不同分化形态的嗜肺军团菌对嗜热四膜虫BF1的感染和胞内增殖特征_cropped

不同分化形态的嗜肺军团菌对嗜热四膜虫BF1的感染和胞内增殖特征_cropped ( ) 应用与环境生物学报 2006 , 12 4 : 518 ,522 C h in J A pp l E n viron B io l = ISSN 1006 2687X 2006 208 225 不同分化形态的嗜肺军团菌对嗜热四膜虫 B F1的 3 感染和胞内增殖特征 3 3 3 3 1 , 2 3 3 3 33 3 3 黄绍松 白庆笙 陆勇军 徐润林 123() 中山大学生命科学学院 生物化学系 , 有害生物防治和资源利用国家重点实验室 , 生物科学与技术系 广州 510275 摘 要 嗜肺军团菌是一种广泛分布于淡水生态环境中的条件性胞内致病菌 ,其不同的分化形态与菌体的存活 、感染 (力和毒力有密切关系 . 本文对不同分化形态的表达绿色荧光蛋白的嗜肺军团菌在不同感染复数 m u ltip lic ity of infec2 )tion, MO I下感染嗜热四膜虫 B F1株的条件以及胞内增殖的特征进行了研究 . 结果表明 ,胞内的军团菌比大肠杆菌有 更强的抗消化能力 , 30 ?时处于对数生长期的嗜肺军团菌即使在 MO I等于 100 的情况下仍然在 24 h内被四膜虫消 化殆尽 ,而帄板培养至稳定期的菌体即使 MO I只有 50即可实现胞内增殖 ,并在 18 h内使宿主数量急剧下降 . 饲喂军 团菌后 ,四膜虫都有一个数量先上升的过程 ,然后依 MO I的不同呈现稳定或下降的趋势 . 本文还通过荧光显微镜观察 描述了一定 MO I下四膜虫对稳定期菌体的消化和形态变化的动态过程 . 图 7 参 14 关键词 嗜肺军团菌 ; 嗜热四膜虫 ; 细胞分化 ; 胞内增殖 CL C Q938. 8 ? R18 In fec t ion of Te tra h ym en a th e rm oph ila BF1 by D ifferen t ia ted Form s of 3L eg ion e lla pn eum oph ila an d Proper t ie s of In tra ce llu la r Pro l ifera t ion 3 3 3 3 1 , 2 3 3 3 3 3 3 3HUAN G Shao song, BA I Q ingsheng, LU Yongjun& XU R un lin 1 2 ( D epa rtm en t of B iochem istry, S ta te Key L abora tory of B iocon trol, and 3 )D epa rtm en t of B iology & B iotechnology, S un Ya t - sen U n iversity, Guangzhou 510275 , Ch ina A b stra c t L eg ionella pneum oph ila , an acc iden ta l in trace llu la r p a thogen d istribu ting b road ly in fre shwa te r eco system , ha s two rec ip roca l p ha se s of ce llu la r d iffe ren tia tion tha t a re re la ted to su rviva l, infec tion and viru len t of the p a thogen. U sing GFP - tagged L. pneum oph ila a s a mode l, the infec tion cond ition s of B F1 stra in of Tetrahym ena therm oph ila by d iffe ren tia ted fo rm s of () L. pneum oph ila and the p rop e rtie s of in trace llu la r p ro life ra tion in va riou s m u ltip lic ity of infec tion MO Iwe re inve stiga ted. The re su lts demon stra ted tha t the in trace llu la r log p ha se L. pneum oph ila cou ld be d ige sted comp le te ly a t 30 ? in 24 hou rs, even the MO I = 100 , wh ile the sta tiona ry p ha se bac te ria grown in so lid m ed ia cou ld m u ltip ly in the c ilia te s a t the MO I = 50 a t the sam e co2cu ltu ra l temp e ra tu re, and cou ld cau se a rap id dec rea se of ho st pop u la tion w ith in 18 hou rs. A fte r fed w ith bac te ria, the num be r of c ilia te s ha rbo ring bac te ria inc rea sed firstly and then kep t stab le o r d ropp ed in an MO I dep enden t m anne r. The d ige s2 tion p roce ss of engu lfed sta tiona ry p ha se bac te ria and mo rp ho logica l change s of T. therm oph ila a t va riou s MO I we re a lso de2 sc ribed u sing fluo re scen t m ic ro scop y. F ig 7, R ef 14 Keyword s L eg ionella pneum oph ila; Tetrahym ena therm oph ila; ce llu la r d iffe ren tia tion; in trace llu la r p ro life ra tion CL C Q938. 8 ? R18 [ 3 ] () 系 ,因此研究军团菌与原生动物的相互 关系已成为军团菌嗜肺军团菌 L eg ionella pneum oph ila是一种革兰氏阴性的[ 1 ] [ 4 ] 胞内条件性致病菌 ,可引起人类严重的非典型性肺炎 . 该菌 流行病学和生态学的中心内容之一 . () 广泛分布在淡水环境中 ,人工水系统 如空调系统 冷却塔水 嗜肺军团菌的形态在不同的生长期和不同生长条件下有 [ 2 ] 是该菌生长繁殖的重要场所和主要感染 源 . 目前对 该菌在 明显的分化 ,这种分化与其增殖能力 、毒力和感染力有密切的 [ 5 ] 冷却塔水这种贫营养的环境中如何生存和繁殖仍不十分清楚 , 联系 . 军团菌被原生动物或巨噬细胞吞噬后 ,在吞噬体内菌 但越来 越 多 的 证 据 显 示 与 该 生 境 中 的 原 生 动 物 有 密 切 关体变长 ,进入快速分裂繁殖阶段 ,此时军团菌的形态与在液体 培养基中处于对数生长期时类似 ,都是呈长丝状 ,此一阶段称 收稿日期 : 2005 207 204 接受日期 : 2005 209 230 ( ) 为复制态 rep lica tion;而当宿主细胞内营 养耗尽或在培养基 ( ) 3 国家 自 然 科 学 基 金 No. 39900006 资 助 项 目 Suppo rted by the 中达到稳定期后期时 ,菌体变为短杆状 ,产生鞭毛 ,然后裂解宿 ()N a tiona l N a tu ra l Sc ience Foundation of Ch ina No. 39900006 3 3 现工作单位 : 广 东工业 大学 环 境 科 学 与 工 程 学 院 , 广 州 , 510090 主细胞 ,再感染下一个宿主细胞 ,这一阶段的细菌称为传播态P re sen t add re ss: Schoo l of Environm en ta l Sc ience s and Enginee ring, [ 6 ] ( ) tran sm ission. 处于传播态的细菌对各种环境因子不敏感 ,Guangdong U n ive rsity of Techno logy, Guangzhou 510090 , Ch ina [ 6 ] 感染能力强 ,毒力大 ;而处于复制态的细菌则正好相反 . ( 3 3 3 通讯作者 Co rre spond ing au tho rs E2m a il: L uyj@m a il. sysu. edu. )cn; L ssxrl@ zsu. edu. cn 阿米巴和纤毛虫是冷却塔水池中营自由生活原生动物的 5 5 - 1( 主要类群 . 在军团菌与宿主相互关系的研究中 ,大多以阿米巴 积的原生动物计数板上计数 n 约为 2 ×10,2. 5 ×10mL 5 - 1) 如棘肉足虫作为材料 . 但在自然界中 ,纤毛虫类也可能是军团 养原液 ,按计数浓度用 PB SS稀释虫液至 10mL 作为实验 [ 7 ] 使用浓度 . 菌的重要宿主 . 纤毛虫主要以细菌为食 ,目前已在多达 14种 [ 2, 8 ] ( ) 原生动物 中 发 现 了 军 团 菌 的 存 在 , 其 中 有 2 种 纤 毛 虫 . 1 固体 嗜肺军团菌对嗜热四膜虫的感染和计数 1. 2. 3 ( Rowbo tham 首次证实了嗜肺军团菌可以 在棘肉足 虫 属 A can2 培养基上培养及收集 : 划线接种表达 GFP的菌株于含氯霉素 [ 9 ] μ)( ) 15 g /mL 的 BCYEa培养基上 ,置 5 % CO 培养箱 37 ?培养 48 tham oeba和纳 氏 虫 属 N aeg leria 中 增 殖 和 裂 解 细 胞 , 而 2 ( )(F ie ld s等 1984首次描述了嗜肺军团菌在无菌自来水中感染 h后用蒸馏水将菌落冲洗下来并稀释至 D= 0. 10 相当 600 nm [ 10 ] 8 - 1 ( ) 梨形四膜虫 Tetrahym ena py riform is的研究结果 . 后续的研 ) ( ) 于 10mL ,并在 4 h以内使用 . 2 液体培养基中培养及 [ 7, 11, 12 ] 究证明了嗜肺军团菌可以在不同的四膜虫 中增殖 . 但 收集 :将在固体培养基上培养 48 h的新鲜菌种接种 A YE培养 与阿米巴相比 ,纤毛虫类与 军团菌病的相关性研究却 少见报 24 h,再按 2 %的比例接种于 50 mL A YE 培养基中 ,于 37 ?、- 1道 . 而不同分化形态的嗜肺军团菌对宿主的感染条件 、体内增 160 r m in 振荡培养 ,于适当时间离心收集 ,用无菌水清洗菌 值特征以及宿主的增殖变化情况 ,仍未见报道 . ( ) 体两次后用 PB SS稀释至 D= 0. 10 备用 . 3 感染 : 把稀 600 nm 5 - 1释至 10mL 的虫液按 25 mL /管分装至无菌的 50 mL 离心管 ( )我们将可表达绿色荧光蛋白 GFP的质粒转入嗜肺军团 中 ,置 30 ?培养 1 h,按不同 MO I加入适当体积的菌液混匀 ; 菌中 ,然后用来感染嗜热四膜虫等纤毛虫宿主 ,从而发展了一 把混匀的虫 - 菌液按 1 mL /管分装至 1. 5 mL 无菌 Epp endo rf [ 13 ] 种可以直观地观察军团菌在宿主体内增殖状况的方法 . 本 管中 ,此时记感染时间为 0;在不同时段随机取出 3 支指管 ,摇 文应用这一方法 ,研究了不同分化形态的嗜肺军团菌在各种感μμ匀 ,取出 200 L 用于胞内细菌浓度计数 ,另取 950 L 加入 50 ()染复数 m u ltip lic ity of infec tion, MO I下对嗜热四膜虫 B F1 株 μL 碘液固定保存用于四膜虫浓度计数 ,剩余液体用 1%甲醛 ( ) 固定后用于荧光显微镜观察 . 4 胞内增殖的嗜肺军团菌的 ( )T. therm oph ila B F1 的感染和胞内 增殖的特征 , 以及 B F1 株 μ收集和浓度计算 : 在以上 200 L 菌 - 虫液中加入硫酸庆大霉 的存活情况 . 本文研究结果为了解军团菌在贫营养环境下的种 μ素至 80 g /mL 处 理 1 h 杀 死 四 膜 虫 细 胞 外 的 军 团 菌 , 然 后 群维持和爆发机制提供了有用的数据 . 4 000 g离心 10 m in,小心去除上清 ,加入适量 PB SS缓冲液 ,混 μ匀 ,同前条件离心 ,去上清后加入 200 L PB SS缓冲液 ,充分混 1 材料和方法 μ匀加入 2 L 1 % SD S,混匀后置 37 ?水浴锅中水浴 1 h,置涡 μ旋振荡器上剧烈振荡 5 m in,用 1 m 孔径滤膜过滤除去四膜 1. 1 材 料μ虫残体和囊泡 ,适当稀释至 D= 0. 10 ,取出 10 L 滴加在 600 nm 嗜肺军团菌血清 ?型菌 1. 1. 1 菌 /虫株 、培养基和缓冲液干净的玻片上 ,盖上盖玻片 ,在 400 倍荧光显微镜下随机取 10 ()株 L. pneum opila se rogroup ?, A TCC33152 由广州市疾病预防 个视野计算细菌数量 ,同一样品计数 3 次 , 3 次结果帄均值为 ( )控制中心惠赠 ,并由作者转入可表达绿色荧光蛋白 GFP的质 该样品浓度 ,计算标准差 . α ( α)粒 . 大肠杆菌菌株 DH5Escherich ia coli DH5由本实验室保 存 . 嗜热四膜虫 B F1 株由中国科学院武汉水生生物研 究所杨 军先生馈赠 . 军团菌固体培养基 BCYEa 和液体培养基 A YE 购 自英国 O xo id公司 ;四膜虫 PYG培养基组成为 : 蛋白胨 15 g; 酵母粉 5 2 结 果 g;葡萄糖 1 g加蒸馏水 1 000 mL ,自然 pH 值 , 121 ?, 15 m in 2. 1 表达 GFP的菌株在 A YE培养基中的生长特征灭菌 . 在不同的培养条件下 ,军团菌到达对数期和稳定期的时间 - 1 - 1 缓 冲 液 : 2 mmo l L KC l, 1 mmo l L CaC l , 0. 5PB SS2 和生物量是不同的 . 为了准确确定表达 GFP的重组嗜肺军团 - 1 - 1 KOH 调 节 pH 值 至 mmo l L M gC l , 1 mmo l L Tris. C l, 用菌在 A YE培养基中的生长特征 ,我们测量了该菌在 30 ?时的 2 7. 0, 121 ?, 15 m in灭菌后室温保存 . 生长曲线 ,由图 1 可 以 看 出 , 细 菌 在 14 h 左 右 进 入 对 数 生 长 期 , 30,32 h时达到最高 . 作为参照 ,我们也同时测定了 37 ? 1. 2 方 法 时的生长情况 . 结果显示 , 30 ?时延迟期比 37 ?时长约 4 h, OL YM PU S落 使用 1. 2. 1 表达 GFP的嗜肺军团菌的观察 对数生长中期晚约 10 h,而最终的生物量 30 ?时明显比在 37 射式荧光显微镜蓝光组件观察细菌及感染后原生动物细胞内 ?时为高 . 外的军团菌 . 重组军团菌表达的 GFP在激发光波长为 480 nm 时发射光最强 ,发射出波峰在 507 nm 的绿光 . 接种 1. 2. 2 嗜热四膜虫 B F1株的培养 、收集和浓度计算 储存的种子培养液 1 mL 至 50 mL PYG中 ,于 30 ?光照培养箱 中培养 3 d至饱和 ,按 5%的比例接种于 100 mL 新鲜 PYG培 养基的三角瓶中 , 30 ?光照培养 3 d后 ,于 15 ?、3 500 g 离 心 10 m in,小心倒去上清 ,用残余液体重悬虫体 ,加入室温保存 的无菌 PB SS溶液 50 mL ,于相同离心条件离心收集 ,去上清 , 加入 25 mL PB SS溶液重悬虫体 ;转移悬液至无菌三角瓶中 ,置 μ室温缓冲处理 12 h; 取 950 L 混匀的虫液转入 Epp endo rf管 , μμμμ加入碘液 50L ,取 20L 稀释 50倍后取 100L 于 100L 体 图 1 30 ?和 37 ?时表达 GFP的军团菌菌株的生长曲线 F ig. 1 Grow th cu rves of GFP - exp ressed L. pneum oph ia at 30 ? and 37 ? 应 用 与 环 境 生 物 学 报 C h in J A pp l E n viron B io l 12 卷 520 与未转化的菌株比较 ,重组嗜肺军团菌的生长趋势和生物 () 量都没有明显的变化 结果未列出 ,说明外源质粒的导入及 GFP的表达对该菌的生长没有明显的影响 . μ嗜肺军团菌在含氯霉素 15 g /mL 的 A YE培养基上生长 时在不同的生长 时期其形态有明显的差别 . 处于对数 生长期 时 ,细菌全部呈长丝状 ;对数生长晚期和稳定期丝状体的长度 减小 ,但大部分仍呈丝状 ,仅有少部分以短杆状的单个菌体存 在 ,并能运动 . 而在 BCYEa固体培养基上于 37 ?培养 48 h后 细菌绝大部分都以短杆状的单个菌体存在 ,并能运动 . 图 3 不同 MO I下对数生长期嗜肺军团菌在四膜虫细胞内浓度变化 2. 2 液体培养基培养的不同生长期的军团菌对 B F1 F ig. 3 Change s in the in trace llu la r concen tra tion 的影响及其在虫体内的增殖特征of log p ha se L. pneum oph ila a t va riou s MO I 我们用不同 MO I的嗜肺军团菌饲喂嗜热四膜虫 ,并用 PB 2 2. 3 饲喂平板培养的嗜肺军团菌对四膜虫存活的影SS缓冲液作为感染媒介 ,使军团菌成为四膜虫的唯一食物来 源 ,然后在显微镜下观察统计四膜虫的数量变动情况 . 响及菌体的胞内增殖特征 在 BCYEa培养基上于 37 ?培养 48 h后嗜肺军团菌菌体 呈短杆状 ,能运动 . 此时细菌形态及生理特点与该菌在感染原 ()生动物细胞后期的成熟菌体形态 传播态 相似 . 如图 6所示 ,在不同 MO I下感染后的 各个时段四膜虫数 量差别较大 ,但在 6 h以内各 MO I的四膜虫浓度都有升高 ,升 高幅度随 MO I增大而提高 . 在随后 12 h内 , MO I = 10、50的四 膜虫浓度继续升高 ,而 MO I = 100 的四膜虫浓度在 6 h 开始下 降 ,在 18 h后 MO I = 50和 100的四膜虫数量快速下降 . 图 2 饲喂对数生长期的军团菌后四膜虫的浓度变化 F ig. 2 Change s in the concen tra tion of B F1 after fed w ith log p ha se L. pneum oph ila L. p: 嗜肺军团菌 L. pneum oph ila. 下同 The sam e be low 对数生长期的军团菌感染四膜虫后 ,不同 MO I时 四膜虫 () 浓度均有 提 高 图 2 . 在 感 染 后 的 各 个 时 段 , 四 膜 虫 浓 度 随 MO I升高而增大 ,四膜虫最高浓度出现时间随 MO I提 高而延 迟 . 在 MO I = 100 时 ,饲喂 E. coli和军团菌的四膜虫增长曲线 在感染 24 h内有明显差别 . 饲喂 E. coli时浓度提高速度随饲 喂时间延长而下降 ,但每个时段都比感染嗜肺军团菌时浓度要 图 4 液体培养至稳定期的嗜肺军团菌感染的四膜虫存活曲线 高 , 18 h后浓度达到最高 . 嗜肺军团菌在感染后 30 h 达到最 F ig. 4 Su rviva l cu rve of B F1 infec ted by sta tiona ry p ha se 高 ,二者最后浓度大小没有明显差别 . 24 h后荧光显微镜下观 L. pneum oph ila unde r liqu id cu ltu re 察各个 MO I感染的四膜虫 细胞内均没有看到发光的 细菌存 在 ,说明处于对数生长期的嗜肺军团菌在 MO I = 100 以内都能 () 被嗜热四膜虫消化掉 图 3. 由图 3 还可以看出 , E. coli在嗜 热四膜虫细胞内下降至 0的时间比嗜肺军团菌提前约 12 h,说 明在相同细菌数量时 ,嗜肺军团菌被四膜虫消化的速度比大肠 杆菌慢 . 稳定期的嗜肺军团菌感染四膜虫后 ,在 MO I = 10、50 时 , () 四膜虫浓度有明显的升高 图 4 ,细胞内的军团菌逐渐被四膜 虫消化掉 ,在 18,24 h 内虫体内已观察不到发光的细菌细胞 () 图 5 ;在 MO I = 100时 ,四膜虫浓度开始升高 ,在 18 h升至最 5 - 1 高的 1. 15 ×10mL ,然后开始下降 ,并在 48 h降至 0 ,说明稳 图 5 液体培养至稳定期的嗜肺军团菌 定期的嗜肺军团菌在 MO I = 100 时能在嗜热四膜虫细 胞内增 在四膜虫 B F1 细胞内浓度的变化殖 ,但是最终浓度仅是 最初感染时浓度的 3. 45 倍左右 . 18 h F ig. 5 Change s in in trace llu la r concen tra tion of stationa ry p hase L. pneum oph ila unde r liqu id cu ltu re 后荧光显微镜观察可见四膜虫细胞内细菌发出的荧光随时间 延长而变亮 . 我们用荧光显微镜观察了不同 MO I下四膜虫对稳定期菌 体的消化和形态变化的情况 . 在 MO I = 5 时 ,四膜虫浓度变化不明显 . 感染 12 h后还可 观察到少数虫体内发光的细菌存在 , 18 h观察未能看到发光 的菌体 ,但在此时虫体浓度略有增长 ,以后的变动趋势和幅度 而进入下一个感染周期 . 军团菌浓度在 30 h 后各个 MO I条件 与 MO I = 0相一致 ,说明在此 MO I时嗜肺军团菌未能对四膜虫 下均趋于稳定 . 产生明显的影响 . 图 7 30 ?下 PB SS中不同感染复数时军团菌的增殖 6 30 ?下 PB SS中不同感染复数时四膜虫存活曲线 图 F ig. 7 P ro life ra tion of in trace llu lar L. pneum oph ila a t variou s MO I F ig. 6 Su rviva l cu rve of T. therm oph ila a t va riou s MO I in PB SS buffer a t 30 ? in PB SS buffe r a t 30 ? 3 讨 论 在 MO I = 10 时 ,四膜虫在感染 24 h内虫体浓度有一个明 5 - 1本文以绿色荧光蛋白为标记 ,首次描述了不同分化形态的显的升高过程 ,在 24 h时其浓度达到 1. 26 ×10mL . 感染 6 h嗜肺军团菌感染嗜热四膜虫的特征以及四膜虫对军团菌的消 后荧光显微镜观察仍可见多数虫体内存在发绿光的细菌 ,同 化情况 . 由于实验体系和感染媒介的不同 ,胞内的军团菌在什 期比较饲喂发光大肠杆菌的对照 ,未能看到相同现象但能在普么条件下会得到扩增 ,还未见详细和结果一致的报道 . 本文的 通光照视野内看到消化完毕的食物泡 , 12 h 荧光观察少数虫 结果初步揭示 ,军团菌的胞内增殖能力不仅与 MO I有关 ,也与 体内有发光细菌存在 , 18 h后荧光观察未能看到发光的细菌 . 军团菌的分化状态有关 ,处于不同生长期因而分化形态不同的 24 h后虫体浓度较 快的下降 , 但下降的速度和幅度与 MO I =军团菌被吞噬后其胞内增殖的能力有很大不同 . 在液体培养基 50、100比较相差很远 . 表明在此 MO I时 ,嗜肺军团菌 促进了 四膜虫的增殖 ,但细菌能被四膜虫缓慢消化而未能在虫体内增 中生长时 ,处于对数生长期呈长丝状的细菌即使 MO I = 100 都 殖 . 被嗜热四膜虫缓慢消化掉 ; 在稳定期有少 数短杆状的细菌出 当 MO I = 50 时 ,在感染 6 h时 ,虫体浓度升高幅度较 MO I现 ,此时同样的 MO I,嗜肺军团菌就能在虫体内增殖并最终使 3 - 1 = 10时高约 4 ×10mL ,此段时间内嗜肺军团菌对四膜虫分 寄主死亡 . 在固体培养基上生长至稳定期的细菌绝大多数都呈 裂的影响较 MO I = 10 更加明显 . 但随后浓度变化速度较后者 短杆状 ,此时 MO I = 50 就能实现寄生繁殖 . 上述结果表明 ,传 慢 ,且在 18 h其最高浓度时较 MO I = 10小 . 6 h荧光观察可见 播态的嗜肺军团菌感染嗜热四膜虫的能力较复制态时强 . 此结 细菌大部分分散在虫体后端 ,此时观察饲喂发光大肠杆菌的对 照可见细菌形成食物泡且在蓝光照射时为淡黄色 ,表明这些细 果也表明 ,液体培养和帄板培养达到稳定期的嗜肺军团菌由于 菌内的发光蛋白结构已经受到破坏 ; 12 h 观察可见部分虫体 传播态菌体数量的不同 ,两者在四膜虫胞内的增殖能力还是有 内由细菌构成的各个发光的小泡逐渐聚集 ,同期比较观察饲喂 较大差异 . 发光大肠杆菌的样本时在蓝光观察不能看到发光的现象 ,但在 如图 4所示 , MO I = 100 时 ,四膜虫吞 噬了液体培养至稳光镜下可见食物泡 ; 18 h观察可见嗜肺军团菌聚集成团或呈 5 - 1 定期军团菌后 ,其细胞数量首先有一个增长 ,然后才下降 ,这与 C形 ,发出很亮的荧光 ,虫体浓度升高至 1. 16 ×10mL ,然后 图 6的现象相似 . 但与图 6 不同的是 ,即使在 MO I = 10 和 50 转入快速下降阶段 , 30 h后下降速度变得很缓慢 ,此时荧光观 察可见溶液中有大量能运动的短杆状嗜肺军团菌存在 ,存活的 时 ,也出现四膜 虫 先 上 升 后 下 降 的 趋 势 , 且 随 着 MO I数 的 降 四膜虫数量很少 ,仅约剩感染开始的 1 /10. 低 ,上升的时间就越长 ,提示四膜虫可以消化一部分的细菌进 在 MO I = 100时 ,感染 6 h内四膜虫数量有明显升高 ,随后 行增殖 . 但随着吞噬数量的增加 ,部分稳定期的军团菌即使数 进入下降阶段 ,在 6,18 h下降速度较缓慢 , 18 h后快速下降 , 量很少 ,也可以抵抗宿主的消化 . 胞内军团菌一旦达到一定的 30 h后下降速度变得很缓慢 . 感染 12 h 观察可见溶液中有能数量并适应了胞内环境后 ,即开始分裂扩增 ,导致四膜虫的数 运动的嗜肺军团菌存在 ,随后的观察结果与 MO I = 50相似 . 量的下降 . MO I越高 ,下降速度越快 . 在 30 ?, MO I = 50 和 100 时 ,嗜肺军团菌进入四 膜虫细 在冷却水 塔 和 其 它 人 工 水 池 中 往 往 同 时 存 在 多 种 军 团[ 14 ] () 胞约 6 h后进入分裂增殖阶段 图 7 . MO I = 50时最终细菌浓 (菌 ,而自由 生 活 原 生 动 物 的 种 类 也 不 少 白 庆 笙 等 , 待 发 7 - 1 度为 3. 25 ×10mL ,与液体培养稳定期细菌 MO I = 100 时最 ) 表 ,这些原生动物都有可能成 为军团菌的宿主 . 不同种类的 7 - 1终浓度 3. 45 ×10mL 相近 . MO I = 100 时 细 菌 最 终 浓 度 为 军团菌对宿主的感染和胞内复制能力不同 ,感染的宿主范围也 7 - 14. 13 ×10mL . 在 12,24 h细菌增殖最快 . MO I = 50、100时 不同 . 如在军团菌感染梨形四膜虫的实验中发现嗜肺军团菌能 在四膜虫浓度升高阶段 ,溶液中基本看不到能运动的嗜肺军团 感染四 膜 虫 , 但 同 是 致 病 菌 的 L. m icdadei 和 L. an isa 却 不 [ 12 ] 菌 ,但四膜虫浓度快速下降时可见溶液中的细菌浓度随之快速 能 . 这与自然界中的情况是否一致 ,尚待更多试验证据的支 升高 ,说明在四膜虫细胞中 ,嗜肺军团菌通过使寄主死亡破裂 持 . 感染能力和范围决定了军团菌种群的维持和优势的形成 . 在我们的实验中 ,固体培养基上达到稳定期的嗜肺军团菌只要 MO I = 50就能实现胞内繁殖 ,这也许从一个方面说明了嗜肺军 应 用 与 环 境 生 物 学 报 C h in J A pp l E n viron B io l 12 卷 522 8 H a rb O S, Gao L Y, A bu Kwa ik Y. F rom p ro tozoa to m amm a lian ce lls: a 团菌会成为水环境中的优势菌和主要感染菌的原因 . new p arad igm in the life cyc le of in trace llu lar bac te rial p a thogen s. Envi2 军团菌对纤毛虫的感染和胞内增殖的能力不仅与 MO I和 [ 10 ][ 15 ]( ) ron M icrobiol, 2000 , 2 3 : 251 ,265 分化形态有关 ,其它环境条件例如营养 和温度 等也是重 9 Rowbo tham TJ. P relim ina ry repo rt on the p a thogen ic ity of L eg ionella 要的影响因素 . 本文也应用重组军团菌 ———四膜虫这一研究细 pneum oph illa fo r fre shwa te r and so il amoeba. J C lin Pa thol, 1980 , 33: 菌 - 寄主相互关系的良好模型 ,进行各种环境因素对军团菌感 1179 ,1183 染纤毛虫和胞内增殖的影响的研究 . 10 F ie ld s B S, Sho tts EB , Fee ley JC, Go rm an GW , M a rtin W T. P ro lifera2 tion of L eg ionella pneum oph illa as an in trace llu la r p a ra site of the c ilia2 致 谢 感谢郑晓聪同学在文字编辑和绘图方面的帮助 . ted p ro tozoan Tetrahym ena py riform is. A ppl Environ M icrobiol, 1984 , ( ) 47 3 : 467 ,471 Referen ce s 2 N ahap e tian K, Cha llem e l O , B eu rtin D , D ub rou S, Gounon P, Squ in11 F ie ld s B S, B en son R F, B e sse r R E. L egione lla and L egionna ire s’d is21 azi F. The in trace llu la r m u ltip lica tion of L eg ionella pneum oph ila in p ro2 ea se: 25 yea rs of inve stiga tion. C lin M icrobiol R ev, 2002 , 15: 506 ,( ) tozoa from ho sp ita l p lum b ing system s. R es M icrobiol, 1991 , 142 6 : 526 677 ,85 Swan son M S, H amm e r B K. L eg ionella pneum oph ila p a thogenesis: a 2 Stee le TW , M cL ennan AM. Infec tion of Tetrahym ena py riform is by L e2 12 fa tefu l jou rney from amoebae to m ac rop hage s. A nnu R ev M icrobiol, g ionella longbeachae and o the r L egione lla sp ec ie s found in po tting m i2 2000 , 54: 567 ,613 ( ) xe s. A ppl Environ M icrobiol, 1996 , 62 3 : 1081 ,10833 Stou t JE, Yu VL , B est M G. Eco logy of L eg ionella pneum oph ila w ith in () () () 13 H uang SS 黄绍松 , Xu RL 徐润林 , L u YJ 陆勇军 . U se of ( ) wa ter d istribu tion system s. A ppl Environ M icrobiol, 1985 , 49 1 : 221 green fluo re scen t p ro te in to study the re la tion sh ip be tween L eg ionella ,228 (pneum oph ila and its p ro tozoam ho st. Ch in M icrobiol B u ll 微生物学学 Ste ine rt M , H en tsche l U , H acke r J. L eg inonella pneum oph ila: an a2 4 ) ( ) 报 , 2006 , 33 2 : 22 ,25 qua tic m ic robe goe s a stray. FEM S M icrobiol, 2002 , 26: 149 ,162() () () 14 Sh i HQ 施海琼 , H uang JW 黄炯威 , W u XF 吴夏飞 , L in 5 B achm an MA , Swan son M S. RpoS coop e ra tes w ith o the r fac to rs to in2 () () () (YH 林尤海 , Xu RL 徐润林 , Zhou SN 周世宁 , L u YJ 陆 duce L eg ionella pneum oph ila viru lence in the sta tiona ry p ha se. M ol M i2 ) 勇军 . O ccu rrence and d istribu tion of L eg ionella in m an2m ade wa te r ( ) crobiol, 2001 , 40 5 : 1201 ,1214 (system s of Guangzhou. C h in J A ppl Environ B iol 应用与环境生物学 Mo lofsky AB , Swan son M S. D iffe ren tia te to th rive: le sson s from the L e2 6 ) ( ) 报 , 2003 , 9 6 : 635 ,638 ( ) g ionella pneum oph ila life cyc le. M ol M icrobiol, 2004 , 53 1 : 29 ,4015 Kikuha ra H , O gawa M , M iyamo to H , N ikaido Y, Yo sh ida S. In trace l2 7 Sm ith - Som e rville H E, H u ryn VB , W a lker C, W in te rs AL. Su rvival of lu lar m u ltip lica tion of L eg ionella pneum oph ila in Tetrahym ena ther2 L eg ionella pneum oph illa in the co ld - wa te r c ilia te Tetrahym ena vorax. ( ) m oph ila. J UO EH , 1994 , 16 4 : 263 ,275 ( ) A ppl Environ M icrobiol, 1991 , 57 9 : 2742 ,2749