药学论文-宫内缺氧对幼年大鼠大脑齿状回颗粒细胞及其记忆功能的影响及当归的干预作用

药学论文-宫内缺氧对幼年大鼠大脑齿状回颗粒细胞及其记忆功能的影响及当归的干预作用 作者：钟小明，钟梅，刘跃梅，余鸿 目的探讨宫内缺氧对生后幼年大鼠齿状回颗粒细胞及其学习能力 的影响和当归的干预。方法将孕14 d大鼠置于三气培养箱内缺氧，当归组在缺 氧前注射当归注射液；缺氧组注射生理盐水；对照组注射生理盐水，但不缺氧； 待自然生产，产后30 d各组随机取幼鼠行Morris水迷宫实验，实验后取脑组织， 行神经元特异烯醇化酶（NSE）免疫组织化学染色。结果水迷宫实验各组大鼠在 目标象限的搜索时间比较：缺氧组＜对照组（P＜0.05）；缺氧组＜当归组（P ＜0.05）；积分光密度（IOD）均数比较：缺氧组＜对照组（P＜0.05）；缺氧组＜当归组（P＜0.05）。结论宫内缺氧能损伤齿状回颗粒细胞并降低大鼠的记忆 能力;当归注射液能减轻宫内缺氧对齿状回颗粒细胞的损伤，增强缺氧大鼠的记 忆能力。 宫中缺氧 当归注射液 齿状回颗粒细胞 记忆能力 宫内缺氧是临床上的常见症，缺氧对胎儿生长发育可产生严重影响，尤其对 神经系统影响。神经系统在胚胎发育中出现最早，且对缺氧非常敏感；缺氧可导 致如癫痫、脑瘫、痴呆等的严重后遗症，因此研究宫内缺氧对神经系统的影响具 有重要的临床意义。为此，本实验通过建立大鼠宫内缺氧动物模型，采用免疫组 织化学法检测NSE在缺氧大鼠齿状回中的达及采用Morris水迷宫检测缺氧大鼠的记忆能力，探讨宫内缺氧大鼠在组织学和行为学上的变化及当归的干预作用， 为临床研究宫内缺氧对神经系统的长期影响及评估当归的药用价值提供理论基 础。 1.1 动物 孕SD大鼠20只，由泸州医学院动物实验中心提供，一级实验动物（许可证 号：川实动管质第17号）。 1.2 仪器和试剂 NSE抗体、SABC试剂、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司； 三气培养箱（美国REVCO COMPANY）；自动切片机（Leica RM2245）；Ax07 TRF-A荧光显微成像系统（Olympus）；Image-Pro Plus 5.1图象分析系统（Media Cybernetics Company）；250 g/L当归注射液（武汉大学中南医院批号：060926）。 2.1 建立模型将孕14d的SD鼠随机分为对照组12只、缺氧组12只、当归组15只，缺氧组和当归组孕鼠置于三气培养箱内缺氧（O2浓度体积分数：130 ml/L，温度：25 ?），缺氧2 h/d，连续缺氧3 d，制作缺氧性脑损伤新生鼠模 型，当归组孕鼠在缺氧前1 h经尾静脉注射250 g/L当归注射液（8 ml/kg），注射7 d,缺氧组孕大鼠经尾静脉注射生理盐水（8 ml/kg），其余干预措施同治 疗组；对照组只注射生理盐水，但不缺氧；待自然生产，生后喂养至第30天。 2.2 Morris水迷宫实验各组随机取大鼠（对照组12只，缺氧组12只，治疗组15只）行Morris水迷宫实验，在前几次训练中，如果时间超过60 s，则引导大鼠到平台，让大鼠在平台上停留10 s。 连续训练5 d，阶段训练4次/d，间隔15 min/次，第6天进行60 s的探查实验；在整个水迷宫实验的过程中， 每天均保持实验室的光线、环境布局不变。 2.3 免疫组织化学水迷宫实验结束后立即取幼年大鼠脑组织，经固定、脱水、 浸蜡、包埋，经海马冠状切面切片（片厚4 μm），切片脱蜡至水。行NSE（1:200）免疫组织化学染色。 2.4 分析与判断方法 用Ax07 TRF-A荧光显微成像系统观察每一张切片，每张切片均以海马齿状 回为观察目标，放大倍数为200倍。胞质染成棕黄色的为颗粒细胞，每例大鼠选 一张切片，观察面积为：311×311像素。分析积分光密度值（IOD）和水迷宫实验大鼠在目标象限的探察时间T。采用SPSS14.0统计软件包分析，组间比较采 用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较用LSD检验。对各指标数值分 别作正态分布和方差齐性检验。 水迷宫实验缺氧组大鼠在目标象限的搜索时间比对照组搜索时间短，差异具 有显著性（P＜0.05）；当归组大鼠搜索时间比缺氧组搜索时间长，差异具有显 著性（P＜0.05）。 对照组大鼠齿状回可见NSE阳性表达，为棕黄色，成带状“V”或“U”字形分布；缺氧组胞体形态不规则，NSE表达减弱；当归组表达增多，但仍低于对照 组位于颗粒层。图像分析显示，缺氧组IOD均数比对照组相应指标减低（P＜0.05），当归组IOD均数比缺氧组相应指标增高（P＜0.05）。结果见表1。表1 各组积分光密度值及搜索时间（略） 胚胎宫内缺氧动物模型目前比较成功的有两种：一种是Bjelke法［1］，该法就是先对孕鼠进行药物麻醉，后通过夹闭血管的方法来制作缺氧模型。然而， 麻醉药物、剖腹手术可增加对孕鼠和胎鼠新的干扰因素，尤其是对胚胎神经系统 的影响不容低估。另一种是余鸿等［2］制作的低张性宫内缺氧模型。本实验在 余鸿等研制的宫内缺氧模型的基础上，采用了智能型三气培养箱代替自制的缺氧 缸而制成的持续低张性缺氧的动物模型。实验结果发现缺氧组大鼠神经元的NSE免疫组化阳性细胞的IOD与对照组之间差异有显著意义，缺氧后神经元的数 量和功能发生了改变，提示宫内缺氧模型是成功的。与Bjelke法相比，此模型既排除了手术的干扰，也排除了二氧化碳浓度、温度、湿度变化对实验的干扰； 同时也增大了大鼠缺氧时的活动空间，排除了动物情绪变化对实验的干扰。 烯醇化酶参与糖酵解过程，其中γγ亚型特异性地存在于神经系统成熟的神 经元和神经内分泌细胞中，被命名为NSE。本实验中，观察到缺氧后40 d缺氧组大鼠齿状回NSE免疫组化反应减弱，反映出颗粒细胞在数量上减少，细胞形态 不规则，这可能与缺氧导致细胞内Ca2+离子增加，以至细胞内钙超载，诱发颗粒细胞凋亡［3］和缺氧使N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）受体激活损伤颗粒细胞有关［4］。水迷宫实验提示缺氧组大鼠空间记忆能力明显差于对照组，反映出 作为记忆基础的神经元功能受损。 当归是临床上的常用药物，含有阿魏酸、当归多糖、多种氨基酸和微量元素 等［5］。本实验发现应用当归注射液大鼠NSE免疫组化反应阳性细胞数量较缺氧组增多，染色增强，说明当归注射液能减轻缺氧对颗粒细胞的损伤；水迷宫实 验提示当归组大鼠空间记忆能力明显优于对照组，提示当归注射液能改善缺氧大 鼠的记忆功能，这与区炳雄等［6］发现当归多糖可改善模型组小鼠学习记忆能 力的结论一致，机制可能与以下两方面有关：?当归挥发油通过调节细胞内钙离子代谢来缓解缺氧对血管平滑肌的刺激，抑制血管痉挛，改善微循环，使胚胎缺 氧得以改善；?阿魏酸等有效成分清除缺氧后增多的氧自由基和抗脂质过氧化作 用。细胞缺血缺氧时发生能量代谢失常和氧自由基生成，氧自由基可与细胞膜发 生一系列反应，损伤细胞膜，产生大量的脂质过氧化物。阿魏酸通过直接消除自 由基、抑制超氧自由基引起的膜脂质过氧化反应和自由基反应。 ［1］Bjelke B, Andersson K, Ogren SO, et al. Asphyctic lesion: Proliferation of tyrosine hydroxylase-immunoreactive nerve cell bodies in the rat substantia nigra and functional changes in dopamine neurotransmission ［J］.Brain Res, 1991， 543(1):1. ［2］余鸿, 刘敦玉, 吴雨岭, 等. 当归对缺氧鼠胚模型神经干细胞增殖的 影响［J］. 中国现代医学杂志, 2005,15(21):3226. ［3］Mahura IS. Cerebral ischemia-hypoxia and biophysical mechanisms of neurodegeneration and neuroprotection effects［J］.Fiziol Zh, 2003， 49(2):7. ［4］李振彪，吴希如，姜玉武. 发育中的海马神经元缺氧后N-甲基-D-门冬氨酸受体通道电流变化及腺苷干预作用［J］.实用儿科临床杂志, 2007，21(12): 754. ［5］姚惠萍. 当归属药用植物化学成分研究概况［J］.现代中药研究与实践,2003，17(2):56. ［6］区炳雄，林海.当归多糖对染铅小鼠学习记忆及海马区基因表达的影响 ［J］.辽宁中医杂志，2006，33（7）：901.