武汉大学生物检测实验一时间分辨荧光免疫分析法检测乙肝病毒血清20120406

null实验一 时间分辨荧光免疫分析法检测乙肝病毒血清标志物 实验一 时间分辨荧光免疫分析法检测乙肝病毒血清标志物 目的要求目的要求掌握时间分辨荧光免疫分析的检测原理。 了解时间分辨荧光免疫分析仪的构造、工作原理。 采用时间分辨荧光免疫分析仪检测乙肝病毒血清标志物的操作过程。 一、实验原理 一、实验原理 时间分辨荧光免疫分析（TRFIA，Time Resolved Fluorescent Immunoassay），又称解离增强镧系荧光免疫分析（DELFIA，Dissociation Enhancement Lanthamide Fluoro Immunoassay），是以镧系元素为标记物和时间分辨荧光测量相结合，建立的一种新的非放射性微量检测技术。 DELFIA在抗原抗体特异性反应的基础上，用三价稀土离子〔如铕（Eu3+）、钐（Sm3+）、铽（Tb3+）和镝（Dy3+）等〕及其螯合物作为标记物代替荧光物质、同位素、酶等标记物，标记抗原或抗体。标记的二抗可与抗原抗体复合物结合形成抗原-抗体-标记二抗免疫复合物，用时间分辨荧光分析仪测定复合物中稀土离子发射荧光的强度，根据荧光强度判断反应体系中待检测物质的浓度，达到定量分析的目的。 nullTRFIA原理图TRFIA测定过程TRFIA测定过程（1）抗原抗体结合 （2）加入Eu3+螯合抗体，经温育后形成固相包被抗体-抗原- Eu3+螯合抗体复合物。 （3）加入酸性增强液，使Eu3+从免疫复合物中解离，形成新的微囊。它在340nm激发光照射下，发射出613nm荧光。乙型肝炎病毒表面抗原测定原理乙型肝炎病毒表面抗原测定原理采用双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析法（IFMA）法定量检测人血清乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）。 以单克隆抗-HBs抗体包被反应板，用铕标记试剂（DTTA-Eu）标记抗-HBs。 待测样本加入反应板微孔后，样本中的HBsAg与包被于微孔表面的单克隆抗体结合。 洗涤后，加入铕标记的抗-HBs（抗-HBs- DTTA-Eu），抗-HBs- DTTA-Eu与结合在板上的HBsAg反应，在微孔表面形成免疫复合物：抗-HBs-HBsAg-抗-HBs- DTTA-Eu。 洗涤除去游离的铕标记抗-HBs，加入增强液将复合物上的Eu3+解离到溶液中，并与增强液中的有效成分形成高荧光强度的螯合物。 荧光强度与样本中的HBsAg浓度成正比，通过剂量-反应曲线得出样本HBsAg浓度值。 乙型肝炎病毒e抗体测定原理乙型肝炎病毒e抗体测定原理采用中和抑制时间分辨荧光免疫分析法（IFMA）法定量检测人血清乙型肝炎病毒e抗体（HBsAg）。 用多克隆抗-Hbe抗体包被反应板，用铕标记单克隆抗-Hbe，定量加入待测样本及HbeAg中和抗原。 若标本中有抗-HBe时，HbeAg将被中和使最后形成的抗Hbe-HbeAg-铕标记抗Hbe复合物减少。 增强液将标记在抗体上的Eu3+解离到溶液中，Eu3+和增强液中的有效成分形成高荧光强度的螯合物。 荧光强度与样本中的抗HBe浓度成反比，通过剂量-反应曲线得出样本抗HBe浓度值。二、实验材料和用品二、实验材料和用品10个待测样本 试剂盒 乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂盒（时间分辨荧光免疫分析法） 乙型肝炎病毒e抗体定量测定试剂盒（时间分辨荧光免疫分析法） 所需仪器包括微量移液器、离心机、振荡仪、洗板机、时间分辨免疫分析仪。 三、实验内容三、实验内容（一）待测样本中HBsAg含量的检测 （二）待测样本中HBeAb含量的检测 （一）待测样本中HBsAg含量的检测（一）待测样本中HBsAg含量的检测1. 试剂的准备——配制洗涤液：将40ml浓缩洗涤液稀释25倍，配制成1×工作用洗涤液。 2. 将试剂从冰箱中取出，取出检测所需数量的包被板条平衡至室温，分小组分别标记（如：1#、2#、……11#等）。 注：每组用校准品做一个标准曲线，每个同学做一个待测样本。null3. 分别取100μL校准品和待测样本加入相应的孔中，并加贴封条。 4. 孔号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11中，分别加入校准A、校准B、校准C、校准D、校准E、校准F、样本1、样本2、样本3、样本4、样本5。 注意：加样时，一定要注意加入顺序，从左至右依次加入！null5. 置于振荡仪上缓慢振荡，室温孵育40分钟。 6. 配制铕标记物工作液：按检测所需将浓缩铕标记物稀释50倍备用。 7. 孵育40分钟后，弃掉孔中液体，洗涤，每孔加液360μL，弃掉孔中液体，拍干。重复以上洗涤4次。 8. 拍干孔中残余液体，每孔加入100μL铕标记物工作液，并加贴封条。置于振荡仪上缓慢振荡，室温孵育40分钟。 9. 按步骤7洗涤，重复洗涤6次。 10. 拍干孔中残余液体，每孔加入100μL增强液（加样过程中不要碰到小孔边缘），并加贴封条。 11. 置于振荡仪上缓慢振荡，室温孵育5分钟。 12. 在时间分辨免疫分析仪上检测荧光（在半小时内完成）。 使用专用软件根据荧光强度计算各标志物浓度。结果判断结果判断1. 浓度值≥0.2ng/ml的样品判断为阳性，否则为阴性。 2. 浓度值＞ 150ng/ml的样品应稀释。 3. A点计数＜5000，F点计数＞1,000,000。 4. 剂量反应曲线的线性相关系数r＞0.9800 5. 典型的剂量反应曲线。 6.待测样本中HBsAg含量的检测（二）待测样本中HBeAb含量的检测（二）待测样本中HBeAb含量的检测1. 试剂的准备——配制洗涤液：将40ml浓缩洗涤液稀释25倍，配制成1×工作用洗涤液。 2. 将试剂从冰箱中取出，取出检测所需数量的包被板条平衡至室温，分小组分别标记（如：1#、2#、……11#等）。 注：每组用校准品做一个标准曲线。每个同学做一个待测样本。null3. 分别取50μL校准品和待测样本加入相应的孔中。 4、孔号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11中，加入校准A、校准B、校准C、校准D、校准E、校准F、样本6、样本7、样本8、样本9 、样本10 。 注意：加样时，一定要注意加入顺序，从左至右依次加入！null5. 各孔加入50μL HbeAg中和抗原，并加贴封条。置于振荡仪上缓慢振荡，室温孵育40 min。 6. 配制铕标记物工作液：按检测所需将浓缩铕标记物稀释50倍备用。 7. 孵育40分钟后，弃掉孔中液体，洗涤，每孔加液360μL，弃掉孔中液体，拍干。重复以上洗涤4次。 8. 拍干孔中残余液体，每孔加入100μL铕标记物工作液，并加贴封条。 9. 置于振荡仪上缓慢振荡，室温孵育40 min 。 10. 按步骤7洗涤，重复洗涤6次。 11. 拍干孔中残余液体，每孔加入100μL增强液（加样过程中不要碰到小孔边缘），并加贴封条。 12. 置于振荡仪上缓慢振荡，室温孵育5分钟。 13. 在时间分辨免疫分析仪上检测荧光（在半小时内完成）。 14. 使用专用软件根据荧光强度计算各标志物浓度。结果判断结果判断1. 试剂盒：CUT OFF=0.2 PEI U/mL。 2. 如果CUT OFF与被测标本的荧光计数值（COUNTS) 的比值≥1.0,判断为阳性,否则为阴性。 3. A点计数＞70000 4. F点计数＜ 20000null 尽量建立一个干净的实验室环境 试剂盒与待检样品使用前必须达到室温 封片不能重复使用 吸取增强液盒铕标记物时，请使用洁净的吸头，避免尘土等不必要的污染。 加增强液时吸头应悬空，避免碰到小孔边缘或其中试剂。五、注意事项：思考问题思考问题为什么必须尽量建立一个干净无尘的实验环境？为什么要求使用干净的一次性塑料容器来配置试剂？为什么加样时不可重复使用加样枪头？ 为什么配置浓缩洗液的水要求用去离子水？