MTT比色法测定细胞生长曲线、细胞生长曲线拟合、细胞群体倍增时间

MTT比色法测定细胞生长曲线、细胞生长曲线拟合、细胞群体倍增时间 1.MTT比色法测定细胞生长曲线2.细胞生长曲线的拟合及细胞群体倍增时间的简化计算 1.MTT比色法测定细胞生长曲线2013-1-3 细胞生长曲线 细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也 是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性 的基本参数之一。 一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的迟缓期(潜伏期)，即进入大量分裂的对数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入稳定期，然后退化衰亡。 以存活细胞数万/mL对培养时间h或d作图，即得生长曲线。 一般而言，我们主要研究的是对数生长期的生长曲线。2013-1-3 测定细胞生长曲线的方法1.细胞计数法(简单、最常用、有误差) (1)传代后把细胞重悬，得到细胞悬液，把悬液均匀加到24孔板中 (2)24 h后开始进行细胞计数，以后每隔24 h计数一次，每次取4孔细胞， 分别进行计数，计数结果取4孔的平均值。连续计数6天。 (3)根据细胞计数结果，以单位细胞数细胞数/mL为纵坐标，以时间为 横坐标绘制生长曲线。 24孔板 细胞计数板 2013-1-3 2.MTT法(复杂，误差小) 原理 MTT:全称为3-45-Dimethylthiazol-2-yl-25- diphenyltetrazolium bromide 汉语化学名: 3-4，5-二甲基噻唑-2-2，5-二苯基四 氮唑溴盐 商品名:噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。 活细胞的线粒体中琥珀酸脱氢酶能够使外源性 的MTT还原，同时在细胞色素C 的作用下，生成不 溶于水的蓝色(或蓝紫色)络合物甲臜。 按照时间间隔，通过酶联免疫检测仪在490nm (或570nm)波长处测定甲臜 的光吸收值(A值)。 在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比， 因此可根据光吸收值推算出活细胞的数目。 由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入 MTT 不会有反应。 2013-1-3 1.曲线的测定: 例如:用培养液将煜赴匦玫?细胞悬液，按照4x104/ml细胞密度梯度 分 别接种于 96孔板 每孔 100μl重复 3孔采用 MTT法测量吸光值A值同一浓度下测得的A值 为该浓度下3孔的平均值。 依检测结果 得到吸光值 A值与细胞浓度 的对应关系，绘出标准曲线。 2.细胞生长曲线的测定: 例如:用培养液将待检细胞制成 1×104/ml的细胞悬液分别接种于多块96孔 板 每孔 100μl 在 24、 48、 72、 96及 120 h时间点取一块 96孔板 采用 MTT法测 量吸光值A值得到吸光值A值与时间的关系。 根据标准曲线计算出相应的细胞数 再绘 出细胞的生长曲线。 2013-1-3 2.细胞生长曲线拟合及细胞群体倍增时间的简 化计算2013-1-3 曲线拟合 曲线拟合(curve fitting)是指选择适当的曲线类 型来拟合观测数据，并用拟合的曲线方程分析两 变量间的关系。 SPSS SPSS是世界上最早的统计分析软件，由美国斯坦 福大学的三位研究生Norman H. Nie、C. Hadlai Tex Hull 和 Dale H. Bent于1968年研开发成功， 同时成立了SPSS公司，并于1975年成立法人组织、 在芝加哥组建了SPSS总部。 1984年SPSS总部首先推出了世界上第一个统计分 析软件微机版本SPSS/PC，开创了SPSS微机系列 产品的开发方向，极大地扩充了它的应用范围， 并使其能很快地应用于自然科学、技术科学、社 2013-1-3 通常地，细胞生长曲线的函数拟合模型是 Y a e b t 但由于细胞增值是二次分裂生长，所以选用 Y a 2 b t 作为细胞生长曲线的拟合模型更为合适。2013-1-3 又因为在SPSS中的曲线拟合功能选项中并没有 的 Y a b t 函数拟合模型，只有 Y a eb t 2 于是我们可以通过变换 Y a 2 b t ln 2b t a a e e b t ln 2 a e b k 其中k t ln 2 从而能使用SPSS中的函数拟合模型进行曲线拟合。2013-1-3 原始数据2013-1-3 曲线1. 培养天数 X ln2 k t ln 2 Y a e b k 曲线2. 进入对数生长期天数 X ln2 m() ln2 t-2 Y a e b m 依据以上变量进行曲线拟合记录相应的ab值。 2013-1-32013-1-32013-1-3 2.2 细胞群体倍增时间的简化计算方法2013-1-3 细胞群 体倍增时间的计算方法有2种。 1.做图法:在细胞生长曲线的对数生长期找 出细胞 增加一倍所需的时间即倍增时间 2.公式法按细胞倍增时间计算细胞群体倍 培时间 其为公式为: Td t Lg2 / LgN t LgN 0 (Nt为对数生长期任一点的理论观察值N0 为对数生长期理论初始值) 计算比较复杂而我们基于以往曲线进行理 论推导而行 的理论倍增时间计算相对简单。 2013-1-3 推导过程 t 24h Lg 2 / LgN Td t LgN 0 t 24h Lg 2 / Lg a e Lg a e b t ln 2 b t0 ln 2 t 24h Lg 2 / Lg a 2 Lg a 2 b t b t0 t 24h Lg 2 / b t t0 Lg 2 t24h Lg 2 / bt Lg 2 24h / b2013-1-3 结果 曲线一. b0.855 Td 24h / b 28.070h 曲线二. b0.921 Td 24h / b 26.059h2013-1-3 THANK YOU2013-1-3