Lingo_1及其在脊髓损伤神经再生中作用的研究进展

中国脊柱脊髓杂志 2011 年第 21 卷第 1 期 Chinese Journal of Spine and Spinal Cord，2011，Vol.21，No.1 脊髓损伤 （spinal cord injury，SCI）可导致损伤部位 神经元死亡，轴突变性和脱髓鞘等，促进神经轴突再生，再 建损伤轴突与其支配靶器官联系， 引导脊髓功能恢复对 SCI 的治疗有着重要意义。 有报道证实在中枢神经再生发 育中其结构中富含亮氨酸重复单位 （leucine-rich repeat， LRR）的蛋白起着关键作用，使得该类蛋白成为研究神经 损伤后再生修复的目标之一 [1、2]。 Lingo-1 （leucine rich repeat and Ig domain containing 1） 结构中富含亮氨酸重 复单位，其在神经系统中的限制性表达、特异调节以及损 伤后的诱导性变化，均提示该分子对神经发育、轴突导向 以及髓鞘形成发挥重要作用。 现就 Lingo-1 及其在 SCI 后 神经再生中的作用作一综述。 1 Lingo-1 的结构与分布 Lingo-1 是由 15 号染色体编码含 614 个氨基酸残基 的蛋白质。 Lingo 蛋白家族成员还有 Lingo-2、Lingo-3 以及 Lingo-4。 Lingo-1 是主要的功能分子，其 N 端含有 12 个 LRR 基序，C 端有帽子结构域、Ig 区域、跨膜区以及一个短 的胞浆尾。 Lingo-1 进化上高度保守，人和小鼠的 Lingo-1 蛋白结构有 99.5%相同。Mosyak 等[3]通过人类 Lingo-1 配体结合外功能区的晶体结构，发现它是双模块、扭结结 构，由亮氨酸富集重复片段（LRR）和 Ig 样的分子组成（图 1）。 Mi等 [4]首先在脑内神经元上发现了 Lingo-1。 她应用 Northern blot 法检测人体主要组织器官， 发现 Lingo-1 只 在脑和脊髓中表达， 而在非神经组织中未检测到其表达； 在大鼠脑内，Lingo-1 在皮层表达水平最高，而脊髓中表达 水平最低。 大鼠脑内 Lingo-1 的表达在出生后 1d 表达水 平达到峰值，此后 4~8d 内逐渐减少。 在大鼠脑内，Lingo- 1 mRNA 在多巴胺能神经元、视网膜神经节以及小脑颗粒 神经元等许多类型的神经元上均有表达，并在少突胶质前 体细胞（oligodendrocyte progenitor cells，OPC）中高水平表 达，但在星形胶质细胞中未检测到其表达 [5~9]。 2 Lingo-1 的生物学作用 Lingo-1 是中枢神经系统特有的蛋白，只表达于脊髓、 脑神经元以及少突胶质细胞上。 研究者最初是通过分析 Lingo-1 与 Nogo-66 受体（NgR1）复合物的相互作用而揭 示其功能的[4、9]。有研究证实该信号转导复合体可与轴突生 长抑制因子（neurite outgrowth inhibitory A，NogoA）、髓磷 脂相关糖蛋白（myelin- associated glycoprotein，MAG）和少 突胶质细胞髓磷脂糖蛋白 （oligodendrocyte myelin glyco- protein，OMgp） 等髓磷脂抑制因子结合并激活 RhoA（Ras homolog gene family，member A），从而抑制神经轴突的生 长[10、11]。 NgR1 复合物最初被认为由 NgR1 和 p75 神经营养 因子受体（p75 neorutrophin recptor，p75NTR）两种成分组 成[12、13]，但当 p75 和 NgR1 在非洲绿猴肾成纤维细胞（COS- 7）上共表达时，OMGp 并不能激活小 G 蛋白 RhoA，提示在 Nogo-66 受体信号传导中还需要神经元上的另外一种重 要成分，研究发现这种成分就是 Lingo-1 分子[4]。Mi 等应用 ELISA和免疫共沉淀两种都证明 Lingo-1 能与 NgR1 和/或 p75 共同参与受体复合物的形成 [4]。 Lingo-1 能与其 共受体 p75 或孤儿受体 Troy 分别组成 NgR1/p75/ Lingo-1 或 NgR1/Troy/Lingo-1 信号转导复合体而调控神经轴突的 再生（图 2）[14]。 髓磷脂抑制因子与 NgR1 信号复合体结合 图 2 神经轴突生长的抑制通路 第一作者简介：男（1972-），讲师 ,在读博士，研究方向：干细胞移 植与中枢神经损伤再生 电话：（076）922896328 E-mail：E-mail：hongfuw@126.com 通讯作者：邓宇斌 综述 Lingo-1及其在脊髓损伤神经再生中作用的研究进展 吴洪福 1、2，侯景义 1，邓宇斌 1 （1 中山大学中山医学院病理生理学教研室 510089 广州市；2 广东医学院生理教研室 523808 东莞市） doi：10.3969/j.issn.1004-406X.2011.01.17 中图分类号：R683.2，Q71 文献标识码：A 文章编号：1004-406X（2011）-01-0067-04 图 1 Lingo-1 蛋白的结构域 67 中国脊柱脊髓杂志 2011 年第 21 卷第 1 期 Chinese Journal of Spine and Spinal Cord，2011，Vol.21，No.1 后，可将抑制信号导入神经元胞内，激活小 G 蛋白 RhoA， 使其从无活性的 GDP 抑制形式转变为活化的 GTP 结合 RhoA，后者是一种重要的胞内调节蛋白，可产生一系列反 应，最终抑制神经轴突生长。 Lingo-1 是 NgR1 信号复合体 发挥作用的重要功能组分，其胞质区第 591 位氨基酸残基 的磷酸化是 NgR1 信号复合体发挥活性的必要基础。 因 此，Lingo-1 分子是 NgR1 信号复合体的必要成分并参与 神经轴突再生负调节，其在髓磷脂抑制因子阻滞轴突再生 的信号通路中起着重要作用。 除了神经元，Lingo-1 同样表达在少突胶质细胞系的 细胞上。利用四种方法可抑制 OPC 上内源性 Lingo-1 的功 能 ：Lingo-1 RNAi、 显性负突变 Lingo-1、Lingo-Fc 或者 Lingo-1 敲除均可引起少突胶质细胞形态学变化， 即有更 多高度分化的成熟的特点，如延伸长度增加以及多层的髓 鞘结构，这些变化常伴有细胞成熟的生化标记，如少突细 胞分化标志物髓磷脂碱性蛋白 （myelin basic protein， MBP）的表达增强，以及参与少突胶质细胞分化的信号通 路 Fyn 磷酸化增加等，但全长 Lingo-1（FL-Lingo-1）过表 达则具有相反的效应 [8、15、16]。 Lingo-1 基因敲除动物的少突 胶质细胞培养时与其野生型相比其少突胶质细胞分化更 迅速，而且其髓鞘形成要更早于后者 [15]。 这些发现提示阻 断内源性 Lingo-1 能逆转 Lingo-1 分子的抑制作用， 从而 促进少突胶质细胞分化。 Lingo-1 拮抗剂对少突胶质细胞的效应提示它们可 能有助于中枢神经系统髓鞘形成， 这首先在少突胶质细 胞/神经元的共培养中得到验证。 Lee 等 [8]将大鼠的原代少 突胶质细胞与背根神经节 （dorsal root ganglion，DRG）神 经元共培养，培养基中含 50ng/ml 神经生长因子（NGF），可 观察到有极少的髓鞘形成，与此相对，在含有 NGF 的培养 基中加入 Lingo-1-Fc 或 DN-Lingo-1 或抗 Lingo-1 抗体， 则髓鞘形成水平呈剂量依赖性显著增加，并与髓鞘蛋白的 主要成分 MAG 和 MBP 表达增加相关联。 其他的髓鞘成 分，如髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）、OMGp 以及环核苷酸-3' 磷酸水解酶 随 Lingo-1 拮抗同样表达水平上调。用 FL-Lingo-1 处理则 降低髓鞘形成过程中表达 MBP 的细胞 [15]。 这些研究进一 步表明内源性 Lingo-1 抑制髓鞘形成， 而拮抗 Lingo-1 则 可逆转这种抑制。 另外研究者还观察到 Lingo-1 敲除小鼠 与其野生型同窝出生者相比其中枢神经组织的有髓轴突 纤维数目增加[17]。 相反，Lingo-1 的过表达则延缓转基因小 鼠髓鞘的形成 [8]。 但在 Lingo-1 基因敲除小鼠中并未检测 到其对周围神经系统髓鞘形成的影响。 以上结果均提示 Lingo-1 可能对中枢神经系统少突胶质细胞分化和髓鞘形 成具有负性调节作用。 3 Lingo-1 对 SCI 后神经再生的作用 研究发现，SCI 后髓鞘和胶质瘢痕释放的髓磷脂抑制 因子是抑制神经再生的主要因子 [18~20]。 目前发现的髓磷脂 相关抑制因子主要包括 MAG、OMgp 以及 Nogo-66 等。 这 些因子通过抑制轴突再生和生长，使得轴突再生或芽生的 距离有限，难以穿越损伤部位与残存或未受损的神经形成 功能性突触，造成 SCI 后的神经再生修复障碍。 Mi 等 [4]发 现大鼠 SCI 14d 后 Lingo-1 mRNA 的表达增加约 5 倍，此 外在 SCI 后大鼠的脊髓轴索以及多发性硬化 （multiple sclerosis，MS）的白质病变中 Lingo-1 表达上调。 Lingo-1 分 子在髓磷脂抑制因子阻滞轴突再生的信号通路中起着重 要作用，因此，Lingo-1 的发现为改善 SCI 后的局部抑制环 境， 促进轴突再生提供了新的途径， 即通过抑制 Lingo-1 表达，阻滞 NgR1/p75/ Lingo-1 及其下游信号的传导而促 进轴突生长。 为了更好地研究 Lingo-1 在体内的生理作 用，具有拮抗 Lingo-1 功能的试剂相继被开发出来。Lingo- 1－Fc 是人 Lingo-1 的 N 端与 IgG 的融合蛋白，在体外实验 中它能抑制内源性 Lingo-1 功能并促进轴突生长 [4]。Mi 等[4] 研究发现，在体外进行少突胶质细胞和神经元共培养时加 入可溶性 Lingo-1-Fc 使 Lingo-1 功能失活后，可促进培养 环境中的轴突生长、髓鞘形成，而 Lingo-1 过表达则抑制 少突胶质细胞分化和髓鞘形成。 Ji 等[21]利用脊髓背根半横 断损伤大鼠模型对 Lingo-1－Fc 促进轴突再生的能力进行 了检测，在对大鼠进行脊髓背外侧半横断后持续鞘内输注 可溶性 Lingo-1－Fc 4 周后，60％的受处理动物 BBB 评分 均在 14 以上， 为确定 Lingo-1-Fc 处理是否促进轴突再 生， 他还在损伤动物模型的感觉-运动皮层注射生物素葡 聚糖胺（biotin dextran amine，BDA）示踪皮质脊髓束轴突， 以标记再生的轴突， 结果发现经 Lingo-1-Fc 处理的大鼠 与对照组相比有更多的 BDA 标记的轴突， 用 Lingo-1-Fc 处理的 SCI 大鼠其轴突退缩现象减少大约 62%，并且这种 现象与 RhoA 的激活减少直接相关。说明用 Lingo-1-Fc 处 理能改善 SCI 模型后肢功能，与之直接相关的是增进轴突 再生，减少轴突退缩，减少 RhoA 激活。 Lv 等[22]用高滴度兔 源性 Lingo-1 抗血清鞘内注射治疗 SCI 动物模型，他们发 现利用 Lingo-1 抗血清被动免疫能显著降低 RhoA 的活 性，并能促进成年大鼠后肢运动功能一定程度的恢复。 吕 俊等 [23]在大鼠 SCI 局部给予 Lingo-1 多克隆抗体治疗，大 鼠半横断损伤后立刻通过微量渗透泵局部给予 Lingo-1 多克隆抗体，而对照组仅给予兔源性 IgG，Lingo-1 多克隆 抗体组大鼠术后 3d 和 28d 均可检测出兔源性抗体； 术后 3d 对照组 Lingo-1 染色强度明显强于 Lingo-1 多克隆抗 体处理组。 提示局部给予的 Lingo-1 多克隆抗体在较宽的 时间窗里均可进入 SCI 区并特异性识别 Lingo-1 分子。 这 在一定程度证明被动免疫治疗 SCI 是可行的。 拮抗 Lingo-1 对神经元的促进存活效应首先是在与 帕金森氏病 （parkinson′sdisease，PD） 有关的中脑多巴胺 （dopamine，DA） 神经元中发现的。 在体外利用显性失活 DN-Lingo-1、 可溶性 Lingo-1 或 Lingo-1 抗体等阻断 Lingo-1 功能可增加 DA 神经元轴突长度 ， 并可使其在 MPP+神经毒性的环境中继续存活。 用 6-羟基多巴胺（6- 68 中国脊柱脊髓杂志 2011 年第 21 卷第 1 期 Chinese Journal of Spine and Spinal Cord，2011，Vol.21，No.1 hydroxydopamine，6-OHDA） 诱导细胞变性的动物模型体 内同样可观察到拮抗 Lingo-1 对 DA 神经元存活和轴突生 长的促进作用。 Inoue 等 [24]发现在 6-OHDA 诱导的动物模 型敲除 Lingo-1 基因后可观察到 DA 神经元存活增多以及 运动不对称现象减少等。 Fu 等[25]报道阻断 Lingo-1 功能促 进眼高压后大鼠慢性青光眼模型受损视网膜神经节细胞 存活。 Zhao 等[26]发现在体外利用 Lingo-1-Fc 阻断 Lingo-1 同样能促进小脑神经节存活。 在 SCI 研究中，Ji 等 [21]利用脊髓背根半横断损伤大鼠 模型就 Lingo-1－Fc 对损伤部位神经元的效应进行了检 测，发现 Lingo-1-Fc 处理的脊髓损伤大鼠与对照组相比， 在其脊髓损伤部位明显观察到更多的存活神经元和少突 胶质细胞，提示利用 Lingo-1-Fc 拮抗 Lingo-1 分子能增加 与损伤部位相邻的神经元和少突胶质细胞的存活。Lv 等[22] 的研究也证实用高滴度兔源性 Lingo-1 抗血清鞘内注射 治疗脊髓损伤动物模型，能增加动物脊髓损伤区附近神经 元的存活。 这些证据表明拮抗 Lingo-1 有利于 SCI 后损伤 局部神经元的存活。 Lingo-1 影响中枢神经元存活的机制得到阐释。 在帕 金森病 （Parkinson′s disease，PD） 动物模型中 ， 观察到 Lingo-1 的上调与表皮生长因子受体 （epidermal growth factor receptor，EGFR )蛋白水平的降低相关联 [24]。 用表皮 生长因子 （epidermal growth factor，EGF） 处理能保护 PD 动物模型的多巴胺能（Dopaminergic，DA）神经元，而 EGFR 的细胞内信号传导受 PI3-K 通路的调节 [24、27、28]，后者能增 加 Akt 的磷酸化和激活[24]。 已有报道生长因子激活的磷脂 酰肌醇-3 激酶(PI3-K)/Akt 信号传导通路能增加神经元的 存活和轴突再生。 与 Lingo-1 和 EGFR 信号传导之间的功 能联系相一致的是， 阻断 Lingo-1 功能可增加 DA 神经元 上 EGFR 和 p-Akt 的水平，这也与它保护 DA 神经元免遭 损伤诱导的细胞损害的作用相一致 [24]。 在青光眼动物模 型，Lingo-1 的抑制可导致视网膜神经节细胞继续生存以 及 Akt 磷酸化水平的上调 [25]。 其他有关 Lingo-1 影响神经 元存活的机制包括 Lingo-1 抑制与 p75NTR[29]或 RhoA[30]相 关的细胞死亡途径的能力。 但目前在脊髓损伤中 Lingo-1 影响神经元存活的机制尚不清楚，还有待深入研究。 4 展望 SCI 后神经的再生和修复涉及多种机制。目前主要是 应用神经营养因子和生长因子如脑源性神经营养因子 （brain-derived neurotrophin factor，BDNF）、NGF、睫状神经 营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）、血小板衍生 生长因子（platelet- derived growth factor，PDGF）、胶质细 胞源性神经营养因子 （glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）等促进神经再生修复，但其效果不甚理想 [31]。 鉴定与神经再生抑制相关的因子并阻断它们的功能以促 进脊髓神经再生是一种极具潜力的新策略。 其中 Lingo-1 是一个特别引人注目的目标，因为它对轴突再生、神经元 再生以及少突胶质细胞分化和髓鞘再生都能进行有效的 负调控。 鉴于 SCI 的特殊性， 如何实现在体内有效拮抗 Lingo-1 从而促进神经再生亟待研究。 目前较常应用的 Lingo-1-Fc 拮抗 Lingo-1 分子的处理仍然存在需微泵持 续注射，损伤大，且抗体大分子不易渗透进入组织进而影 响其对目标细胞的作用等问，而利用组织工程生物支架 如水凝胶等输送抗体或能导致 Lingo-1 基因沉默的小分 子药物可能是未来拮抗 Lingo-1 促进脊髓神经再生的更 可行方法。 对 Lingo-1 的拮抗及其相关机制的深入研究有 可能为 SCI 的修复和治疗提供新的途径。 5 参考文献 1. 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