【doc】腰椎退变黄韧带中炎性细胞因子的表达

【doc】腰椎退变黄韧带中炎性细胞因子的达 腰椎退变黄韧带中炎性细胞因子的表达 中国脊柱脊髓杂志2011年第21卷第1期ChineseJournalofSpineandSpinalCord,2011,Vo1.21,No.163 腰椎退变黄韧带中炎性细胞因子的表达 李强,赵建民,张元智,刘聪 (1内蒙卉医学院第一附属医院骨科;2内蒙古医学院外科学系010050内蒙古呼和浩特市) 【摘要】目的:观察腰椎退变黄韧带中炎性细胞因子的表达情况,探讨其在腰椎黄韧带退变过程中的作用.方 法:收集腰椎退变性疾病患者在后路椎板切除减压治疗时取下的黄韧带标本40例(退变组),术前通过CT, MRI证实均有黄韧带肥厚;以10例脊柱外伤行后路手术治疗的青年患者的腰椎黄韧带作为对照(对照组).将 术中切除的黄韧带剔除骨,脂肪及筋膜等组织,修成约2emx1.5emxO.3cm,在10%福尔马林溶液中固定24-48h 后取出.制备成石蜡切片,采用苏木精伊红(HE)染色,应用光学显微镜观察病理学改变,并用免疫组化技术观 察黄韧带标本中自介素一1(IL一1),IL一6和肿瘤坏死因子一o(TNF—u)的表达情况.结果:对照组黄韧带弹力纤维 呈波浪状,排列,弹力纤维间可见少量的胶原纤维和散在的成纤维细胞(22.56+6.05个/HP);退变组黄韧带 弹力纤维明显减少,胶原纤维增多,并且伴软骨细胞,成纤维细胞,毛细血管的增生,成纤维细胞计数为62.66-+ 18.40个/HP,两组成纤维细胞计数差异有统计学意义(P<O.05).退变黄韧带组织中IL—l,IL一6,TNF一表达阳 性率分别为75%,77.5%,82.5%,对照组黄韧带组织中的表达阳性率分别为40%,20%,40%,退变组明显高于对 照组(P<O.05).结论:IL一1,IL一6,TNF—Q在腰椎退变黄韧带中有较高的表达, 这些炎性因子可能参与了腰椎黄 韧带退变的过程. 【关键词】黄韧带;炎性细胞因子;表达 doi:10.3969/j.issn.1004—406X.2011.01.16 中图分类号:R681.5,R363文献标识码:A文章编号:1004—406X(2011)一01—0063 —04 Theexpressionofinflammatorycytokinesinligamentumflavumofthedegenerativelumbarandits clinicalsignifieance/LlQiang,ZHAOJianming,ZHANGYuanzhi,etal//ChineseJournalofSpineand SpinalCord,2011,21(1):63~66 【Abstract】 Objective:Toinvestigatetheexpressionandeffectofinflammatorycytokineinligamentumflavum andthemechanismindegeneration.Method:40ligamentumflavumspecimenswereharvestedfrom40patients (degenerativegroup).AllcasespresentedwithligamentumflavumhypertrophyonCTandMRIimagingand allunderwentdecompressivelaminectomy.Specimensfrom10caseswithspinetraumaandunderwentsurgery wereregardedasnormalcontrols(normalgroup).Theligamentumflavumwerefreeofbone,fatandsofttissue andallweretrimedinto2x1.5xO.3cmsmallpieces.Thesampleswereimmediatelyfixedin10%bufferedfor— malinfor24-48hoursandembeddedinparaffin.Hematoxylineosin(HE)stainingwereusedtoobservepatho— logicalchanges,andtumornecrotizingfactor—d(TNFc~),interleukin一1(IL一 1),andinterleukin一6(IL一6)were testedbyimmunohistochemistry.Result:Theelasticfibersintheligamentumflavumofthen ormalgrouppre? sentedwave— shapeandgoodarrangement,whileitwasnotthecaseinthedegenerativegroup.Theelastic fibersdecreasedobviously,collagenfibersincreased,andchondrocyte,desmoeyteandcapillaryproliferationwere noted.Theamountofcollagenfibersandfibrocyteshowedsignificantdifferencebetweennormalanddegenera, tivegroup(22.56_+6.05cells/HPvs62.66__.18.40cells/HP1(P<0.05).TheexpressionrateofTNF—d,IL一1and IL一6weresignificantlyhigherinthedegenerativegroupthaninthenormalgroup.IL一 1.IL一6andTNF—n werenotexpressedorlowlyexpressedinthenormalgroup,buthighlyexpressiveinthecytoplasmornucleus ofdegenerativeligamentumflavum,whichshowedsignificantdifference(P<0.05).Conlusion:Thedegenerative ligamentumflavumhavehigherexpressionofIL一1,IL一6andTNF—ct. whichmaybeassociatedwiththede— generationofligamentumflavum. 基金项目:内蒙古自治区自然科学基金资助项目(编号:200408020928) 第一作者简介:男(1981一),在读硕士研究生,研究方向:脊柱外科 电话:(0471)6637637E-mail:meledoy@126.con通讯作者:赵建民E— mail:nmzjmin@163.CODI 64中围脊柱脊髓杂志2011年第21卷第1期 ChineseJourncdoJSpineandSpinalCord.2011.Vof.21.No.1 【Keywords】Ligamentumflavum;Inflammatorycytokine:Expression 【AuthorSaddress]Orthopaedics,AffiliatedHospital,InnerMongoliaMedicalCollege,Hohhot,010050.China 黄韧带是脊柱后部的重要连接结构.主要由 弹力纤维构成.作为脊柱运动节段的成分之一.具 有维持脊柱稳定的作用.由于黄韧带退变导致其 弹性下降,当脊柱后伸时黄韧带可出现皱褶或折 叠而突入椎管,使椎管容积减少,尤其伴有椎问盘 突出或关节突增生肥大时,可导致脊髓,神经根受 压,出现神经症状,严重者可致瘫痪,病残.但黄韧 带退变的机制至今仍不十分明了.有研究认为肿 瘤坏死因子一or.(TNF—OL),白介素一1(IL一1),白介 素一6(IL一6)与椎间盘退变有关I.但是关于IL一 1,IL一6,TNF—等炎性细胞因子在退变的黄韧带 中表达的相关研究国内外文献报道很少.为此我 们对黄韧带退变标本与无退变标本进行病理学观 察及免疫组化分析,对IL一1,IL一6,TNF一在黄韧 带退变过程中的作用进行初步探讨. 1资料与方法 1.1标本来源 退变黄韧带取自40例后路椎板切除减压治 疗的腰椎管狭窄症或腰椎间盘突出症患者(退变 组),其中男22例,女18例,年龄4O,74岁,平均 57.2岁:术前C~MRI影像学资料证实均有黄韧 带肥厚,无明显钙化及骨化,在CT/MRI横断面椎 间隙平面测量黄韧带最大厚度超过5mm.无退变 黄韧取自10例腰椎骨折的患者(对照组),其中男 6例.女4例,年龄19,30岁,平均23.9岁;术前 CT/MRI影像学资料证实无黄韧带增厚,钙化及骨 化的征象,CWMRI椎间隙平面测量黄韧带最大厚 度不超过4mm. 1.2主要试剂 IL一10【抗体,IL一6抗体,TNF—Or.抗体购白武 汉博士德公司;二抗试剂盒,增敏二氨基联苯胺 (3.3'diaminobenzidine,DAB)显色试剂盒购自北 京康为世纪生物科技有限公司. 1.3检测方法 将后路手术中切除的黄韧带剔除骨,脂肪及 筋膜等组织,修成约2cmx1.5cmxO.3cm,立刻放入 10%福尔马林溶液中固定24,48h,取出后制备成 石蜡切片.按HE染色步骤及免疫组化染色(S-P 法)染色.分别在低倍镜(xl00)和高倍镜(× 400)下观察两组HE切片,每张切片随机取5个 高倍视野(x400),计数成纤维细胞的总数.在免 疫组化染色切片中观察IL一1,IL一6及TNF一的 表达情况,每张切片随机观察10个高倍视野(× 400),细胞胞浆或胞核中出现浅棕黄色,棕黄色或 褐色染色为阳性.染色结果结合阳性细胞百分率 和着色强度进行半定量分析,阳性细胞百分率0, 25%,0分;>25%,50%,1分;>50%,75%,2分;> 75%,100%,3分.无着色,0分;浅棕黄色,1分;棕 黄色,2分:棕褐色,3分.将两项评分相加,共分成 4个等级,0分为(一),l,2分(+),3,4分(++),5-6 分(+++). 1.4统计学分析 成纤维细胞计数以均数?差表示,退变 组与对照组组间差异应用两样本均数比较的t检 验:免疫组化染色观察所得数据以阳性率表示,组 间比较应用!检验.应用SPSS13.0软件,P< 0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1HE染色结果 对照组黄韧带在光镜下呈现典型的弹力致密 结缔组织结构特点,主要由弹力纤维组成,弹力纤 维呈波浪状,排列规则,与韧带纵轴一致,弹力纤 维间可见少量的胶原纤维和散在的成纤维细胞 (图1).退变组黄韧带在光镜下呈现弹力纤维明 显减少,断裂且分布不规则,胶原纤维增多,并且 伴软骨细胞,成纤维细胞,毛细血管的增生(图2, 3)退变组和对照组的成纤维细胞计数分别为 62.66+18.40个/HP和22.56+6.05个/HP,两组比 较有显着性差异(P<O.05). 2.2免疫组化结果 退变黄韧带组织中IL一1,IL一6,TNF—O/.在软 骨细胞及成纤维细胞胞浆或胞核中均有较高表 达.对照组表达明显低于退变组(图4,9),两组阳 性表达情况见表1.各指标表达阳性率两组比较 差异均有统计学意义(P<0.05). 3讨论 3.1IL—l,IL一6,TNF一的生物学作用 IL一1,IL一6,TNF一仅被称为前炎性细胞因子, 通过刺激炎症细胞的聚集,激活和炎症介质的释 中罔脊柱脊髓杂志2011年第21卷第1期 ChineseJanrndo,'SpineandSpinCord,2011.Vol-21一No?165 oo 一'.:l..? 图1对照组黄韧带弹力纤维呈波浪状.排列规则,与韧带纵轴一致,弹力纤维问可见 少量的成纤维细胞(HE染色xl00) 图2退变黄韧弹力纤维明硅减少,断裂且分布不规则,胶原纤维则增多,伴成纤维细 胞增生(HE染色MOO)图3退 变黄韧中可见毛细血管增生(HE染色xl00)图4,5,6退变组黄韧带组织IL一1,IL 一6,TNF—d免疫组化染色可见胞浆 或胞核呈棕黄色或棕褐色的阳性细胞,数量较多.阳性细胞为软骨细胞和成纤维细胞(xlO0)图7对照组黄韧带IL一1 免疫组化染色可见散在浅棕褐色阳性细胞,阳性细胞数量明显少于退变组(xl00)图8IL一6免疫组化染色未见明显 染色阳性细胞(xlO0)图9TNF—Q免疫组化染色可见散在浅棕褐色阳性细胞,阳性细胞数量明显少于退变组(×l00) 表1对照组与退变组黄韧组织中IL一1,IL一6,TNF—表达情况比较 注:?与对照比较P<005 放,启动和促进炎症反应过程. IL一1是纤维化的重要因子,它能刺激成纤维 细胞的增殖及胶原合成,在肉芽组织及病理性瘢 痕组织中均有较强表达.IL一1还可能促进成纤维 细胞分泌血小板源性生长因子(PDGF),后者再刺 激IL一1增殖.PDGF通过对成纤维细胞的促分裂 增殖,趋化及刺激纤维粘连蛋白合成等作用参与 创伤修复,并且通过刺激成纤维细胞胶原合成及 胶原酶活化,对胶原合成,分解也有调节作用[4l, 调节细胞外基质的更新.IL一1还能引起成纤维细 胞I型和?型前胶原蛋白mRNA表达.并且通过 促进或抑制胶原酶的活力来影响细胞外间质成分 堆积.它通过上调细胞间粘附因子一1表达.诱导 炎性细胞粘附,迁移,通过诱导间充质细胞释放基 质金属蛋白酶(MMPs)调节细胞外基质(ECM)降 解.经IL—l处理后的成纤维细胞可产生大量的前 66中国脊柱脊髓杂志2011年第21卷第l期ChieJoHr,Ial()iP",utaCord,2011,Voz.21,No.1 列腺素E2(PGE2),而PGE2的释放可增强胶原的 活力.TNF—ot也是一种致纤维化因子,可刺激成 纤维细胞增殖及血管增生.在IL一1及TNF一的 共同作用下,导致成纤维细胞增生,胶原纤维合成 增加,最终导致黄韧带肥厚.此外TNF—ot作为一 种重要的炎性介质,可增强中性粒细胞和嗜酸性 粒细胞功能,刺激它们产生超氧化物,释放溶酶体 酶,对其周围细胞产生毒性作用i21.在这些炎性介 质的共同作用下,导致黄韧带周围血管内皮细胞 受损,血管通透性增高,渗出增加,组织水肿这些 不仅使原本狭小的椎管空间更加拥挤,还导致局 部的血循环障碍. 此外,IL一1与TNF—能够诱导组织细胞产 生PGE2,前列腺素是重要的炎症调节因子.可引 起组织的炎症损害,并且是重要的致痛冈素.其 机理可能是降低伤害感受器的闽值并刺激C2类 神经纤维f6I,还可以提高其他致痛物质的敏感性, 从而加强致痛作用,进而产生神经性疼痛 IL一6在退行性骨关节病和关节疾病中的病 理作用研究较多,它已被认为是引起关节破坏和 炎症的重要介质I.1L一6的致炎作用主要在于增 加IL一1和TNF一仅的效应,IL一6作为炎症介质被 认为是TNF一仅的某些生物效应的放大因子1. 3.2黄韧带退变的机制 由于黄韧带的退变是一个随着年龄增长而缓 慢发生的病理过程,所以到目前为止,尽管国内外 专家对黄韧带的生物力学,细胞学,遗传学等进行 了大量的研究,其退变的确切机制仍不清楚.动物 模型及细胞培养已经成功复制了退变的黄韧带, 但其与正常人体缓慢退变的黄韧带相比,在生物 学行为上是否具有相似性,目前还不能做出准确 判断.有研究发现,黄韧带肥厚程度与纤维化程 度,弹性纤维减少程度均呈正相关.戴力扬等I1 对手术后的黄韧带标本进行组织学研究,显示弹 性纤维含量下降以及胶原纤维数量增加,正是黄 韧带肥厚的原因.本研究结果显示,IL一1,IL一6, TNF一仅等炎性因子在腰椎退变黄韧带的表达水 平均较高.与文献报道的结果一致.由此推断:黄 韧带变性,增殖,肥厚可能与无菌性炎性因子的作 用有关TNF一0/.在黄韧带组织纤维化中有可能是 直接促进成纤维细胞的增殖及合成胶原蛋白和蛋 白多糖,从而导致胶原纤维的合成及沉着,加速或 维持慢性炎症过程导致韧带纤维化:IL一6在黄韧 带组织纤维化中可以促进成纤维细胞的增生,分 泌及合成胶原蛋白,层粘连蛋白和蛋白多糖,促进 I,?型胶原mRNA的表达,减少胶原蛋白的降 解,致使胶原蛋白沉积l",. 本结果显示,退变黄韧带组织中IL一1,IL一6, TNF一表达明显高于对照组黄韧带组织.我们推 测IL一1,IL一6,TNF一仅等炎性细胞因子参与调控 的慢性炎症可能与黄韧带退变有关. 4参考文献 1.李新友,乇民.刘淼,等.白细胞介素一6在突H{的腰椎问盘中的 表达及其意义lJl中闫矫形外科杂志,2001,8(6):581—582. 2.尚琦松.黄擘,盛文辉.等炎性网子TNF—d及IL一18与椎间盘 退堂的柑关性研究lJ1.中『矫形外科杂志,2009,l7(5):385— 387. 3.赵序利,f锡欣.椎问盘退变的病因研究…中围矫形外科杂志, 2002,9(3):273—274. 4.YeoSW.KimS,,.SuhBD.etalEflectsofplatelet—derived grmqhfa{?t(n'一A)nthehealingplo(~essottympanicIYlelTI— braheperforation[J].AmJOtolarytgol,2000,21(3):153—160. 5.张益民,姜鑫,郭永智,等.腰椎间稚退变与炎症介质fJ1.实用骨 科杂志,2008,14(9):534—535 6.俞海明,李毅中.炎症在腰椎问盘退变,突,吸收发病机制中 的作用….同际骨科学杂志,2006,27(4):248—250. 7.KangJD.GeorgescuH1,Mcintyre一1_arkinL.eta1.Herniated cervitalinler~mlebraldiscsspontaneous1. ' ,producematrix n1efall.pr()ceinase,nihi(oxide,inter'leukin一6,andprostaglandin E2[J].Spille,1995.20(Suppl22):2373—2378. 8.高微,鲁静,赵丽娟.炎性细胞因子与类风湿火节炎lJI.中国现代 医学杂志.2007,】7(4):450—457. 9.SairyoK,BiyaniA,GoelVK,eta1.Lumbarligamenlumflavum lLvpertrophyis{luetoaecmnulationofinflammationrelated seartissue[J]Spine,2007.32(11):E340—347 l0.戴力扬,杜晓冰.黄韧带退行性变的组织学观察及其与腰椎椎 管狭窄症的关系….中华骨科杂志l995,15(4):l95一l97. 1lWatkinsLR.MaierSF,GoehlerLE.Immuneaetivation:the roleoftIJ—inflammato~'eytokinesinintlammation,illness responsesandpathologi{alpainstatesIj1.Pain,1995,63(3): 289—302. 12.XingZ,GauldleJ,CoxG,eta1.IL一6isallanti-inflammatoo' eytokinerequiredf0rcontrollinglocalorsystemicacute inflammatoryresponses[JJ.JClinInvest,1998,101(2):311— 320. (收稿日期:2010—07—14修同日期:2010—10—18) (英文编审蒋欣/刘思麒,郭万首) (本文编辑卢庆霞)