枸杞多糖对_葡萄糖苷酶的抑制作用

© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 献[12 ]报道的一致 ,故鉴定化合物 6 为齐墩果酸 (oleanolic acid) 。 参考文献 : [1 ] 　中国科学院植物志编辑委员会. 中国植物志[M] . 第 52 卷 (2) . 北京 :科学出版社 ,1982. 130. [2 ] 　王友绍 ,何磊. 药用红树植物的化学成分及其药理研究进展 [J ] . 中国海洋药物 ,2004 ,2 :26 - 311 [3 ] 　赵亚 ,郭跃伟. 真红树林植物化学成分及生物活性研究概况 [J ] . 中国天然药物 ,2004 ,2 (3) :135 - 1411 [ 4 ] 　 Ghosh S ,Majumdar ,Gouri Patra. Chemical investigation of some man2 grove species[J ] . J India Chem Soc ,1976 ,11 :1241 - 12421 [5 ] 　李宝才 ,董玉莲. 秋茄叶中芦丁的分离与鉴定[J ] . 热带海洋学 报 ,2002 ,22 (1) :62 - 691 [ 6 ] 　 Nonaka Gen - Ichiro ,Itsuo Nishioka. Tannins and related compounds. XXXI. isolation and characterization of proanthocyanidins in Kandelia candel (L. ) Druce[J ] . 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METHODS 　Lyci2 um barbarum polysaccharides(LBP) were extracted by drying , circumfluence degrease ,distillation with distilled water ,ethanol deposition and chromatography of diethylaminoethanol (DEAE) ion - exchange cellulose.LBP effects onα- glucosidase activity under different conditions were studied. RESULTS 　Inhibition ratio ofα- glucosidase was 52 % and 88 % at a dose of 0. 4 mg LBP and 2 mg LBP ,respectively. CONCLU2 SION　LBP is a strongerα- glucosidase inhibitor. Its inhibitive mechanism is noncompetition inhibition. Key words : Lycium barbarum polysaccharides ;α- glucosidase ; Inhibition ;Noncompetition inhibition CLC number :R285 Document code :A Article ID :1006 - 0103 (2006) 02 - 0131 - 03 　　α- 葡萄糖苷酶 (α- glucosidase , E. 3. 1. 2. 20) 能 催化α- 1 ,4 - 糖苷键水解 ,是小肠内水解麦芽糖、 葡萄糖等寡糖的酶[1 ] 。人体对淀粉 ,糊精 ,蔗糖等碳 水化合物的利用、吸收依赖于小肠刷状缘上的酶[2 ] 。 α - 葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制小肠刷状缘上α- 葡萄糖苷酶的活性 ,使葡萄糖的生成及吸收减缓 ,降 低餐后高血糖 ,调整血糖水平 ,从而减少高血糖对胰 腺的刺激 ,提高胰岛素的敏感性 ,保护胰腺功能 ,有 效地预防并改善糖尿病并发症的发生和发展 ;此外 , 还具有抗 HIV、抗病毒感染的作用[3～7 ] 。 我们在筛选具有α- 葡萄糖苷酶抑制作用的中 药时 ,发现枸杞对α- 葡萄糖苷酶具有较强的抑制 华西药学杂志 W C J ·P S 　2006 ,21 (2) :131～133 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 活性 ,并从中提取了枸杞的有效成分枸杞 　粮。结 果发现 ,具有较强的抑酶活性 ,且抑制机制为非竞争 型抑制作用。 1 　实验部分 1. 1 　药品、试剂与仪器 枸杞 Lycium barbarum (市售) ;4 硝基苯 -α- 吡 喃葡萄糖苷 (PNPG, E. Merck 公司) ;α- 葡萄糖苷酶 (α - glucosidase , EC3. 2 1. 20 ,美国 Sigma 公司) ;谷 胱甘肽 (中国科学院上海化学研究所) ;氯仿、甲醇、 95 %的乙醇、无水乙醇、丙酮 ,所有溶剂、化学试剂均 为纯。721 型分光光度计 (上海第三分析仪器 厂) ;pH计 (海雷磁创益仪器仪有限公司) ;分析天 平 (上海精科天平厂) ; DEAE纤维素柱 (上海亚荣生 化仪器厂) 。 1. 2 　方法与结果 1. 2. 1 　溶液的配制　用蒸馏水配制 67 mmol·L - 1的 KH2PO4 缓冲液 ,用 1 mol·L - 1的 NaOH 调 pH6. 8 ;用 蒸馏水配制 3 mmol·L - 1谷胱甘肽溶液 ;用 67 mmol· L - 1磷酸钾缓冲液配制 0. 04 mg·ml - 1α- 葡萄糖苷 酶溶液 ;底物溶液为 0. 01 mol·L - 1 PNPG,反应终止 液为 0. 1 mol·L - 1Na2CO3 溶液。 1. 2. 2 　α- 葡萄糖苷酶活性的测定　酶活力单位的 定义 :在 37 ℃、pH6. 8 条件下 ,1 min 内水解 PNPG释 放 1μmol 对硝基酚 (PNP) 所需的酶量[8 ] 。抑制剂活 力单位的定义 :在相同条件下 ,降低 1 个酶活力单位 所需的抑制剂量。 根据文献[8 ] 的方法并加以改进。取 6 ml 67 mmol·L - 1磷酸钾缓冲液 (pH 6. 8) ,0120、0140 mg· ml - 1 3 mmol·L - 1谷胱甘肽溶液 ,0. 3 mlα- 葡萄糖苷 酶溶液。37 ℃保温 10 min 后 ,加入 0. 5 ml 0. 01 mol· L - 1 PNPG溶液 ,反应 20 min ,用 10 ml 0. 1 mol·L - 1 Na2CO3 溶液终止反应 ,于 400 nm 处测定在酶作用下 所释放硝基酚的量。 抑制百分比 = 抑制剂活力/ 酶活力 ×100 % 1. 2. 3 　中药的筛选 　称取各种中药 200 g ,按照传 统方法煎煮 ,煎煮 2 次 ,每次 1 h。合并 2 次煎煮液 , 加入 95 %乙醇 ,使醇含量达 70 % ,静置过夜。取上 清液 ,活性炭脱色 ,浓缩 ,干燥。用生理盐水将中药 提取物配成 25 mg·ml - 1的溶液 ,各取 200μl ,测定其 对α- 葡萄糖苷酶的抑制活力。 1. 2. 4 　枸杞多糖 (LBP) 的提取 　称取 150 g 枸杞 子 ,60 ℃烘干 ,置干燥器中 18 h。粉碎 ,称取 100 g 干 燥枸杞粉 ,以 300 ml 氯仿 - 甲醇 (2∶1) 索氏 60 ℃回 流脱脂 2 次 ,每次 2 h。残渣风干后 ,再用 300 ml 80 %乙醇回流 (2 h ×2) 。残渣加适量水 90 ℃提取 (1 h ×3) 。离心 (5 ×103 r·min - 1) 10 min ,合并上清液 , 浓缩至 200 ml。在磁力搅拌下 ,将浓缩液滴入 5 倍 体积的 95 %乙醇中 ,静置 12 h。抽滤 ,固形物分别 用 95 %乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤 ,真空干燥后再上 DEAE纤维素柱。先用蒸馏水洗脱 ,再用 0. 05 mol· L - 1 NaCl 洗脱 ,用自动收集器收集 ,每管 9 ml ,控制 流速 1. 5 ml·min - 1。用硫酸 - 苯酚法显色后检测酶 的活性 ,合并高峰部分 ,浓缩、透析、冷冻干燥得抑制 剂枸杞多糖。 1. 2. 5 　LBP 的量对α- 葡萄糖苷酶活性的影响 　 分别取抑制剂LBP 0. 4、0. 8、1. 2、1. 6、2. 0 mg (即取 20 mg·ml - 1的 LBP 溶液 20、40、60、80、100μl) ,加入 酶活力测定系统中 (系统缓冲液用量相应减少) ,与 酶保温 10 min , Na2CO3 溶液终止反应 , 测定 400 nm 处的吸光度。 1. 2. 6 　反应时间对α- 葡萄糖苷酶活性的影响　在 试管中加入 1. 6 mg 的LBP(即取 20 mg·ml - 1的LBP 溶 液 80μl) ,分别于 37 ℃保温 0、0. 5、110、210、510、1010 min ,测定其对α- 葡萄糖苷酶的抑制活力。 1. 2. 7 　抑制作用类型的确定　在抑制剂量一定的条 件下 ,分别加入浓度为 0. 115、0. 232、0. 309、0. 387、 0. 464 mmol·L - 1的底物溶液 ,测其酶活力。改变抑制 剂的浓度 ,分别取 0、1. 6、2. 0 mg·ml - 1的 LBP ,测定酶 活力 ,用双倒数作图法确定抑制作用的类型。 1. 3 　结果 1. 3. 1 　单味中药的筛选 　中药提取物对α- 葡萄 糖苷酶的抑制作用见表1 。由表1可知 ,在同样浓 表 1 　中药提取物对α- 葡萄糖苷酶活性的抑制率 Table 1 　Inhibition ratio forα- glucosidase of extracts of Chinese tra2 ditional medicine Drugs in Chinese Drugs in English Inhibition / % 地骨皮 Cortex lycii 87. 7 甘草 Radix Glycyrrhizae uralensis 81. 1 天花粉 Radix Trichosanthis 14. 2 枸杞 Lycium barbarum L. 93. 6 黄芪 Radix Astragali mongholici 53. 2 山药 Rhizoma Dioscoreae oppositae 15. 1 玄参 Radix Scrophalariae 76. 3 三七 Radix Notoginseng 45. 6 山茱萸 Fructus Corni 92. 6 麦冬 Radix Ophiopogonis japonici 14. 5 五倍子 Galla Chinensis 94. 2 草豆蔻 Semen Alpiniae katsumadai 86. 8 南沙参 Radix Adenophorae 87. 5 丹参 Radix Salviae miltiorrhizae 57. 3 山楂 Fructus Crataegi 71. 8 丁香 Flos Caryophylli 80. 8 贯叶连翘 Herba Hyperici perforati Cum Radice 85 ,6 钩藤 Ramulus Uncariae cum uncis 80. 6 五味子 Fructus Schisandrae 87. 6 赤芍 Radix Paeoniae rubra 86. 2 鸡血藤 Caulis Spatholobi 87. 9 231　　　 华 西 药 学 杂 志 第 21 卷 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 度 (25 mg·ml - 1) 、同样体积 (200μl) 条件下 ,61. 9 % 的中药抑制率在 80 %以上 ,其中五倍子、枸杞、山茱 萸抑酶活性高达 90 %。而部分中药如天花粉、山药 等的提取物活性较弱 ,酶活性抑制率不到 16 %。我 们筛选出枸杞作为研究对象 ,研究其有效成分枸杞 多糖在不同条件下对α- 葡萄糖苷酶抑制作用的影 响和抑制机理。 1. 3. 2 　DEAE纤维素柱层析洗脱枸杞多糖　LBP 用 0. 05 mol·L - 1 NaCl 洗脱得单一洗脱峰 (图 1) ,用自 动收集器收集 (每管 9 ml)洗脱液。先用硫酸 - 苯酚 法显色 ,而后检测α- 葡萄糖苷酶的活性 ,洗脱曲线 和酶活检测结果见图 1。 1 . 3 . 3 　抑制剂LBP的量对酶活性的影响 　图2A 图 1 　LBP的 DEAE纤维素柱层析的洗脱曲线 Fig 1 　Chromatography of LBP on DEAE ion - exchange cellulose 显示 ,对α- 葡萄糖苷酶抑制程度随抑制剂 LBP 用 量的增加而显著增加 ,当 LBP 的量达 0. 4 mg 时 ,抑 制程度达 52 % ;当LBP 2. 0 mg 时 ,抑制率高达 88 %。 说明LBP 对α- 葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用。 1. 3. 4 　反应时间对抑制作用的影响　从图 2B 可以 图 2 　LBP的量对酶活性的影响( A) 、LBP的反应时间对α- 葡萄糖苷酶的抑制作用( B)和LBP对α- 葡萄糖苷酶抑制程度的双倒数动力学曲线( C) Fig 2 　Inhibition effects of different amount( A) and reaction time( B) of LBP on theα- glcosidase and their Linewaver - Burk plot( C) 看出 ,LBP 对酶的抑制作用非常迅速 ,1. 6 mg 的抑制 剂在 0. 5 min 内对酶的抑制率几乎达到 60 % ;10 min 时 ,抑制率几乎达到 90 % ,表明 LBP 作用时间短 ,抑 酶效果好 (图 2B) 。 1. 3. 5 　抑制作用类型的确定 　以 1/ [ S]为横坐标 , 1/ V 为纵坐标作双倒数曲线 (图 2C) 。图 2 显示 :抑 制剂LBP 对α- 葡萄糖苷酶的抑制程度随抑制剂浓 度的增加而成正比关系 ,最大反应速度 Vmax随抑制 剂浓度的增加而变小 ,米氏常数 Km 保持不变。根 据其动力学特点 ,确定抑制剂 LBP 对α- 葡萄糖苷 酶的抑制作用属非竞争性抑制作用。根据非竞争性 抑制动力学方程 : 1V = Km Vmax 1 + [ I]Ki 1 [ S] + 1 Vmax 1 + [ I]Ki ,求得 Km = 4. 02 ×10 - 3 mol·L - 1。 2 　讨论 我们对 21 种常用中药的提取物进行了筛选。 由于枸杞对α- 葡萄糖苷酶活性具有较强的抑制作 用 ,因此 ,我们选中枸杞作为研究对象。采用烘干、 回流脱脂、水提、乙醇沉淀和 DEAE 纤维素柱层析等 方法提取枸杞的有效成分枸杞多糖 ,并对其在不同 条件下对α- 葡萄糖苷酶抑制作用的性质进行了研 究。结果表明 :0. 4 mg 的枸杞多糖对α- 葡萄糖苷 酶的抑制程度达 52 % ;当枸杞多糖 2 mg 时 ,抑制率 高达 88 % 。1. 6 mg 的枸杞多糖在 0. 5 min 内对酶的 抑制率几乎达 60 % ,10 min 则达 90 %。根据双倒数 动力学曲线 ,确定其抑制作用机制为非竞争性抑制 作用。此实验为我们进一步研究枸杞多糖的结构和 药理学动物实验打下了坚实的基础。 参考文献 : [1 ] 　 Alan D. 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