民猪HB-EGF基因第4内含子的克隆与分析

民猪HB-EGF基因第4内含子的克隆与分析 民猪HB-EGF基因第4内含子的克隆与分 析 l4 HeilongjiangAnimalScience andVeterinaryMedicine?22010 民猪HB—EGF基因第4内含子的克隆与分析 张晓卉,谢雨彤,张冬杰,刘娣’ (1.东北农业大学动物科技学院,黑龙江哈尔滨150030;2.黑龙江省农业科学院,黑龙江 哈尔滨150086) 中图分类号:$813文献标识码:A文章编号:1004—7034(2010)02—0014—02 关键词:民猪;肝素结合EGF样生长因子;克隆测序 摘要:为了研究民猪肝素结合?EGF样生长因子(hepann—bindingEGF—iikegrowthfactor,HB— EGF)第4内含子的序列及其突变位点,试验采用PCR鉴定及基因克隆测序的方法对民猪HB—EGF 基因第4内含子序列进行克隆与分析.结果明:在民猪的HB—EGF基因第4内含子序列中共发现 3个点突变,即第27个碱基处插入1个T,78A一78G,101T一101C;第27个碱基处插入的T造成了 Nla?酶切位点的改变. Molecularcloningandsequenceanalysisofheparin——bindingEGF——like growthfactor(HB—EGF)geneinMinpig ZHANGXiao—huj1,XIEYu—tong,ZHANGDung—jie,LIUDi (1.CollegeofAnimalScienceTecbndogy,NortheastAgTiculturalUniversity,Harbin150030,China;2. HeilongjiangAcademyof AgnculturalSciences,Harbin150086,China) Keywords:Minpig;HB—EGF:cloningandsequencing Abstract:Inordertostud),theseqleaceandmutab!esiteofthefourthintronofheparin—bindingEGF—likegrowthfactor(HB—EGF)frora Minpig.thisresearchhadsequencedthef0unhintrnnofHB,EGFfromdifferentsamplesofMinpigbyPCR.Theresultsshowedthatthere searchdetected3pointmutationsattlmfourthintronofHB—EGF:27thinsertaT,78A--,78G,10111O1C .The27thinsertaTtedtothe change0fN1aI11enzvmerestrictiGn.’ 表皮生长因子家族是由表皮生长因子(EGF),转 化生长因子(TGF,仅),肝素结合性EG}样生长因 子(heparin—bindingEGF—likegrowthfactor.HB— EGF),两性调节蛋白(AR),$一细胞调节素(BTC)等 生长因子构成,这些生长因子可与EGF受体家族结 合,其中HB—EGF主要分布于胞外区,融入质膜,细 胞表面和细胞膜.EGF受体家族包括ErbBl(EG— FR),ErbB2(HER2),ErbB3(HER3)和ErbB4 (HER4)4种受体谷氨酸激酶,这些生长因子与EGF 受体家族相互作用,在哺乳动物生殖过程中起重要的 凋节作用…. HB,EGF可能与p$-~L动物妊娠调节有关,对人 类早孕绒毛及蜕膜组织表达胚泡着床,胎盘形成和维 持胎盘功能起到一定的作用引.胎盘产生的HB— EGF在正常妊娠及妊娠期高』0【压疾病的妊娠晚期胎 艋的表达有明显差异,妊娠期高10I压疾病胎盛组织中 收稿日期:2009—07,09:修回日期:2009—10—28 基金项目:”十一五”国家科技支撑计划目(2008BADB2B02) 作者简介:张晓卉(1986一),女,硕士研究生 通讯作者:刘娣(1963,),女,教授,博士,博1生导师. HB—EGF的表达水平显着低于正常妊娠.HB— EGF在妊娠期高血压疾病的发病及病理生理过程中 有重要的作用.胎盘组织内HB—EGF的减少有可 能是发生妊娠期高血压疾病的原因之一J.研究对 民猪HB—EGF基因第4内含子进行了克隆与分析, 现报道如下. 1材料与方法 1.1材料 民猪3头,由黑龙江省兰西县民猪场提供,采集 其耳组织样品置于10%乙醇中带回实验室,通过常 规的酚一氯仿法提取基因组DNA,一20?保存,备 用. 限制性内切酶BamHI和HindIll,pMD18一T 载体,DL一2000Maker,TaqDNA聚合酶,宝生物工 程(大连)有限公司生产;胶回收试剂盒,质粒提取试 剂盒,天根生化科技(北京)有限公司生产. 1.2方法 1.2.1引物的设计与合成参照GenBank上已发 表的猪HB—EGF基因cDNA序列,通过NCBI检索 获得人和鼠的该基因全序列,将3条序列进行比对后 《黑龙江畜牧兽医》科技版 应用PrimerPremier5.0设计引物,并用Oligo6.0进 行评价,筛选出评分较高的引物.引物序列为F5一 GCTGTCGTCCGTCTCTCT一3.R5-一GTCACGC— CCAATrTCACT一3,预期长度为1231bp. 1.2.2PCR反应反应体系(50ILL):10×扩增缓 冲液5L,4种dNTP混合物4L,上,下游引物各 2L,rTaqDNA聚合酶0.4IxL,模板DNA2IxL, ddH2034.6I. HB—EGF一4PCR反应条件:94?10min; 94?30s,55?30s,72oC90s,共30个循环;72? 8rain. 1.2.3克隆及测序以3头民猪的基因组为模板分 别进行目的片段的PCi!扩增,回收,纯化后连接于 pMD18一T载体,转化大肠杆菌DH5ot感受态细胞, 随机挑选阳性重组子送北京华大生物工程有限公司 测序. 2结果 克隆测序后发现,PCR扩增后获得了1条长度为 888bp的片段,与预期片段相比略短,说明猪的HB— EGF基因第4内含子(序列见图1)略短于人的该基 因片段. 将所测序列进行比对后发现,该扩增片段存在 GC1-GTCGTC0GTCT(,TC1_GCTcG1?ATGTGGGGCr]?TGTGTTCAGG1_GAGTGTTACAGCCTGT TTCCACACATCACTTC『rG丁rCcT1?TGC1?CGGC1.rCTTerACCCGATGA1?ACGTGAGCTCCA CAGTC,CTGAGACAGTCAGGCC1?AGGC1_GTGCTTcCAATCCCGGTTATG1?TCAGAC1_GGGGAG GCCTGCTAAGCcCTCTGTCG1_r1_A0GAGTAG1-GGGGGTClATCTGT.G(‘TGAGGCC1?CATCGCT CACGCCC1_rC1_rCAGGCT.rGAAT不1?CG1.GACTG1?ACCTC1-GTCCCCCGGCC1?TTAAG GATGCGGTGAGGAFTGCATAAACGGG(TGAACG丁rGTCTGCAAATTGTAGCC1_ACaG1.GAG声GAC AGGCACCCCTTGGGCCAGTTGGGTCTTTGGC(GTTGGGCTGCCCTA1_GTCTCTGGGC CTTTCT AA(,TTTGGTGAGAACCATTGGGCCAGAGTGT了?CGGAAGGACCTGCTCGGGGACCTGCATCCTG TTAGAACAAACAGAGC-rTGCTCAC丁GGGCTCTCCC1-CAGG1ACCAeAGGAGAGGAGG丁rG ACGTGGAAAATGAAGAG.AAAGTGAAA’frGGGCGTGACTGC『『TCCCACTGA 注:下划线部分为内含子序列. 图1HB—EGF基因第4内含于序列 Fig】SequenceresultofHB—EGFintron4 3个突变位点:第27/i,碱基处发生插入1个T的突 变;第78个碱基A一+G;第101个碱基T—C.第 27个碱基的插入突变造成NlallI酶切位点的改变,预 计酶切带型为AA型14bp/29bp/320bp/513bp,BB 型43bp/320bp/5l3bp,AB型14bp/29bp/43bp/ 320bp/513bp.序列比对结果见图2. 27l0】 图2HB—EGI,基因第4内含子序列比对结果 Fig2SequenceresultofHB——EGFintron4 3讨论 HB,EGF允当受体和表皮生长因子受体结合作 为生长因子’素结合,可能与猪妊娠调节有关.研 究根据GenBank上登陆的基因序列设计特异性引 物,首次克隆了民猪HB—EGF基因的第4内含子序 列,在民猪发现了1个突变性酶切位点,为进一步揭 示HB—EGF基因的多态性分布情况及功能研究提 供了基础. 参考文献: [1]岳占碰,杨增明.表皮生长因子家族与哺乳动物的胚胎着床 [J].生殖与避孕,2001,21(1):3—8. [2]姜群其,陈?岭,邢福棋.肝素结合性表皮生长因子在早孕绒毛 及蜕膜组织中的表达[J]中华围产医学杂志,2001,4(I1:I3— 14 [3]岳瑛,周娜,刘晓霞,等.正常妊娠及妊娠期高血压疾病的晚期 胎盘组织中肝素结合性表皮生长因子免疫组化分析[J].-围 妇幼保健,2006,2I(I6):2211—2213. [4J李建武.生物化学实验原和方法[M].北京:北京大学fB版社, j994.f()09)