,有 例 出 性 表 , 率 高 s t a e M OS F e it h e l i a l t i s s u e s i n m o d e r a t e l a d v a n c e d s t e A ; : ; : g p y a g 。 ? S u r v i v i n 1 5 组 织 中 表达 显 著高于 正 常 腔 黏膜 . P OS F i h e l i a l t i s s u e s i n a d v a n c e d s t a e T O S CC t i s s u e s e t : : p g ? 8 . 3 3 P 0 . 0 1 OS F OS F , ;而 癌 变 组 织 则 比 组 织 中 W e s t e r n B l o t S u r v i v i n 正 P 图 6 分 析 在 常 口 腔 P 2 ? 2 O S F S u r v i v i n 4 . 3 9 P 0 . 0 1 显 差 粘 膜 、 及 其 癌 变 组 织 中的表 达 结 果 表达 高 , , 有 著性 X F i 6 W e s t e r n B l o t a n a l s i s o f e r e s s i o n o f ? g y x p S u r v i v i n OS F 、 、 3 组 之 间差 异 ; 的表 达 在 早 中 晚期 P u r v i v i n i n n o r m a l o r a l m u c o s a l S ~ P 0 . 0 5 1 异无 显 著性 表 。 l i u m F a n d t i s s u e s e i t h e . O S 0 ls C C p I 正 口 OS F 及 表 常 腔 黏 膜 、 其癌 变 ? r v 组 织 S u i v i n 表 达 况 中 情 P 3 讨 论 x r s i f u r v i v i n in r m a l T a b 1 E e s o n o S n o p ~ S u r v i v i n l A P 人 类 蛋 白是 家族 的最 小 成 员 , 编 码 o r a l m u c o s a l e i t h e l i u m O S F a n d O S C C t i S S U e s , p 1 k 14 2 基 组 的 、 子 量 6 . 3 u 的 白 。 由 个 氨 酸 成 分 蛋 质 u r v i v i n S 表 达 于 人 类 常见 恶 性 肿 瘤 , 如 肝 癌 、 食 道 癌 、 、 、 血 、 肠 恶 性 肺 癌 、 胃癌 乳 腺 癌 白 病 结 癌 等 , 并 与 其 E3 J 一 ? S u r 的 理 征 显 相 关 。 目前 第 代 演 进 临床病 特 著 ? ? v i v i n S u r v i v i n L Y 2 1 8 1 3 0 8 阻 断 剂 反 义 寡 核 苷 酸 n I S I S 2 3 7 2 2 L i l l a n d C o . I n d i a n a o l i s I N a d I S I S ; , , y p 一 r m l a r P h a a c e u t i c a s , C l s b a d , C A , U S 正 进 行 第 期 临 _6 j S u r v i v i n 床实 验 。 可 见 , 有 望 成 为 肿 瘤早 期 诊 断 的 2 . 2 W e s t e r n B l o t 检 测 结 果 重 要 标 志 物 和 治疗 的分 子 靶 。 ? ? . r n B l o t S u r S u r v i v i n 口 o r a l s u a m o u s c e l l c a r c i n o W e s t e 结 果 表 明 , 正 常 组 织 中 无 与 腔 鳞 癌 q P ? F S u r v i v i n m a O S C C 血 巴 v i v i n 的表 达 , OS 组 织 早 、 中 、 晚 三 期 表 , 的恶性 演进 、 管 生 成 、 淋 结 转 移 、 预 后 P ? ? 口 r a l l k l a k i L K O S F S u r 腔 斑 o e u o a O 达 呈 逐 渐 增 强 的 趋 势 , 在 癌 变 组 织 中 等密 切 相 关 , 是 白 , 等 P p 17 J u r v i v i n v i v i n 基 变 癌 变 过 程 中 的 早 期 事 件 。 S 功 能 蛋 白表 达 最 强 。 这 与 免 疫 组 化 检 测 的 结 果 癌前病 一 S u r v i v i n T h r 3 4 本 致 图 6 。 体现 的重 要 形 式 是 位 的磷 酸 化 , 其 唯