【doc】两种RP—HPLC柱前衍生化快速测定核糖霉素方法的建立与比较

【doc】两种RP—HPLC柱前衍生化快速测定核糖霉素方法的建立与比较 两种RP—HPLC柱前衍生化快速测定核糖 霉素方法的建立与比较 中国药科太学 JournalofChinaPhacraaceu~icalUniver~iy1996,27(J):J9,2319 两种RP—HPLC柱前衍生化快速测定 7.J核糖霉素方法的建立与比较 余江南倪坤仪田颂九程光斯 (中国药科大学分析计算中心,南京210009;中国药品生物制品检定所,北京l00050) 摘要分别选用3,5-二硝基苯甲酰氯和2,4-二硝基氟苯作衍生化试剂,柱前衍生,采用高教 细粒度短柱(4.6minx3.3cm,3岍)快速分离,二设管阵列紫外检测器检测,外标法定量,建立了 枝糖霉索及杂质新霉胺的两种RP—HPLC快速测定方法,分析时间均低于5rain.对方法的重现性, 灵敏度,准确度,线性范匿等指标进行考察.结果均夸人满意运用统计配对检验法对两种方法的 测定结果进行相关分析,结果明:方法之间无显着性差异..二.z 关键词枉糖霉素;3,5一二硝基苯甲酰氯;2,4一二硝基氟苯;化学衍生化;反相HPLC;犀押嗜 核糖霉素属氪基糖甙类抗生素,含新霉 胺等杂质,因新霉胺具有较严重的耳,肾毒 性,困而控制产品中新霉胺的含量十分必要. 日前.测定核糖霉素的法定方法仍沿用生物 效价法,其缺点是只能测定总教价值,不能分 别测定核糖霉素及新霉胺的含量近年来,有 报道用荧光标记试剂OPA柱前衍生化, HPLC分离测定核糖霉素及新霉胺.我们参 照有关文献,选用两种常见的紫外标记 试剂3,5一二硝基苯甲酰氯(DNBCL)和2.4一 二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生化,建立了核糖 霉素及新霉胺的两种RP-HPLC快速分离测 定方法.两法的分析时间均低于5rain,与文 献…相比,分析时间大大缩短.DNBCL虽属 常用的氨基,羟基紫外标记试剂,但在氨基糖 甙类抗生素衍生测定中的应用尚为首次. 1实验部分 1.1仪器与药品 Perkin~ElmerIntegral一4000整机式高效 液相色谱仪,包括LC一250四元低压梯度泵, 全自动进样器,内置式柱恒温箱,LC一235二 收辅日期1995-0420 极管阵列紫外检测器(渡长范匿:195~360n m),柱切换装置,EpsonFX一850打印绘图仪} SmrcST一360计算机温度时间控制仪(控温范 围:J,255c);甲醇,2,4一二硝基氟苯 (DNFB).硼酸钠,磷酸钠,磷酸(均为AR);乙 氰(色谱纯);3,5-二硝基苯甲酰氯(DNBCL) (CP,)水为重蒸水;核糖霉索对照品自行制 备,效价850u/mgt新霉胺对照品由中国药 品生物制品检定所提供;硫酸核糖霉索原料 药及注射液均由上海第四制药厂提供.所用 对照品使用前均在60c真空干燥3h. 1.2溶液的配制 硼酸钠配成0.02mol/L的水溶液;硫酸 核糖霉素样品,核糖霉素对照品及新霉胺对 照品均用0.02mol/L硼酸钠水溶液配制,硫 酸核糖霉素样品溶液浓度为2.0mg/ml,核 糖霉索对照品溶液浓度分别为2.0,1.5, 1.0mg/ml,新霉胺对照品溶液浓度为0.4 mgtml;DNBCL配成0.16mol/L的乙氰溶 液;DNFB配成0.15mol/L的甲醇溶液. 1.3DNBCL行生化法 1.3.1衍生物的制奋取样品溶液,核糖霉 20中国药科大学27卷 素对照品溶液(2.0mg/m1),新霉胺对照品溶 液,硼酸钠水溶液各l0l,分别爱4只1ml 反应管中,各加入0.16mol/L的DNBCL乙 氰溶液75pl,塞紧,60?加热30rain,取出, 冷却后,各加入乙氰1ml,摇匀.依次得到硫 酸棱塘霉素样品衍生物,核糖霉索对照品衍 生物及新霉胺对照品衍生物,样品空白衍生 物各种溶液,供确立色谱分离条件使用. 1.3.2色谱条件色谱桂:Perkin—Elmer3× 3CR18(4.6mm×3.3cm.3?m)}流动相: 0.01mol/L磷酸钠溶液一甲醇一乙氰(50;2: 48),pH4.5;流速{1.0ml/min;柱温:30?; 检测波长:230n;色谱图及光谱图分别见 图1(a),图2(a). I.3.3曲线的绘制精密移取核糖霉 素对照品溶液(5mg/叫)】.0,3.0,5.0, 7.0,9.0l置反应管中,用O.02mol/L的硼 酸钠水溶液补充各管,使各管中溶液体积均 达10.0l,每管中加入0.16mol/L的 DNBCL乙氰溶液75.0l,标一刻度,置60C 反应30min,取出,诛箱中放置15rain后.室 温放置,各管补加乙氰至刻度.再精密加入乙 氰1.0ml,摇匀每一浓度溅定3次,每次进 样10.0.以对照品的峰面积(r)对进样量 ()回归,得核塘霉素的回归方程:y;一 i.60十3.63X,r一0.9998:3) 精密移取新霉胺对照品溶液I.0,3.0, 5.0,7.0,9.0置反应管中,衍生化及色谱 方法同上,得新霉胺的回归方程:y一2.67+ 10.9X,一0.9998=3) 0S ") F1.0l?^ 'dDNBCLderivatiza~on-R}rit~mrnycinderivative,一 1.973?l'A{n~minederlv~ive.c.一2.624rain.[b)DNFB dCrivattzst~,R-DNF8}ribo~Iamy~Inderi~tJvc.J.429 min}A—DNFB|n~mined口_"."一2.117IT1jn. F2UVscrum(H).' ta'D?Klr{vatizat,~on1.R.2.^.【b)DNFBOerivati~fion】.RDNFB.2.A,DNFB. 1.3.4回收率测定模拟原料药的比例.照 "1.3.3项下操作方齿,测得不同配比(核糖 霉索与新霉胺的比例分别为:100:0,99,】 .98:2.94l6,90}l0,70:30.57:43) 时模拟样品平均回收率为:核糖霉索 99.7,脚1.1;新霉胺99.9,//SD l期泉江南等:两种RPHPLC柱前衍生化快速测定核糖霉索方法的建立与比较21 1.8(一7).接高,中,低三种量(150, 1O0,50)向制荆中加入核糖霉素及新霉 胺对照品,照1.3.3"项下操作方法,测得制 剂添加样品平均回收率为:核糖霉素 99.8,船D1.4;新霉胺1O1.5.脚 3.0(一6) 1.3.5原料药含量测定精密称取硫酸核 糖霉素约6mg,置2ml量瓶中,用0.02tool/ L的硼酸钠水溶液溶解,定容,得样品溶液. 精密移取样品溶液10.0置反应管中,衍生 化及色谱方法同"1.3.3"项下操作. 1.3.6制剂分析精密移取硫酸核糖霉索 注射液60.01置10ml量瓶中,用0.02 mol/L的硼酸钠水溶液稀释,定容.得样品溶 液.精密移取样品溶液10.0l置反应管中, 衍生化及色谱方法同i.3.3"项下操作. 1.4DNFB衍生化法 1.4.1衍生物的制备取样品溶液,核糖霉 素对照品溶液(1.0mg/m1),新霉胺对照品溶 液,硼酸钠水溶液各10IJl,分别置4只1ml 反应管中,各加入0.15mol/L的DNFB甲醇 溶液30,塞紧,55U加热30min,取出,冷 却后,各加入甲醇1m1.摇匀依次得到硫酸 核糖霉素样品衍生物,核糖霉素对照品衍生 物,新霉胺对照品衍生物及样品空白衍生各 种溶液,供确立色谱分离条件使用. 1.4.2色谱条件色谱柱:Perkin—Elmer3× 3CR18(4.6mm×3.3cm,3"m);流动相:甲 醇一乙氰一水(6:54:40);流速:1.0ml/mln; 柱温:30?;检测波长:35513m;色谱图及光 谱图分别见图1(b),图2(b). 1.4.3标准曲线的绘制精密移取核糖霉 素对照品溶液(浓度为1.0mg/m1)1.0, 3.0.5.0,7.0,9.0l置反应管中.用0.02 mol/L的硼酸钠水溶液补充各管.使各管中 溶液体积均达10.0l,每管中加入0.15 mol/L的DNFB甲醇溶液30.0l,标一刻度, 置55?反应30min.取出,冰箱中放置15 rain后.室温放置,各管补加甲醇至刻度.再 精密加入甲醇1.0ml,摇匀.每一浓度测定3 次,每次进样10.01.以对照品的峰面积) 对进样量()回归,得核糖霉素的回归方程: y一2.31+3.97X.r一0.9998一3). 精密移取新霉胺对照品溶液1.0,3.0, 5.0,7.0,9.0置反应管中,衍生化及色谱 方法同上,得新霉胺的回归方程:y2.04+ 6.91X,r一0.9999(一3). 1.4.4回收率测定模拟原料药的比例,照 "1.4.3"项下操作方法,测得不同配比(配比 同"1.3.4"项下)时模拟样品平均回收率为: 核糖霉索99.8,1.0{新霉胺 9g.2,RSD2.1"一7).按高,中,低三种 量(150,100,50)向制剂中加入核糖 霉素及新霉胺对照品,照1.4.3项下操作方 法,测得制剂添加样品平均回收率为:核糖霉 索102.0,2.0;新霉胺103.1, 船D】.7(4=6). 1.4.5原料药含量测定精密称取硫酸核 糖霉素约5mg,置5ml量瓶中.用0.02mol/ L的硼酸钠水溶液溶解,定容,得样品溶液. 精密移取样品溶液】0.01置反应管中,衍生 化及色谱方法同"1.4.3项下操作. 1.4.6制剂分析精密移取硫酸核糖霉素 注射液60.0l置10ml量瓶中,用0.02 mol/L的硼酸钠水溶液稀释,定容,得样品溶 液.精密移取样品溶液i0.0111置反应管中, 衍生化及色谱方法同.I.43"项下操作. 2结果比较 2.i色谱分离指标比较 用两种衍生化方法得到硫酸核糖霉素样 品衍生物,并对衍生物进行色谱分离,接USP (XXl版)及BP系统适应性试验(SST)要 求.测得各项色谱指标,见表1. 2.2重现性及衍生物的稳定性比较 两种方法的考察结果见表2. 2.3灵敏度,检剐限,线性范围比较 两种方法的测定结果见表3. 22中国药科大学27卷 MH}0dC0ng【i【u11 RepeatabilityofRepeatalityof samplJn~derJv~dzadon 面—广——面- Tab3ComparisonofsensilJvity,deteclJonIImJtand】imn—n;5 2.4原料药含量测定结果比较 对3个批号的硫酸核糖霉素原料药,分 别用两种方法测定其中核糖霉索及新霉胺的 含量.运用统计配对f检验法检查两种方法 之间是否存在显着性差异,结果见表4. 2.5制剂含量测定结果比较 参照.2.项,对3个批号的硫酸核糖霉 素注射液进行分析,结果见表5 Tab{.Significance呐【iI】Eoftowme山0出inysofrwdrug#0.05,l}2.78)[ -}()n,口s() Lab5.Significancetestir.Boftwomee,odsinsna]ysisofpf印ara【i0n(…005.h2.78)[ *:()m() l期余江南等:两种RP—HPLC拄莳衍生化快速测定棱精霉素方法的建立与比较 23 3讨论 1)分别用DNBCL衍生法和DNFB衍生 法测定硫酸核糖霉索原料药及注射液中核糖 霉素及新霉胺的含量,表5与表6显着性检 验结果表明:两法在测定主成分核糖霉索含 量时,无显着性差异{测定杂质新霉胺的含量 时,若新霉胺的含量较高,两法测定结果无显 着性差异,若新霉胺含量较低(如:原料药中 新霉胺含量低于1),两种方法有显着性差 异对于杂质新霉胺,两法可用作限度检查. 2)本文建立的两种柱前衍生化测定方 法均采用高效细粒度填料短柱快速分离,与 文献..方法相比,分析时间大大缩短.见表7. Tab70mpan?叫bew—medaodsthis阳jandint印0冒I~pet UV.travio1H,F:FlLKcee 3)核糖霉素为水溶性样品.在有机溶剂 中几乎不溶,考虑到DNBCL及DNFB衍生化 反应均需在弱碱性条件下进行,为使反应体 系呈碱性,本文的两种方法中均直接用硼酸 钠弱碱水溶液配制样品. 致谢苯宾验是在中国药品生物制品检定所珀金 一 埃尔政液相色谱宾驻室完成的,得瓤j孙曹培研完 冤噩李佐刚老师的指点和帮助. 参考文献 1扬大军.许鸿章.陈妆贤.硫酸棒糖霉素及新霉胺的反 相高教渡相色谱分析.中国耽生素杂志,l99g,15(5): 378 2YoufebfF,Rit~uko0.AkaniM,"MicroHPLCsepara donof3,5?dlnit?nztderivativesofcardiacgtyeosid~ andtheJrmetabo]ites.Jmm.1983.2l;495 3郑明辉.橡宏选-傅承光对酞内酰膣苯甲酰氯柱前衍 生反相高教灌相色谱法分析痕量多胺第^士奎国色 谱告议主某,1991.451 4Karla.GrahamSK.Handboakofderlvatizatlonfurchro mat~raphyLondon:蛳.1978.393 5HenkL.WillyJMUDetecllonorlem~ddet~vadzationth niq…nliquidchromatographsNewYorkt)egCer I,c.1990262 6杨树勤卫生蟪计学北真:人民卫生出版壮.J99J. 10 EstablishmentandComparisonofTwoMethodsforthe AnalysisofRibostamycinbyPre—columnDerivatization RapidRP—HPLC YuJiangnan,NiKunyi,TianSongjiu,ChengGuangxin Department州埘Chemis'try;China撇fLrnflermtyNanj~g210009赴巩la- s&tuteC~mtrotof既珊黜啦B僦,j如尸mM帖Bei.100050 AbstractTWOrapidRP— HPLJcmethodshavebecnestablhedfortheanalys~ofribostamycinandim— purityneamineusing3,5-dinltrobenzoylchloride(DNBCL)and1一 fluor(~2,4-dinitrobenzene(DNFB) precolumnderivatization.Ahighperformaneashortcolumnpackedwithsmallpellets(4.6mm×3.3 cm.3m)hasbeenUSedforrapidseparation.Adiodearrayultravioletdetectorhasbeenemployed fordetection.TheentireanalyticaltimeforeachmethodisIessthan5min.Basedoothevalidationof compendialmethodsinUSP(xX ?).wehaveevaluatedsuchperformancecharacteristicsrepeata— bility,~ensigvity,accuracyand~nearrangeetc.Theresultsaresatisfied.Fui'thermore,"dc'ehaveeval uatedthecorrelativityofthetowmethodsusingpairedstatisticalt— test.Nosignjficantdifferencebe— tweenthetWOmethodshasbecnshown. KeywordsRibostamycin;3.5一Dinitrobenzoylchloride;l—Fluoro一2,4一 fllnitrobenzene:Chemical deriv~tization:RP—HPLC