桂枝甘草汤方药半仿生提取醇沉法最佳醇沉浓度的优选

桂枝甘草汤方药半仿生提取醇沉法最佳醇沉浓度的优选 【摘要】 目的 优选桂枝甘草汤方药半仿生提取醇沉(SBAE)法最佳醇沉浓度。方法 用优 选的最佳半仿生提取,最佳组合方式混煎制备提取液,对提取液分别作甘草次酸、肉桂酸、 总黄酮、干浸膏的含量测定,优选最佳醇沉浓度。结果 醇沉浓度为70%的SBAE液综合评价 Y值明显高于其他醇沉浓度的SBAE液。结论 桂枝甘草汤SBAE法的醇沉浓度以70%为佳。 【关键词】 桂枝甘草汤;半仿生提取法;醇沉浓度 Optimization of Alcohol Concentration of Guizhi Gancao Decoction Extracted by Semi-bionic Extraction XU Ping Nanjing University of TCM, Nanjing 210029, China Abstract:Objective To optimize the alcohol concentration of Guizhi Gancao Decoction extracted by semi-bionic alcoholic extraction (SBAE). Methods Extracts were prepared by the best semi-bionic extraction technology and the best combination method. The contents of Glycyrrhetinic Acid, Cinnamic Acid, total flavones, volatile oil and dry extract in the each extract were determined. Results Comprehensive evaluation Y of 70% alcoholic SBAE extract was significantly higher than that of other alcohol concentration SBAE. Conclusion 70% is the best alcohol concentration of Guizhi Gancao Decoction extracted by SBAE. Key words:Guizhi Gancao Decoction;semi-bionic extraction;alcohol concentration 桂枝甘草汤由桂枝、炙甘草组成,具有补心助阳、生阳化气、补阳扶中的作用。根据半 仿生提取法(SBE)理论[1-5],在用均匀优选出桂枝甘草汤方药SBE法工艺条件和最佳组 合方式的基础上[6-7],为进一步优选该方半仿生提取醇沉法(SBAE)的最佳醇沉浓度,笔者以 甘草次酸、肉桂酸、总黄酮、干浸膏得率为指标,对该方药做了各种醇沉浓度的平行对照试 验,现报道如下。 1 仪器与试药 pHS-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂);MA110型电子分析天平(上海第二分析仪器厂); LXJ-?型离心沉淀机(上海第三分析仪器厂);754紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有 限公司);VP高效液相色谱仪(SHIMADZU Corporation assembled in CHINA),SPD-10A检测 器,LC-10AT泵;KQ-250E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);RE-52AA型旋 转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。 实验用药材经山东中医药大学张兆旺教授鉴定。桂枝为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥嫩枝;甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uraLensis Fisch.的干燥根及根茎。 炙甘草:取炼蜜,加适量冷开水稀释后,淋入净甘草片中,拌匀,闷润,置炒制容器内,用文火加热, 炒至老黄色,不粘手时取出,晾凉(每100 kg甘草片用炼蜜25 kg)。甘草次酸、肉桂酸、柚皮苷 对照品(中国药品生物制品检定所提供,供含量测定用,批号分别为723-200109、0786-9802、 722-200107)。甲醇为色谱纯,水为重蒸馏水,其余试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 提取液的制备 将处方药材分别粉碎,按处方比例(桂枝?甘草,2?1)称取药材粗粉240 g(过10,20目筛)。用优选出的组合方式,即桂枝与甘草混煎的方式,用SBE法提取(双提法;第1煎用水用0.1 moL/L HCl调至pH为2.04,第2、3煎用水用0.1 moL/L NaOH调至pH为7.25、8.51;加水量依次为药材重量的10、8、8倍;煎煮时间依次为190、95、45 min;双提法提取的挥发油单独存放),分别滤过,离心,合并上清液,水浴浓缩至800 mL。 取浓缩液100 mL共6份,调pH值为7.5,加入95%的乙醇调至醇浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%,冷藏放置24 h,离心,上清液回收乙醇至无醇味后,分别用蒸馏水定容至100 mL(每1 mL相当于原药材0.3 g)。 2.2 供试液的制备 精密量取提取液各10 mL,加水35 mL,缓缓加入盐酸4 mL,静置30 min,待气泡消失后,再加盐酸1 mL、氯仿30 mL,水浴加热回流1.5 h,放冷,移至分液漏斗中,静置,分取氯仿层,水层用氯仿萃取(20 mL×2),回收氯仿,残渣用无水乙醇定容至10 mL,得供试液A(每1 mL相当于原药材0.3 g)。 精密量取提取液各15 mL,分别置蒸发皿中,加硅藻土4 g,拌匀,水浴蒸至近干,80 ?烘干,研细,加乙酸乙酯40 mL,超声提取20 min,滤过,回收乙酸乙酯,残渣用甲醇定容至5 mL,得供试液B(每1 mL相当于原药材0.9 g)。 精密量取提取液各25 mL,分别置蒸发皿中,加硅藻土4 g,拌匀,水浴至近干,80 ?烘干,研细,用甲醇100 mL索氏回流5 h (提至无色),滤过,用甲醇定容至100 mL,得供试液C(每1 mL相当于原药材0.075 g)。 2.3 对照品溶液的制备 精密称取甘草次酸对照品1.70 mg,用无水乙醇配制成0.34 mg/mL的溶液。精密称取肉桂酸对照品2.20 mg,用甲醇配制成0.22 mg/mL的溶液。精密称定柚皮苷对照品2.00 mg,用甲醇配制成1.00 mg/mL的溶液。 2.4 甘草次酸的含量测定 2.4.1 色谱分析条件 检测波长250 nm;柱温:35 ?;灵敏度:1.0 AUFS;流动相:甲醇-水(84?16);流速:1.00 mL/min;进样量:20 μL。在上述色谱条件下,甘草次酸与其他成分可达到基线分离,分离度大于1.5,理论塔板数1 981。 2.4.2 线性关系考察 精取甘草次酸对照液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分别用无水乙醇定容至1 mL,各取20 μL进样,按“2.4.1”项下条件依法测定峰面积。以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制曲线,结果甘草次酸在0.68,6.8 μg范围内,其进样量(μg)与峰面积呈良好的线性 1.008 434×106X，104 180,r,0.999 2。 关系,回归方程:Y, 2.4.3 样品含量测定 取供试液A,用0.45 μm微孔滤膜滤过,精取滤液各20 μL,进样,按“2.4.1”项下色谱条件测定,结果见1。 2.5 肉桂酸的含量测定 2.5.1 色谱分析条件 检测波长为267 nm;柱温:35 ?;灵敏度:1.0 AFUS;流动相:甲醇-0.1%磷酸(52?48);流速为1.00 mL/min;进样量为20 μL。在上述色谱条件下,肉桂酸与其他成分均达到基线分离,分离度大于1.5,理论塔板数2 778。 2.5.2 线性关系考察 精密取肉桂酸对照液0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL,分别加甲醇定容至1 mL,各取20 μL进样,测定峰面积。以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,结果肉桂酸在0.11,0.44 μg范围内,其进样量(μg)与峰面积呈良好的线性关系,回归方程:Y,7.467 7×106X，123 315.29,r,0.999 8。 2.5.3 样品含量测定 取供试液B,用0.45 μm微孔滤膜滤过,精取滤液各20 μL,进样,按“2.5.1”项下色谱条件测定,结果见表1。 2.6 总黄酮的含量测定 2.6.1 线性关系的考察 精取柚皮苷对照品溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL,加入甲醇1 mL,再加入10%KOH溶液0.5 mL,室温放置5 min,用甲醇稀释并定容至10 mL,以甲醇作空白对照,在412 nm处测定吸收度。以浓度C(μg/mL)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线,结果总黄酮的线性范围为20,100 μg/mL,回归方程:A,0.052 17C,0.019 7, r,0.999 4。 2.6.2 样品含量测定 精取供试液C各4 mL,用甲醇稀释并定容至100 mL。取上述稀释液1 mL,加10% KOH溶液0.5 mL,室温放置5 min,用甲醇稀释至10 mL,在412 nm处测定吸收度。另取上述稀释液1 mL,用甲醇稀释至10 mL,作为空白对照。总黄酮的含量以柚皮苷计算,结果见表1。 2.7 干浸膏的含量测定 取“2.1”项下各提取液10 mL,分别置恒重的蒸发皿中,水浴蒸干,烘至恒重,计算干浸膏的含量,结果见表1。 表1 6种醇沉浓度SBAE液中各指标成分含量(略) 2.8 综合评判方法与结果 将表1中各指标成分的测定数据,按公式X’i;j,(Xi;j,X( —)j)/Sj进行标准化处理。Xi;j为验证实验样品液i中成分j的含量,X( —)j、Sj分别为各醇沉浓度样品液中成分j的平均值和标准差,X’i;j为标准化后的值。根据各指标在提取工艺中的主次地位,给予不同的加权系数,以标准化后的值X’i;j加权求和,即得综合评价Y值,并求出综合评价Y值,结果见表2。表2 6种醇沉浓度SBAE液中各指标成分含量的标准化值及综合评价值(略)注:Y,(甘草次酸，肉桂酸，总黄酮)×7，干浸膏×4(依据各指标在药效发挥中的作用) 3 小结与讨论 水提醇沉为中药制剂的常用提取方式,经过醇沉可以减少制剂体积,除去杂质,并可以进一步制备其他剂型。本研究对桂枝甘草汤不同醇沉浓度SBAE液中甘草次酸、肉桂酸、总黄酮的含量和干浸膏得率进行比较,结果醇沉浓度为70%的SBAE液综合评价Y值明显高于其他醇沉浓度的SBAE液,提示桂枝甘草汤SBAE法的醇沉浓度以70%为佳。 在制备提取液时调节pH值,目的是使甘草次酸、肉桂酸以盐的形式存在,防止浓缩液中甘草次酸、肉桂酸结晶,醇沉后离心丢失。醇沉时必须对乙醇本身的浓度作温度校正,以保证醇沉浓度的准确,校正公式为:C实 ,C测，(20,t)×0.4。 【参考文献】 ,,,张随学,汪爱民.重视人本管理 提高质量,,,. 中国教育期刊学会. (08) ,2,Stillman PL,Wang Y,Ouyang Q,et al.Teaching and assessing clinical skills:A competencebased programme in China,,,.Med Educ，1997,31(1):3340. ,3,赵洪云，张随学.人文关怀在护理操作中的作用,,,. ,26(10):10351038. ,4,马燕兰.浅谈美国医院以病人为中心服务的实践与思考,,,. 中国科教期刊学会; ,20(7):17631765. ,5,张萌物.走出人本管理的误区,,,. www.cpa1992.com，2005(1):72. ,6,张随学,刘翔，朱士俊.努力实现又好又快发展,,,.中国医学期刊学会,24(1):13. ,7,沈春玲，张随学.,,,,循环在人性化护理服务中的应用,,,.国际护理学杂志，2007,26(10):11321134. ,8,National League fr Nursing.Position statement:Transforming nursing education ,,,. ,中国工业期刊学会.2005,26(3):195. ,9,林菊英.医院管理学,,,. www.cnqkxh.com:人民卫生出版社，2003:167. ,10,段国方，张随学.推行人性化服务 树立医院新形象,,,. 中国中医药期刊学会. ,22(3):284285. ,11,AAMC. Emerging trends in the use of standardized patients,R,.Contemporary Issues in Medical Education,AAMC,1998 ,12,刘启华，王玉玲.以人为本的理念在护士长管理中的应用,,,.中华护理杂志， 2006,41(1):5758. ,13,陈梅 张随学.人体管理思想在护理管理中的应用,,,. 中国高教期刊学会. ,13(1):39. ,14,董玲玲，吕淑红.人性化护理对急性心肌梗死病人急性期心理状态的影响,,,. 中国实用护理杂志，2007,(11):6061. ,15,Klass DJ.Development of a performancebased test of clinical skills for the United States Medical Licensing Examination,C,.Papepresented at the 8th Annual Ottawa International Conference, Philadelphia, PA, 1998. [6]佚名.徐萍 桂枝甘草汤方药半仿生提取醇沉法最佳醇沉浓度的优选.中国医学期刊学会