熊果酸诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究

· 154· doi：10．3969／j．issn．1005-0264．201 1．03．009 熊果酸诱导人肝癌 SMMC一7721细胞凋亡的研究 谢艳茹 周月芬 丽水市中心医院肿瘤内科 (浙江 丽水，323000) 中西医结合肝病杂志2011年第21卷第3期 · 基础理论 研究 · 摘 要 目的：观察熊果酸 (UA)对人肝癌 SMMC-7721细胞的增殖抑制及诱导其凋亡作用。方法：MTY法 5、l0、2O、30、40、50p．mol／L uA对 SMMC-7721细胞生长的抑制作用，吖啶橙 (AO)荧光染色、电镜和流式细胞仪 检测细胞凋亡。结果：uA能显著抑制 SMMC-7721细胞的增殖，其作用呈剂量依赖性。35．2p．mol／L uA作用 SMMC- 7721细胞 48小时后 AO染色，荧光显微镜下可见细胞出现体积缩小，核碎裂，染色质凝集等凋亡形态改变；电镜下 SMMC-7721细胞 出现明显的细胞凋亡的形态学改变，细胞核染色质出现边聚和中聚，细胞 内部分线粒体肿胀；SMMC- 7721细胞凋亡率为 (67．91±5．24)％，与对照组 (2．95±0．56)％比较差异有显著性意义 (P<0．05)。结论：UA通 过诱导 sMMC-7721细胞凋亡抑制其生长。 关键词 熊果酸／药效学；SMMC-7721细胞；凋亡 Apoptosis of SM M C-772 1 cells induced by ursolic acid XIE YAN-RU，ZHOU YUE—FEN．Department ofOncology Lishui Central Hospitol(Lishui Zhejiang，323000)China Abstract Objective：To observe the inhibition and apoptosis effect of ursolic acid on SMMC-7721 cells．Methods：MTI"一 based cytotoxicity assayWas usedtotesttheinhibition effect ofdifferent concentration(suchas 5，10，20，30，40，50 Ixmol／ L)UA on SMMC-7721 ceils；Acridine orange(AO)staining，electron microscopy and flow cytometry were used to detected cell apoptosis．ResllIts：UA significantly inhibited SMMC-7721 ceils proliferation in a dose—dependent manner．AO staining Was ob— served SMMC-7721 cells for 35．21~mol／L UA role after 48 hours，cells were seen under fluorescent microscope shrinkage，nucle． ar fragmentation，chromatin morphological changes of apoptosis；SMMC-7721 cells showed significant apoptosis morphological changes，nuclear chromatin margination and the accumulation OCCUrs，intraceilular part of the mitoehondrial swelling under elec— tron microscope；Apoptosis rate of SMMC-7721 cells Was (67．91±5．24)％ ，and the control group Was (2．95 ±0．56)％ ， tIle difference Was statistically significant(P <0．05)．Conclusion：UA can inhibited the proliferation of SMMC-7721 cells by induced apoptosis． Key W ords ursolic acid／pharmacodynamics；SMMC-7721 cells；apoptosis 熊果酸 (Ursolic acid，UA)又名乌索酸，乌苏酸，是存 在于白花蛇舌草、山楂、女子贞、夏枯草等多种天然植物中的 五环三萜类化合物，具有护肝、降脂、免疫调节、抗氧化和抗 肿瘤等多种生物学活性 ¨J，研究明UA不仅对多种致癌、 促癌物有抵抗作用，而且能抑制多种恶性肿瘤细胞的生长， UA可诱导人乳腺癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤等多种肿瘤细胞凋 亡 ，但关于 uA对人肝癌 SMMC-7721细胞的作用却少有 报道。本研究 以人肝癌 SMMC-7721细胞为研究对象，采用 MrlT法、荧光染色法、流式细胞术等方法检测 UA对 SMMC一 7721细胞的增殖作用及诱导凋亡作用，为深入研究 uA抗肝癌 方面的功效提供实验基础和理论依据。 1 材料与方法 1．1 试剂和主要仪器 熊果酸 (UA)购自天津市医药科学研 究所，纯度 >99．9％ ，不溶于水 ，实验中采用二甲基亚砜溶解 UA，配置成 1mol／L储存液 ，二甲基亚砜浓度不超过 0．1％； DMEM培养基购于Gibco公司；四甲基偶氮唑盐购自Sigma公 司；吖啶橙购 自鼎国生物技术公司。主要仪器有 MK3型酶标 仪 (Labsystem，Finland)、CK-18倒置荧光显微镜 (Olympus， Japan)、Epics流式细胞仪 (Beckman，USA)、CO2培养箱 (SONY，Japan)。 1．2 人肝癌 SMMC-7721细胞培养 人肝癌 SMMC-7721细胞 株购于中科院上海细胞生物研究所，培养于含 10％胎牛血清 的 DMEM培养基中，培养基含青霉素 IOOkU／L，链霉素 lOOmg／ml，在 37~C，5％CO：，饱和湿度培养箱 内培养，取对 中西医结合肝病杂志2011年第21卷第 3期 数生长期细胞进行以下实验。 1．3 UA对 SMMC一772l细胞增殖的抑制作用 MTF 法测定 5、 10、2o、3o、40、501xrnol／L UA作用48小时对SMMC-7721细胞的 生长抑制作用。细胞生长抑制率 (inhibition rate，IR)= (阴性 对照组A值．实验组A值)／阴性对照组A值×100％ 。 1．4 SMMC-7721细胞吖啶橙 (AO)荧光染色 收集阴性对 照组 (不加药物)和35．2Ixmol／L uA作用48小时的SMMC一 7721细胞，PBS应用液洗涤两遍，制成浓度为 1×10 cells／ml 的细胞悬液，取 95 l SMMC-7721细胞悬液加入 51xl(0．1ms／ m1)AO储存液混匀，吸一滴细胞悬液滴于洁净玻片上，直接 用盖玻片封片，荧光显微镜下观察SMMC-7721细胞形态。 1．5 电镜观察 SMMC-7721细胞凋亡 分别收集阴性对照组 (不加药物)和35．21xmol／L UA作用 48小时的 SMMC-7721细 胞置离心管中，1 00Or／分钟离心 10分钟；用 1×PBS重悬细 胞，2 00Or／分钟离心 15～20分钟，小心吸去上清，加人 2．5％戊二醛固定液固定 1～3小时，经缓冲液冲洗后，再用 1％四氧化碱固定 1—2小时。逐级梯度丙酮脱水和 Epon618包 埋，LKB．V超薄切片机切片，醋酸双氧铀与柠檬铅双染色， JEM一100CX透射电镜观察。 1．6 Annexin V—FITC／PI双染 色法检 测 SMMC-7721细胞 凋 亡 分别收集 (不加药物)对照组和35．2lxmol／L UA作用48小 时的SMMC-7721细胞，PBS应用液洗涤两次，重悬于结合缓 冲液中，调整细胞浓度为5×10。／ml，加入5 l Annexin V—FITC 和5 l PI混匀，室温避光孵育30分钟。加入300~1缓冲液， 流式细胞仪检测SMMC-7721细胞凋亡率。 1．7 统计学方法 所有资料均采用 SPSS13．0软件包进行统计 学处理。计量资料用 ±s表示，两组间均数采用t检验，P< 0．05为差异有统计学意义。 2 结果 2．1 UA对 SMMC-7721细胞的增殖抑制作用 对照组 SMMC一 7721细胞生长活跃，经 5、10、20、30、40、501~mol／L UA作 用 48小时后，SMMC-7721细胞生长均不 同程度 的受到抑制 ， 并呈明显剂量依赖性，UA作用 SMMC-7721细胞48小时的 ICs0为 35．21~mol／L。 2．2 AO荧光 染 色法 SMMC-7721细胞 形 态观 察 对 照组 SMMC-7721细胞AO染色后荧光显微镜下观察，细胞核形态， 细胞质呈均匀弥散绿色荧光；35．21~mol／L uA作用 48小时 SMMC-7721细胞，荧光显微镜下可见出现细胞皱缩，体积缩 小，染色不均，细胞核固缩或碎裂，染色质凝集等凋亡形态改 变。见附 I页图 1。 2．3 透射 电镜观察结果 对照组 SMMC-7721细胞生长良好 ， 核质比较大，部分癌细胞核常染色质丰富，核仁增大、增多 ， 胞质内核糖体丰富，线粒体较多，细胞表面有较多的微绒毛突 起。实验组 SMMC-7721细胞出现 明显的细胞凋亡 的形态学改 变，细胞核染色质出现边聚和中聚，细胞内部分线粒体肿胀， 可见凋亡小体。见附 I页图2。 2．4 AnnexinV．FITC／PI检测细胞凋亡率 为了确定凋亡的存 在 ，并且定量凋亡率，应用 Annexin V-FITC／PI双染法检 测 SMMC-7721细胞凋亡。35．2p,mol／L UA作 用 48小时后 ， · l55· SMMC-7721细胞凋亡率为 (67．91±5．24)％，与对照组 (2．95 ±0．56)％比较差异有显著性意义 (P<0．05)，提示 UA可以 诱导SMMC-7721细胞凋亡。见附 I页图3。 3 讨论 熊果酸广泛存在于多种天然药物中，研究发现，UA对多 种肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用，其抗癌作用引起了人 们的重视。Lee等研究结果表明，UA可以使肿瘤细胞在生长、 氧消耗及肿瘤间质液压方面发生改变，并通过 MTr法、促克 隆和生长延迟实验发现，UA抑制肿瘤作用明显，对P-388、L． 1210白血病细胞、A-549人肺腺癌细胞等多种肿瘤细胞有细胞 毒作用，IC 。<41．Lg／ml。本 实验 结 果表 明，UA对 人肝 癌 SMMC-7721细胞的生长具有明显的抑制作用，并呈明显剂量 依赖性，UA作用 SMMC-7721细胞 48小 时 的 Ic 为 35．2 I~mo]／L 。 肝癌是临床常见的消化系肿瘤，恶性程度高，预后差，对 失去手术时机的患者，化疗效果不满意，故探求高效细胞凋亡 诱导剂，对提高肝癌的化疗效果具有重要的临床意义。细胞凋 亡参与了肝癌发生、发展的整个过程，肝癌的发生、发展和形 成取决于肿瘤细胞增生与细胞凋亡的相互作用 。 。本研究 通过用 AO荧光染色法、透射电镜等形态学定性的方法检测细 胞凋亡，可以看出，UA在体外成功地诱导了人肝癌 SMMC一 7721细胞产生凋亡 ，形态学观察实验结果均与细胞凋亡时产 生各种 改变 的理论 相符合。AO染 色荧光 显微镜 下 观察， 35．21~mol／L uA作用 48小时的SMMC-7721细胞出现胞质浓 缩，体积缩小，染色增强，‘形成致密浓缩的绿色荧光，核固缩 或碎裂 ；透射电镜下可见 UA组 SMMC-7721细胞细胞核染色 质出现边聚和中聚，细胞内部分线粒体肿胀，凋亡小体可见。 Annexin V．FITC／PI双荧光染色流式细胞仪定量检测凋亡率， 是目前检测细胞凋亡和区分坏死细胞特异性的较好的方法。实 验结果表明：35．21xmol／L uA作用 48小时后，SMMC-7721细 胞凋亡率为 (67．91 4-5．24)％、与对照组 [(2．95±0．56)％] 比较差异有显著性意义 (P<0．05)。 综上所述 ，本研究从形态学 方面观察到 UA 可以诱导 SMMC-7721细胞凋亡，采用 Annexin V-FITC／PI双荧光染色流 式细胞仪定量检测凋亡率，可以证实 uA对SMMC-7721细胞 的增殖抑制作用是通过诱导其凋亡实现的。关于 UA诱导 SMMC-7721细胞凋亡的机制正在深入研究中。 参考文献 [1]YUMIKO A，KIYOSHI H，YASUHIRO U．Regulation of the phosphati— dylinositol 3-kinase—Akt and the mitogen—activated protein kinase path· ways by ursolie acid in human endometrial caricer cells[J]．Biosci Biotechnol Biochem．2007，71(1)：31-37． [2]BANNO N，AKIHISA T，TOKUDA H，et a1．Triterpene acids from the leaves of Perilla frutescens and their anti inflammatory and antitumor promoting effects[J]．Biosci Biotechnol Biochem，2004，68(1)： 85—90． [3]EUN K YOUNG Y，KEUN HOL，SUNG EUN N，et a1．Proteomic anal— ysis of ursolic acid induced apoptosis in cervical carcinoma cells[J]． Cancer Lett，2006，235：209—220． (下转第 172页) 111 高亮 111 高亮 111 高亮 · 172· 图3 钙化型 肝结核声像图 图4 混合型 肝结核声像图 (肝实质回声弥漫性 增强。箭头所示为肝右叶内1．6×1．5cm低回声结节) 3 讨论 结核病分为肺内结核和肺外结核，肝结核属于肺外结核少 见类型，多由血行播散而来。据文献报道，几乎所有粟粒性结 核都可累及肝脾，约40％～60％肠结核或腹膜结核，5％肺结 核患者有肝脾结核的存在 。当发现肝结核时，原发结核病 灶已自愈或非常隐匿，而很难发现。 肝结核的超声表现是随其病理学演变过程的不同而呈现复 杂性和多变性 ，各型肝结核的超声表现均无特异性。肝结核的 基本病理变化是结核性肉芽肿，可表现为干酪性坏死、液化坏 死、纤维组织增生和钙化。其声像图表现与其病理特点有关， 早期由于结核结节形成，形成强弱相间的混合型回声，液化坏 死则形成无回声区，空洞期则形成弱回声，结核变为纤维化期 时则形成强回声。病变钙化则为砂粒状或斑片状强回声伴声 影，此为肝结核的特征性表现之一。 中西医结合肝病杂志2011年第21卷第3期 超声用于肝结核的诊断，仍是非特异性检查方法，需结合 患者病史和临床表现。为了提高诊断正确率，需与以下几种病 变相鉴别：①肝脓肿：局部压迫有疼痛感，实验室检查多数有 白细胞增高，声像图表现病灶内部强光点随呼吸、体位改变而 浮动，并缓慢向底层积聚呈层状回声。②肝血管瘤：声像图表 现为肝内的稍强回声或低回声团，边界较明显清晰，内部可见 筛网状无回声区。彩色多普勒检查病变区内显示条状、点状静 脉血流。③肝癌：肿块多数有 “声晕”，后方回声衰减，较大 的瘤体有压迫症状，而内部液化或钙化征象少见，癌肿近肝表 面出现驼峰征。肿块内部血管迂曲，血流较多，周边血流阻力 低于结核病灶血流阻力。晚期门静脉、肝静脉内出现癌栓实性 回声。④肝内胆管结石：在肝内出现强回声团，后方伴有声 影。结石强回声团具有沿左右肝管走向分布的特点，同时肝内 胆管扩张。而肝结核的钙化灶分布在肝实质内，无沿胆管分布 的特征，一般不引起肝内胆管扩张。⑤非均质性脂肪肝或局限 性脂肪肝：前者，肝脏呈脂肪肝声像，其中可见一片不规则低 一 弱回声区，病变区内见较模糊的管道结构，彩色多普勒显示 正常，肝内血流进入病变区；后者肝段或一叶肝内部回声增 高，与相邻肝段或叶有清晰的平直界限，内部有较模糊的正常 走向管道结构，彩色多普勒可见肝静脉及门静脉血流。 关于肝结核的诊断，若作超声引导下肝穿刺活检病理检查 出郎罕细胞或抗酸杆菌，是诊断结核的绝对证据。但病理检查 不一定能发现结核的特异病变，有时仅为非特异的慢性炎 症 。超声检出肝结核可疑病例时，可试行抗结核治疗，有 明显疗效也可以确诊，以免延误治疗，避免一些重症活动性肝 结核恶化而导致患者死亡。 在肝结核治疗中，通过超声动态观察病灶变化，可以了解 病情发展及抗结核药物疗效，因而超声可为临床诊断肝结核提 供可靠依据，同时可作为肝结核治疗的随访手段。 参考文献 [1]ROSIN RD，ROLF M，GUNNER，MD．Tuberculosis of the liver[J] ． Tu·bercle，1978，59：47—48． [2]韩硬海，李树桐 ．临床肝脏病学 [M]．济南 ：山东科学技术 出 版社，2004：425—426． (收稿 日期：2011—03—17 编辑：胡肃平) 0 ●0 ●<>●<> ‘<>●<：’●(>●<>●<>●<>●<>●<>●<>●<>●0 ●0 ●<>●<>●<>●<>●《>●<>●<>●<>●<>●<>●o ●0 ●<>●<>●<>●-C>●<>●<>●<>●<>●<>●0 ●<>●<>●C>●<>●o ●<>●(>●(>●<>●0 ● (上接第 155页) [4]TIAN Z，LIN G，ZHENG R X，et a1．Antihep~oma activity and mech— anism of ursotic acid and its derivatives isolated from Aralia decais． neana[J]．World J Gastroenterol，2006，12(6)：874—879． [5]ZHANG YY，DENG，T，HU Z F，et a1．Mechanisms ofinhibiting pro- liferation and inducing apoptosis of human gastric cancer cell line SGC7901 by ursolic acid[J]．Chinese J Cancer，2006，25(4)： 432—437． 【6 j PIERRE OLIVIER HARMAND，RAPHAEL DUVAL。CHRIS~ANE DELAGE，et 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