革兰阳性细菌菌毛结构和功能研究进展

革兰阳性细菌菌毛结构和功能研究进展 ?综述?革兰阳性细菌菌毛结构和功能研究进展张先云王长军南京军区军事医学研究所江苏南京南京师范大学生命科学学院江苏南京【摘要】 菌毛是细菌面的一种多亚基蛋白聚合物。在革兰阳性菌中菌毛亚基蛋白通过分选锚定酶介导的反应进行共价聚合并锚定到细胞壁上。菌毛参与细菌对宿主组织和细胞的黏附、侵袭和定植等重要生理活动。本文综述革兰阳性菌菌毛结构、分子装配及其功能方面研究进展。【关键词】 革兰阳性菌菌毛结构功能综述【中图分类号】 【文献标识码】 【文章编号】 【】 【 】 菌毛是细菌表面的一种特殊结构呈细长丝状。革兰阳性菌表面的菌毛样结构首次在牛肾盂炎棒杆菌中发现随后在放线菌 、白喉棒状杆菌 、唾液链球菌 、血链球菌 、猪链球菌 等中被发现。近年研究发现在革兰阳性致病链球菌如群链球菌 、群链球菌 和肺炎链球菌 中菌毛参与病原菌黏附、侵入宿主组织和致病等过程被证实为重要的毒力因子。此外在多种病原菌中菌毛结构蛋白被视为理想的疫苗候选分子。 革兰阳性菌中的菌毛电镜观察发现革兰阳性菌菌毛有两种类型。在唾液链球菌、格登链球菌 和口腔链球菌 中菌毛较短呈稀疏细丝状直径一般从细胞表面延伸在棒状杆菌和致病性链球菌中菌毛则较长呈柔软杆状直径为可长达μ。革兰阳性菌的菌毛是由多个菌毛亚基共价装配形成的聚合体。内氏放线菌 拥有两种不同类型的菌毛均由两类菌毛结构蛋白组成即形成杆状骨架的菌毛骨架蛋白和位于骨架顶端或基底部的菌毛辅助蛋白。大量研究发现多数菌毛由三种菌毛结构蛋白聚合而成菌毛骨架蛋白和两种菌毛辅助蛋白和骨架蛋白形成菌毛的主体结构辅助蛋白主要分布在细菌表面少数也存在于菌毛结构上在白喉棒状杆菌和肺炎链球菌中辅助蛋白沿着骨架蛋白间隔性分布或定位于菌毛顶端。研究发现、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌和的菌毛具有共同的特性由种亚基蛋白共价结合装配而成每个亚基均含有分选酶特异性基序 或类似序列在特定酶催化参与下菌毛各亚基次序发生共价聚合并将聚合物锚定到细胞壁表面的肽聚糖上。革兰阳性菌菌毛结构蛋白通过非二硫键的共价连接在一起这与革兰阴性菌菌毛装配连接机制是不同的后者的菌毛亚基之间以非共价结合。 革兰阳性菌的转肽酶和菌毛基因簇革兰阳性菌菌毛与阴性菌菌毛显著不同前者通过亚基分子间共价键连接而成不需要特异的伴侣分子参与组装且其顶端蛋白多为黏附分子也不是菌毛结构的初始生成所必需的。革兰阳性菌编码菌毛的基因常以成簇的形式存在具有可移动遗传元件的部分特征这些基因常在同一个操纵子内按照同一个方向进行转录编码菌毛装配所需要的菌毛结构亚蛋白和多聚化必需的分选酶酶具有蛋白酶和转肽酶的活性。如图所示在链球菌属化脓链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌和猪链球菌中均发现了菌毛基因簇甚至在一个细菌的基因组中有多个菌毛基因簇部分基因簇可编码多个功能相异的酶协同完成菌毛的装配和锚定。在白喉棒状杆菌、内氏放线菌和肠球菌等也发现类似的菌毛基因簇。现有的研究结果表明几乎每种革兰阳性菌都会编??中国病原生物学杂志 年月 第卷第期 【基金项目】 国家自然科学基金项目江苏省自然科学基金项目。【通讯作者】 王长军【作者简介】 张先云女安徽人南京师范大学生命科学学院微生物学专业硕士研究生主要从事猪链球菌分子致病机理研究。码一个保守的分选酶也称“持家”酶但不在菌毛基因簇内编码。完整的菌毛结构与细胞壁之间共价连接的有效性与的活性密切相联还担负细菌中绝大多数含有端细胞壁分选信号 的蛋白分子的分选并将其锚定于细胞壁的功能。此外许多病原菌还具有一些执行特定功能的特异性的转肽酶分别命名为、和且其编码基因通常位于其底物蛋白基因的附近形成特定的功能基因簇。其中涉及铁离子的摄取参与菌毛装配与芽孢形成有关。每个菌毛基因簇至少含有一类菌毛转肽酶介导单体菌毛结构蛋白的聚合。酶能够识别带有的分泌蛋白中 基序将其中苏甘氨酸之间的键断开最后由将蛋白转位共价连接到细胞壁上或由将其连接到菌毛骨架上。 革兰阳性菌菌毛的分子装配一般而言革兰阳性菌菌毛骨架蛋白含有类保守基序菌毛蛋白基序、 基序和锚定于细胞壁所必需的但在化脓链球菌的某些菌株中菌毛骨架蛋白抗原缺乏菌毛结构基序和 。当菌毛骨架蛋白单体进行装配时首先由酶将骨架蛋白的 基序切开形成酰基酶中间体然后骨架蛋白基序中保守的赖氨酸上氨基作为电子供体对酰基酶中间体进行亲核攻击形成酰胺键而连在一起。若基序上保守的赖氨酸突变骨架蛋白则不能聚合成菌毛结构而是以单体形式被锚定在细胞壁上。在许多革兰阳性菌基序中氨基酸序列较为保守它担负着对菌毛辅助蛋白和酶间硫酯键亲核攻击的功能。 在菌毛辅助蛋白装配到菌毛骨架中发挥关键作用当 基序中的谷氨酸被其他氨基酸所取代菌毛辅助蛋白则不能被装配到菌毛骨架上。在白喉棒状杆菌菌毛骨架蛋白的 基序中谷氨酸残基的改变将导致至少一种菌毛辅助蛋白的聚合受阻但对菌毛骨架蛋白的聚合没有影响。在其他细菌中尚未见 作用的报道。白喉棒状杆菌是革兰阳性菌菌毛装配研究的模式细菌其装配过程是由酶介导的酶促反应可以分为个步骤如图所示。第步含有 基序或其变异形式如 的三种菌毛蛋白分泌到细胞表面然后依赖末端跨膜区而锚定到细胞膜上。一旦跨膜区改变或丢失这些蛋白则不能保留在细胞表面而是分泌出去。第步是由介导的酶促反应。菌毛蛋白在 基序中的苏氨酸和甘氨酸之间断裂开在酶催化区的半胱氨酸残基的硫醇基和菌毛蛋白的 基序上苏氨酸残基的羧基间生成一个共价硫酯键从而形成一个酰基酶中间体。中半胱氨酸突变或者 基序的改变将会阻碍上述酶促反应并影响菌毛的正常装配。由于是膜相关酶酰基酶中间体形成后定位于细胞膜。第步和第步是菌毛骨架蛋白的聚合以及聚合物锚定到细胞壁。在这个过程中菌毛骨架蛋白基序上赖氨酸的ε氨基对另一菌毛骨架蛋白形成的酰基酶中间体上的硫酯键进行亲核攻击形成酆衔锶绱朔锤唇幼烹木厶乔疤謇嘀 衔铫颌螂那派系陌被 缀斯セ骶酆衔锷系牧蝓ゼ 蛴刖 蛋白间形成一个酰胺键将菌毛蛋白聚合物锚定到细胞壁上。关于菌毛辅助蛋白如何聚合到菌毛骨架蛋白上目前有两种猜测一种是辅助蛋白以骨架蛋白聚合相同的方式参与菌毛骨架的聚合如一般在聚合于菌毛结构顶端。另一种是辅助蛋白以分支的方式与菌毛骨架的骨架蛋白连接即骨架蛋白的 基序的谷氨酸与辅助蛋白 基序中苏氨酸相连。值得一提的是菌毛辅助蛋白不仅能够在特异酶催化作用下参与菌毛形成而且可作为黏附素在“管家”酶作用下直接锚定到细胞壁肽聚糖上。 菌毛的生物学功能在革兰阴性致病菌中菌毛是细菌黏附宿主细胞的重要结构基础黏附也是细菌定植致病的关键环节。类似地革兰阳性菌菌毛对于病菌宿主间的相互作用和最终定植到合适的组织起着重要的作用。对白喉棒状杆菌研究发现在三种菌毛结构中型菌毛主要介导细菌黏附到人咽上皮细胞而和型菌毛与细菌黏附到喉和肺上皮细胞相关。只表达型菌毛的棒状杆菌能紧密黏附咽上皮细胞但对其他上皮细胞的黏附能力显著减弱缺失所有酶的棒状杆菌突变体对多种上皮细胞的黏附能力显著下降。通过敲除基因并研究其编码蛋白的功能发现突变体不能形成型菌毛结构也不能很好地结合到咽上皮细胞上敲除或基因 突变体对咽上皮细胞的黏附作用显著减弱与菌毛辅助蛋白的选择性黏附作用一致而双突变体对咽细胞的黏附能力显著减弱。此外研究发现辅助蛋白和的特异性抗血清可阻止棒状杆菌黏附咽上皮细胞而与重组菌毛辅助蛋白连接的乳胶颗粒可特异性结合到咽上皮细胞但不能结合到肺或喉上皮细胞。这提示次要菌毛蛋白与细菌的黏附和组织趋向性有关。近年来发现在三种主要的人类致病性链球菌中即、和肺炎链球菌菌毛在病原菌的黏附和侵袭过程方面起着重要的作用。革兰阳性菌菌毛的共价结合装配可以在一定程度上提示黏附的机制。菌毛是由菌毛骨架蛋白的同源聚合以及辅助蛋白间有规律地装配于菌毛主干或细菌表面而形成的。有报道称的菌毛辅助蛋白是胶原结合蛋白具有黏附素的功能。根据菌毛的结构特征等提出了一个假定黏附模型图即伸展的菌毛结构与宿主靶细胞或者细胞外基质进行最初接触且可能是位于顶端的行使这一功能菌毛骨架结构蛋白或具有能够和宿主靶细胞相互作用的黏附特性使细菌以“拉链效应”沿着菌毛进行连续粘附而被拉近至宿主细胞表面这使定位于细菌表面的和细菌表面其他非菌毛蛋白粘附素可与其对应的受体结合进而使细菌与宿主细胞发生更紧密的结合作用为细菌对特定组织的定植和侵袭创造条件。最终大量的病原菌的定植使宿主细胞产生了免疫反应并引发炎症。等发现菌株的菌毛辅助蛋白编码基因缺失突变株与野生株相比对人肺癌上皮细胞和细胞的黏附能力下降菌毛骨架蛋白编码基因缺失突变株对上述细胞的黏附能力无显著改变表明菌毛辅助蛋白可能是菌毛结构中的关键黏附因子黏附作用并不依赖完整的菌毛结构。研究发现菌株菌毛可促进细菌黏附、侵入宿主的脑血管内皮细胞其中菌毛辅助蛋白??中国病原生物学杂志 年月 第卷第期 与初始黏附有关而菌毛骨架蛋白则在细菌对的侵袭过程中发挥作用。在化脓链球菌菌毛辅助蛋白介导细菌特异性黏附两种与临床致病相关的组织细胞即人扁桃体上皮细胞和人原始角质化细胞但不能介导细菌黏附人喉癌上皮细胞或细胞辅助蛋白缺失的突变体虽然仍能形成菌毛但基本丧失其黏附功能。近期研究发现缺失菌毛骨架蛋白的突变体与野生株相比更容易被宿主巨噬细胞和中性粒细胞杀死也更易在血液中被宿主免疫系统清除且毒力明显比野生株低这可能与能够抑制巨噬细胞和中性粒细胞释放抗菌肽 有关在乳酸乳球菌中过量克隆表达该菌对巨噬细胞杀伤的抵抗能力增强在血液中的存活能力增强在小鼠模型中毒力增强提示菌毛骨架蛋白在毒力方面发挥着重要作用。在肺炎链球菌中菌毛对细菌致病性有直接的贡献。研究发现带有菌毛岛的肺炎链球菌对细胞的黏附能力显著强于缺乏菌毛岛的细菌使用菌毛株和无菌毛株的细菌培养混合液在动物模型上进行鼻饲实验发现菌毛株比无菌毛株在组织定植、引发肺炎和菌血症方面更有优势同时菌毛株还能更加有效地引发肿瘤坏死因子αα和白细胞介素的释放诱发宿主产生更强烈的促炎症反应。此外菌毛辅助蛋白是菌毛介导黏附作用的主要分子该蛋白在菌毛多聚体结构形成受限时仍能很好地黏附细胞。菌毛介导的对宿主组织细胞的黏附涉及到不同菌毛黏附素的特异受体。尽管对棒状杆菌、链球菌和肠球菌的菌毛受体尚知之甚少但对放线菌菌毛受体的研究已经迈出了重要的一步。内氏放线菌能够装配两种类型的菌毛介导细菌定植到牙齿和粘膜表面并易化其他口腔细菌的定植。其中型菌毛介导细菌黏附到唾液酸脯氨酸丰富的蛋?/B>和包被在牙齿珐琅质的富酪蛋白上型菌毛识别宿主细胞表面糖复合物和口腔链球菌中的β半乳糖和乙酰半乳糖胺基序。这两种类型的菌毛都是由骨架蛋白和辅助蛋白亚基组成辅助蛋白可能作为黏附素与宿主细胞受体发生作用并在牙菌斑的形成中起着重要作用。此外在牙 菌斑形成过程中内氏放线菌等口腔细菌还可以通过菌毛交叉聚合形成生物被膜菌毛还可以促进其他细菌的聚集这种聚集可能有助于不同菌种间的相互交流使细菌对宿主防御的抵抗力更强促进细菌定植到组织上。 菌毛蛋白是潜在的疫苗候选分子存在于细菌表面的菌毛已被证实能促进细菌黏附使之成为理想的疫苗候选分子。世纪年代等曾以纯化的淋球菌菌毛蛋白开展疫苗临床试验。研究发现以菌毛蛋白免疫产生的抗体可以抑制活的淋球菌依附上皮细胞并保护实验者不受表达此菌毛同源物的细菌侵袭。但该疫苗因在大规模试用时效果不佳而受挫主要是由于疫苗产生抗体滴度较低且野生株抗原突变体较多。值得一提的是该疫苗是单价抗原如果合理配伍研制多价疫苗可能会显著增强疫苗的效能。等以抗大肠埃希菌外毒素的菌毛疫苗进行猪免疫实验发现纯化的菌毛蛋白对哺乳期的猪有免疫保护作用但这种保护作用只针对菌毛蛋白同源菌株对非同源菌毛菌株没有交叉保护。等用高通量筛选获得了个保护性抗原制成种抗原的联合多价疫苗发现其免疫保护作用更强能够保护子代小鼠抵抗种菌株包括种已知的血清型的致死剂量野毒株的感染推测联合疫苗诱导人体中性粒细胞产生补体依赖的调理杀伤作用更强。值得注意的是其中个保护性抗原和是存在于多种两个菌毛岛编码的菌毛结构蛋白。此外用重组的 株菌毛岛上的菌毛骨架蛋白免疫小鼠发现其对小鼠也有免疫保护作用。菌毛抗原在其他多种细菌感染中也证实具有免疫保护作用。用肺炎链球菌菌株重组的菌毛结构蛋白和对小鼠进行主动免疫显示具有保护作用。用个菌毛结构蛋白、和联合的重组蛋白免疫小鼠小鼠抵抗经粘膜途径致死剂量野生株攻击的能力显著提高存活率达以上提示该组菌毛结构蛋白具有保护性可作为疫苗的候选分子。有趣的是菌毛抗原也是 血清型系统即血清型的抗原依据菌毛蛋白的不同可分为个血清型。然而不同菌毛型间的交叉保护程度目前还未知晓。此外等用重组的型猪链球菌菌毛岛蛋白的个片段免疫小鼠发现对其具有显著的免疫保护作用。秦跃红等对国内强毒力株型猪链球菌的菌毛结构蛋白进行了研究克隆表达了菌毛岛中的两个菌毛结构蛋白基因和并初步探究了重组蛋白对小鼠的免疫保护作用。研究结果显示菌毛结构蛋白和均具有良好的免疫保护作用与国外学者在菌毛蛋白的免疫效能研究结果一致。近期研究表明在大多数致病菌中找到广谱又高度保守的抗原可能较为困难但革兰阳性致病菌的菌毛疫苗显然比革兰阴性菌更为成.