激动剂

Application Note: CM0005 Key Words • TSQ Quantum • LC/MS/MS • β-受体激动剂 高效液相色谱-串联质谱法检测 动物源性食品中β-受体激动剂类药物残留 徐锦忠1，丁涛1，刘飞2 1．江苏出入境检验检疫局食品实验室；2. 赛默飞世尔科技（上海）公司色谱质谱部 β-受体激动剂，又称为β-兴奋剂（β－agonists）是一类人工合成药物，主要用于防治 人、兽支气管哮喘和支气管痉挛，在药学上称为β-肾上腺素兴奋剂。β-受体激动剂在体 育比赛中可用于增强运动员、动物(如马)肌肉，提高运动成绩，国际奥委会将β-受体激动 剂列为禁用药物。β-受体激动剂根据苯环取代基结构分为苯胺型（如：克伦特罗，俗称： 瘦肉精）、苯酚型（沙丁胺醇）、间苯二酚型（如：特布他林）。 80年代，国内外研究表明，在饲料中添加β-受体激动剂具有营养再分配作用，可以明显提 高瘦肉率。1992年，西班牙首次发生物多人食用含β-受体激动剂的畜产品中毒事件；1997 年，香港发生进食大陆供港猪的内脏引起人中毒等事件。随着中国加入WTO后，国外对 于中国出口的食品提出更高的要求，最近我国因兽药残留问题出口欧盟肉制品受阻；普通 大众也需要无公害食品。因此，对β－受体激动剂的研究不仅在临床药物代谢动力学 上、体育运动中，而且在食品安全方面都有重要意义。目前，对β-受体激动剂的分析 有高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱－质谱法（LC/MS）、酶联免疫法（ELISA）、 气相色谱-质谱法(GC/MS)等。 本文建立了猪肝、猪肉、牛奶和鸡蛋等动物源性食品组织中特布他林、西马特罗、沙丁胺 醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克仑特罗、妥布特罗、喷布特罗、心得安共10种 β-受体激动剂LC-MS/MS法残留检测方法。 1. 实验部分 1.1 仪器与试剂 TSQ Quantum三重四极杆串联质谱仪（赛默飞世尔科技Thermo Fisher Scientific公司），配置 有电喷雾电离源（ESI）；Surveyor MS Pump液相色谱系统，包括Surveyor AS自动进样器。 标准品特布他林（Turbuterol)、西马特罗（Cimaterol)、沙丁胺醇（Salbutamol）、非诺特罗 （Fenoterol）、氯丙那林（Clorprenaline hydrochloride）、莱克多巴胺（Rackdopamine）、 克伦特罗（Clenbuterol）、妥布特罗(Tulobuterol)、喷布特罗(Penbuterol)、心得安 （Propranolol）纯度均大于98％。用甲醇溶解并配制成1.0 mg/mL标准储备液，再根据需要 稀释成适当含量的混合标准工作液。其他试剂均为HPLC色谱纯。 1.2 样品制备 1.2.1 酶解 准确称取经均质化的动物源性样品2 g (精确到0.01 g)于50 mL 离心管中，加入0.2 mol/L 乙酸铵溶液（pH 5.2）10 mL, 然后加入β－盐酸葡萄糖醛苷酶/.芳基硫酸酯酶 40 μL， 涡旋混匀3 min，于37 ℃下水浴避光振荡16 h。 1.2.2 提取 样品酶解后放置至室温，涡旋混匀3 min，高速离心10 min（10000 rpm），取出上清液于 另一50 mL 离心管中，加入1 mol/L高氯酸溶液1 mL，涡旋混匀， 高速离心10min后，转 移上清液至另一50mL离心管内。 1.2.3 净化 用MCX固相萃取柱进行SPE净化。用甲醇5 mL活化固相萃取柱后，上样，抽干，然后用5 ％ 氨水甲醇溶液5 mL洗脱。洗脱液在40 ℃下 N2吹干，以20％乙腈水溶液1.0 mL溶解残渣， 过0.45 μm滤膜，供LC/MS/MS法测定。 1.3 液相色谱及质谱条件 1.3.1 色谱条件 关键词：TSQ Quantum, β-受体激动剂, LC/MS/MS 表1 流动相梯度洗脱条件 Time（min） A (%) B (%) 0 90 10 0.5 90 10 5 10 90 10 10 90 10.1 90 10 12 90 10 1.3.2 质谱条件 电喷雾电离源（ESI），正离子模式；选择反应监控（SRM）扫描模式，喷雾电压：4500 V；离子传输管温度：350 ℃；氮气作为鞘气和辅助气，其中鞘气为30 arb, 辅助气为5 arb，氩气用作碰撞气, 碰撞压力为1.5 mTorr; 选择反应监测（SRM）离子对见表2。 表2 β-受体激动剂类药物的SRM质谱条件 药物名称 母离子 碎片离子（碰撞能量 V） 1 特布他林（Turbuterol) 226 107（31），152（35），152（15） 2 西马特罗（Cimaterol) 220 143（22），202（10），160（18） 3 沙丁胺醇（Salbutamol） 240 148（18），166（14），222（11） 4 非诺特罗（Fenoterol） 304.1 107.1 (30)，135.1 (18) 5 氯丙那林（Clorprenaline hydrochloride） 214.1 119.1 (27), 154 (17) 6 莱克多巴胺（Rackdopamine） 302 121（20），164（14），284（8） 7 克伦特罗（Clenbuterol） 277 132（27），168（26），203（16）， 259（8） 8 妥布特罗 (Tulobuterol) 228.1 119（28），154（16），172（14） 9 喷布特罗 (Penbuterol) 292.2 201（21），236.2（16） 10 心得安（Propranolol） 260.2 183（18），116.2（18） 色谱柱：Thermo Hypersil Gold (150 × 2.1 mm,5 μm)；梯度洗脱见表1，其中A：水（5 mM乙酸铵）；B：甲醇；流速：250 μL/min；进样量：10 μL。 注：下划线碎片离子为定量离子 2 结果与讨论 2．1 方法灵敏度（定量限，LOQ）：本方法沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴 胺、克仑特罗、妥布特罗、喷布特罗和心得安在猪肝、猪肉、牛奶和鸡蛋等动物源性食品 组织中的定量限均可达0.1 μg/kg，西马特罗、特布他林为0.5 μg/kg。图2为得到的典型 LC/MS/MS色谱图。 图2 β-受体激动剂药物LC/MS/MS色谱图（1ng/mL） 2．2 方法准确度：本方法β-受体激动剂药物在猪肝、猪肉、牛奶和鸡蛋等动物源性食品 组织中的提取回收率均可达75 - 120 %，满足国内外的最低检出限要求，并且定量定性准 确，重现性好。 3 结论 本方法建立了β-受体激动剂药物药物在猪肝、猪肉、牛奶和鸡蛋等动物源性食品中的LC/ MS/MS检测方法，其基本原理为：组织样品中的β-受体激动剂残留药物经酶解，用高氯酸 调节pH值后，在酸性条件下沉淀蛋白，上清液再用MCX固相萃取柱净化，高效液相色谱－ 串联质谱（LC/MS/MS）法检测。方法灵敏度、提取回收率、重现性等均满足国内外监控和 检测要求。 Page 4 of 8 C/MS application notes at: www.thermo.com/appnotes