食品中叶酸的测定GBT 5009.211-2008

lCS67．040 C53 a园 中华人民共和国国家标准 GB／T5009．211—2008 2008—1I-21发布 食品中叶酸的测定 Determinationoffolatesinfoods 2009-03-01实施 中华人民共和国卫生部世士 中国国家标准化管理委员会及仰 刖 罱 GB／T5009．211—2008 本标准修改采用国际家学会(A()ACINTERNATIONAI。)中AOAC944．12《维生素预混料中 叶酸的测定》(Folicacidinvitaminpreparations)。 本标准与AOAC944．12相比主要差异为： ——增加了，普通食品试样提取步骤； ——扩大了适用范围。 本标准的附录A和附录B为性附录。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。 本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、辽宁省疾病预防控制中心、浙江省医 学科学院、北京市营养源研究所。 本标准主要起草人：王竹、杨晶明、张旭、马景宏、唐靓、李跃中、王克诚。 食品中叶酸的测定 GB／T5009．211—2008 1范围 本标准规定了食品中叶酸的测定。 本标准适用于食品中叶酸的测定。 本标准的检出限：普通食品，当称样量为5g时，检出限为2pg／100g；营养素补充剂、强化剂及预 混料．当称样量为1g时，检出限为2F￡g／100g。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB／T6682--2008，ISO3696：1987，MOD) 3原理 01‘酸是细菌生长所必需的营养素，在一定控制条件下，细菌的生长响应与培养基中叶酸含量呈线性 关系。用比浊法测定试样液中细菌增殖后的混浊度，通过与标准曲线相比较计算出试样中叶酸的含量。 4试剂 除另有外，所用试剂均为分析纯，实验用水为GB／T6682规定的二级水。 4．1 甲苯(C．H。)。 4．2磷酸钠(Na。PO；·12H：())。 4．3磷酸氢二钠(Na!HPO。·7H?O)。 4．4抗坏血酸(C。H。O。)。 4．5无水乙醇(C=H6())。 4．6氢氧化钠(NaOH)。 4．7盐酸(HCl)。 4．8鸡胰酶(chickenpancrease)”。 4．9木瓜蛋白酶(papain)”。 4．10淀粉酶(takadiastase)”。 4．11 叶酸(C。。H1。NMO)：纯度>98％。 4．12葡萄糖(C。H．：O。)。 4．13蛋白胨(peptone)。 4．14酵母提取物(yeastextract)。 1) 由Difco公司提供的产品。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不示对该产品的认可。如果其他 等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 2) 由Sigma公司提供的产品。给出这一信息是为了方便本标准的使用者．并不表示对该产品的认可。如果其他 等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 1 GB／T5009．211—2008 4．15琼脂。 4．16磷酸氢二钾g／100g) (2) GB／T5009．211—2008 m。——一从标准曲线上查得试样管中叶酸含量，单位为纳克(ng)； v。——制备试样管时吸取的试样液体积，单位为毫升(mL)； v。——试样提取液定容体积，单位为毫升(mL)； ，——试样液稀释倍数； 。，——鸡胰酶液或(和)蛋白酶一淀粉酶液中叶酸含量，单位为纳克(ng)； m——试样质量，单位为克(g)； }器——由纳克每克(ng／g)换算为微克每百克(pg／10。g’的系数。 注：营养素补充剂、强化剂及预混料等试样提取步骤中因无酶解处理，故无需计算酶空白液中叶酸含量，即式(2)中 m1—0。 8精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15％。 GB／T5009．211—2008 A．1 测定 附录A (资料性附录) 叶酸标准储备液浓度的测定 准确吸取1．0mI。标准储备液至10mL容量瓶中，用氢氧化钠溶液(o．1mol／L)定容至刻度。以氢 氧化钠溶液(o．1m。l／L)调零点，比色杯厚度1cm，波长256nm，用紫外分光光度计测定三次吸光度 值，取平均值。 A．2计算 按式(A．1)计算标准储备液叶酸浓度。 c一鲁×M×10×103 ￡ 式中： c——标准储备液中叶酸浓度，单位为微克每毫升(pg／mL) 万——平均吸光度值； E——摩尔消光系数，24500； M——叶酸相对分子质量，441．42； 10——稀释倍数； 10。——由克每升换算为微克每毫升的换算系数。 (A．1) B．1试剂 附录B (资料性附录) 叶酸测定用基础培养液的配制方法 GB／T5009．211—2008 B．1．1无水乙醇(CzHsO)。 B．1．2不含维生素的酪蛋白(vitaminfreecasein)。 B．1．3碳酸氢钠(NaHCOs)。 B．1．4碳酸氢钠(NaHCO。)溶液：0．1mol／L。 B．1．5盐酸(HCI)。 B．1．6盐酸溶液：3mol／I，，1mol／L。 B．1．7氢氧化钠(NaOH)溶液：10mol／I，，1mol／L。 B．1．8胰酶(pancreatin)。 B．1．9甲苯。 B．1．10硅藻土。 B．1．11冰乙酸(C。H—O。)。 B．1．12乙酸溶液：0．02mol／L。 B．1．13活性炭。 B．1．14硫酸腺嘌呤(C-。H，。N-o·H。SO。)。 B．1．15盐酸鸟嘌呤(C；H。NsOs·HCl) B．1．16尿嘧啶(C4H4N202)。 B．1．17黄嘌呤(C5H4Nt02)。 B．1．18氨水(NH。O)。 B．1．19三水合乙酸钠(CzH。OzNa·3H20)。 B．1．20核黄素(C。，Hz。NtOe)。 B．1．21生物素(C。。H16N203s)。 B．1．22对氨基苯甲酸(C，H，NOz)。 B．1．23盐酸吡哆醇(CsH。。NOs·HCI)。 B．1．24盐酸硫胺素(CtzH，，clNaOS·HCl)。 B．1．25泛酸钙(Cl8H3zCaN2010)。 B．1．26尼克酸(CsHsNOz)。 B．1．27聚山梨酯一80(吐温80)。 B．1．28还原型谷胱甘肽(C”H。，N。O。S) B．1．29L天冬氨酸(CaH，NOt)。 B．1．30L色氨酸(C11H12N202)。 B．1．31I。一盐酸半胱氨酸(C。H，NO。S·HCI)。 B．1．32无水葡萄糖(C。H。：O。)。 B．1．33溴麝香草酚蓝(cz，HzsBrzO。s)溶液：按4．35配制。 B．1．34溴酚蓝(c。。H。。Br。o；s)溶液：0．1g／100mL，无水乙醇(B．1．1)配制。此指示剂变色终点为草 绿色(pH3．5)。 B．1．35酪蛋白液：可按下列任一种方法制备。 7 GB／T5009．211—2008 B．1．35．1酶解酪蛋白液：称取50g不含维生素的酪蛋白(B．1．2)至1L烧杯中，慢慢加入1I，碳酸氢 钠溶液(B．1．4)：以防止结块，用10moI／I，氢氧化钠溶液(B．1．7)调节pH值至8．0。加入300mg胰酶 (B．1．8)，搅拌20rain，使胰酶充分混匀。加入2．5mL甲苯(B．1．9)，置37℃±l℃恒温培养箱中酶解 48h～72h。从恒温培养箱中取出酪蛋白酶解液，于121℃高压30rain以终止反应，冷却至室温。加入 10g硅藻土(B．1．10)，搅拌均匀，用布氏漏斗过滤，滤液用约60mI．冰乙酸(B．1．11)调节pH值至3．7。 称取12g活性炭(B．1．13)，加入滤液中准确搅拌10rain，用铺有10g硅藻土的布氏漏斗过滤，滤液从 “称取12g活性炭⋯⋯”开始重复操作两次。最终滤液用水稀释至1200mL。取10mL酶解酪蛋白液 于平皿中150℃烘干至恒重，如固体含量<40mg／mL，则弃除酪蛋白液，重新制备。制备好的酪蛋白 液加1mI，～3mL甲苯(B．1．9)，2℃～4℃冰箱冷藏保存一年。 B．1．35．2酸解酪蛋白液：称取50g不含维生素的酪蛋白(B．1．2)于500mI。烧杯中，加200mL盐酸 溶液(B．1．6)，于121℃高压水解6h。将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴上蒸发至膏状。加200mL 水使之溶解后再蒸发至膏状，如此反复三次，以除去盐酸。以溴酚蓝(B．1．34)作外指示剂，用10mol／I。 氢氧化钠(B．1．7)调节pH值至指示剂颜色转为草绿色(pH3．5)。加20g活性炭(B．1．13)，振摇约 20rain，过滤。重复活性炭处理直至滤液呈淡黄色或无色。滤液加水稀释至1000mI．，加1mL～3mL 甲苯，置2℃～4℃冰箱中保存一年。 注：每次蒸发时不可蒸干或焦糊，以避免所含营养素破坏。 B．1．36腺嘌呤一鸟嘌呤尿嘧啶溶液。分别称取硫酸腺嘌呤(B．1．14)、盐酸鸟嘌呤(B．1．15)以及尿嘧 啶(B．1．16)各0．1g于250mL烧杯中，加75mI。水和2mL盐酸(B．1．5)，加热使其完全溶解后冷却。 若有沉淀产生，再加盐酸数滴，加热，如此反复直至冷却后无沉淀产生为止，加水至100rnI．。加3滴～ 5滴甲苯，贮存于棕色试剂瓶中，置2℃～4℃于冰箱中可保存一年。 B．1．37黄嘌呤(C。HtN。0。)溶液：称取0．4g黄嘌呤(B．1．17)，加10ml，氨水(B．1．18)，加热溶解，加 水至100mL。加3滴～5滴甲苯，贮存于棕色试剂瓶中，2℃～4℃冰箱保存一年。 B．1．38乙酸缓冲液(1．6mol／I．，pH4．5)：称取63g三水合乙酸钠(B．1．19)，用200mI。水溶解，加大 约20mI。冰乙酸(B．1．11)，调节pH至4．5，混合后，用水稀释至500mI。。 B．1．39维生素液：称取100mg核黄素(B．1_20)用400mI．乙酸缓冲液(B．1．38)溶解。取25nag碳 酸氯钠(B．1．3)溶解于500mL水中，加入2mg生物素(B．1．21)、200mg对氨基苯甲酸(B．1．22)、 400mg盐酸吡哆醇(B．1．23)、40mg盐酸硫胺素(B．1．24)、80mg泛酸钙(B．1．25)、80mg尼克酸 (B．1．26)溶解。将上述溶液混合，加水至1000mI。。加入3滴～5滴甲苯，贮存于棕色试剂瓶中，2℃～ 4℃冰箱保存一年。 B．1．40聚山梨酯80(吐温一80)溶液：将10g聚山梨酯一80(B．】．27)溶于无水乙醇(B．1．1)中并稀释至 100mL，2℃～4℃冰箱保存。 B．1．41还原型谷胱甘肽(c，。H-，N。0。s)溶液：称取0．1g还原型谷胱甘肽(B．1．28)，加100mL水溶 解，贮于棕色瓶中，2℃～4℃冰箱保存。 B．1．42甲盐溶液：按4．33配制。 B．1．43乙盐溶液：按4．34配制。 B．2基础培养液 配制250mL基础培养液，按表B．1吸取液体试剂，混合后加水l50mI．，依次加人固体试剂，煮沸 搅拌2rain。以溴麝香草酚蓝为外指示剂，用1tool／L氢氧化钠溶液调节基础培养液pH值，直至指示 剂变为草绿色(pH6．8)；如果指示剂变蓝说明加入的氢氧化钠溶液过量，以1tool／I。盐酸溶液回调pH 值至6．8。加入乙盐溶液5mL，用磷酸缓冲液(4．23)补至250mI．。2℃～4℃冰箱内可保存7d。配 制时可根据基础培养液用量按比例增减。 8 表B．1 叶酸测定用基础培养液配制一览表 GB／T5009．211—2008 试 剂 用 量 试 剂 用 量 酪蛋白液 50mI。 L一天冬氨酸 0．15g 腺嘌呤鸟嘌呤尿嘧啶溶液 5 0mI。 L-盐酸半胱氨酸 0．10g固 体 液 黄嘌呤溶液 1．25／33L I，色氨酸 0．10g试 体 维生素液I 2．5mI。 剂 无水葡萄糖 10g 试 剂 聚山梨酯一80溶液 0．25mI。 三水合乙酸钠 10g 甲盐溶液 5 0mL 还原型谷胱甘肽溶液 卜25mI。 9