5.3《血红蛋白的提取和分离》

nullnull 本课学习目标 本课题学习目标 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。 1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。 2.主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理 ②电泳法分离样品的原理 ③缓冲溶液的组成和作用机理 3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点：①样品的预处理 ②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。 null 2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成，这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息 蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究null2.提问：血液有哪些成分？ 1.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白null每个肽链环绕一个亚铁血红素基团， 此基团可携带一分子氧或一分子二 氧化碳，血红蛋白因含有血红素而 呈红色。血红蛋白的特点：null1.分离生物大分子的基本思路： 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。 一、血红蛋白的提取和分离3.高温灭菌和酒精灭菌的结果： 使微生物的蛋白质发生变性、蛋白质的空间结构被破坏。null（一） 凝胶色谱法（分配色谱法）2.凝胶： 大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或 琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大 小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行 分离。1.概念：3.凝胶色谱法的原理—分子筛效应： ①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。 null4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程null凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 null （二）缓冲溶液 1.概念: 在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强 酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混 合溶液。 能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响， 维持PH基本不变。2.作用:3.缓冲溶液的配制: 通常由1－2 种缓冲剂溶解于水 中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。 4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________ , 其目的是: 利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科 学研究(活性)磷酸缓冲液null 缓冲溶液的组成及分类①弱酸及其对应的盐：②弱碱及其对应的盐：③多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐:H2CO3→NaHCO3 ；CH3COOH→CH3COONaNH3•H2O→NH4CL ; NH4OH→NH4CLNaHCO3→Na2CO3 ；NaH2PO4→Na2HPO4 缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成。其中，能对抗外来强碱的称为共轭酸；能对抗外来 强酸的称为共轭碱。这一共轭酸碱通常称为缓冲对、缓冲剂或缓冲系。常见的缓冲对主要有如下 三种类型：null （三） 电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。null 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图null 聚丙稀酰胺凝胶电泳 1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。null 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决 于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 （SDS的作用）为了消除净电荷对迁移率的影响， 可以在凝胶中加入SDS。 2.原理： 聚丙稀酰胺凝胶电泳 SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。3. SDS作用机理:null用SDS测定蛋白质分子量的方法 使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。null 二、实验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定1.样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。(1)红细胞的洗涤:①洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化，洗涤次数不可过少。②洗涤操作： 1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。采集得到鸡血采集得到鸡血柜式离心机柜式离心机初次离心后的结果初次离心后的结果3次洗涤后的结果3次洗涤后的结果null(2)血红蛋白的释放： 加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液： ①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 二、实验操作磁力搅拌器磁力搅拌器搅拌器转子搅拌器转子搅拌器正在工作搅拌器正在工作null甲苯层（无色透明）白色薄层固体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次null(4)透析： ①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。 二、实验操作null透析过程动画演示利用透析袋透析利用透析袋透析null2.凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱的制作： ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。null （2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 ②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 ③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 装配好的凝胶柱装配好的凝胶柱null ④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 （2）凝胶色谱柱的装填50cm高null（3）样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 ③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） ⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。null（3）样品加入与洗脱注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。开始进行层析开始进行层析收集得到的纯化后的蛋白收集得到的纯化后的蛋白null思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？ 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？ 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？ 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。null（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳2.试剂的配制：鉴定血红蛋白纯度。1.目的： ①丙烯酰胺和N, N-甲叉双丙烯酰胺: 用去离子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液。②十二烷基硫酸钠（SDS）: 用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。③用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液。④TEMED ：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。⑤用去离子水配制10% 过硫酸铵：作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。⑥Tris—甘氨酸电泳缓冲液：25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%的SDS。⑦样品处理液：  50 mmol/L Tris—HCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。⑧染色液：  0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。⑨脱色液：10%的甲醇和10%的冰醋酸。null 1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。 2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。 3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。注意事项：（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳null ① SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备：用去离子水4.6 mL，30%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris缓冲液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的过硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高2—3 mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。②分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。③配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris缓冲液0.5 mL，10%的SDS0.041 mL，10%的过硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板（2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备：3、电泳方法步骤null（3）样品处理：在电泳样品中按1∶1体积比加入样品处理液，在100 ℃温度下加热3 min，以使蛋白质变性。（4）浓缩胶聚合完全后（30 min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris—甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。（5）加样：按顺序加样，加样量通常为10—25 μL。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品（6）电泳：将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm处，关闭电源。（7）剥胶：从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。（8）染色：将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1-2 h。（9）脱色：染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色3-10 h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。（10）观察结果：SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。3、电泳方法步骤null 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 null 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？三、实验结果分析与评价本课题作业;1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的? 2.什么是缓冲溶液?它的作用是什么? 3.电泳的作用及其原理是什么? 4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗? 5.与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?这一特点对你进行 蛋白质的分离有什么意义?