发酵法对降低食品过敏原的作用

453 伍 恒，钱 和，汪何雅，孙秀兰，姚卫蓉* (江南大学食品学院，江苏无锡 214122) 摘 要:食物过敏已经成为了一个同时挑战消费者和食品加工厂的公共卫生问题。随着生物技术与工程食品的快速 发展，如何脱除食物中的过敏原，制造低致敏性食品已经成为食品科技工作者的研究课题。发酵法能够降低食品中的 过敏原，但是，目前发酵法在食物脱敏上的应用还不够广泛。通过查阅文献资料，了前人的一些实验成果，从大 豆、牛乳等几个方面予以阐述。通过选用合适的菌株对这些食品进行发酵，可以降低其致敏性，但是并不能完全脱除 致敏性。选择合适的菌株种类，调整其配比，在最适菌株生长的条件下进行发酵才能够将食品的致敏性降至最低。 关键词:过敏原，传统发酵食品，发酵法，益生菌 A summary on removing the allergen from food by fermentation WU Heng，QIAN He，WANG He－ya，SUN Xiu－ lan，YAO Wei－rong* (School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China) Abstract:Food allergenicity has been a challenge for both consumer and food factory. How to produce the hypoallergenic food has become a research topic for food science workers as the fast development of biotechnology and food engineering. Although the allergenicity of food could be reduced by fermentation，its application is not enough.The previous results of some studies were summarized and devided into several aspects like soybean products，milk products and so on.Although the allergenicity of food can not be totally removed by fermentation，it was possible to minimize the allergenicity under the optimal culture condition by using suitable strain. Key words:allergen;traditional fermented food;fermentation;probiotics 中图分类号:TS201.2 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2011)08－0453－05 收稿日期:2010－08－19 * 通讯联系人 作者简介:伍恒(1988－) ，女，硕士研究生，研究方向:食品安全与质量 控制研究。 食物致敏原是指食物中能使敏感个体产生免疫 反应或过敏反应的蛋白质。目前大约有 160 多种食 品含有可以导致过敏的致敏原，主要包括八大类:蛋 品、牛奶、花生、黄豆、小麦、坚果、鱼类和甲壳类食 品。牛奶中的主要过敏原为酪蛋白、α－乳清蛋白和 β－乳球蛋白，大豆中为 7S 及 11S 种子储蓄球蛋白、 Bet v 1 同源蛋白等，花生中为 7S 及 11S 种子储蓄球 蛋白和 2S 清蛋白，谷类中为种子储蓄醇溶谷蛋白、 α－淀粉酶 /胰蛋白酶抑制剂和糖基化过氧化物酶［1］。 食物过敏通常发展为系列反应，严重的甚至导致死 亡。世界上一些先进国家试着研究、开发各种低过 敏或抗过敏食品，并取得了较大进展［2］。至于国内有 关这方面内容的报道，还有待予以重视。目前应用 较多的食物脱敏方法为酶解法和物理化学方法等， 对于发酵法的应用还存在很大的缺口。常用的益生 菌菌种有双歧杆菌、乳酸杆菌和一些链球菌。通过 用益生菌对这些食物进行发酵，不仅能够改善质地、 风味、营养价值，增加稳定性，而且还能够降低过敏 原的过敏性，使更多的人能够从中获益。 1 发酵大豆制品 大豆具有优越的营养特性、加工特性以及经济 性，一直作为制造加工食品如豆腐、豆乳、味精、酱油 等的原料。大豆蛋白质作为主要的蛋白质供给源之 一具有很高的营养价值。但是有一部分人却对大豆 的某些成分过敏，使他们不能利用这种优质蛋白质。 外国的一些学者对发酵法能否除去大豆中的过敏原 进行了一些研究。 Phromraksa和 Nagano等从一些泰国传统发酵食 品(发酵大豆种子，发酵豆酱等)中发现了 9 种细菌。 同时运用表型和基因型鉴定来进行这项研究。实验 发现所有的细菌分离物都为革兰氏阳性菌。其中 7 种分离物被两种方法同时鉴定为枯草芽孢杆菌，剩 下的两种分离物被表型鉴定法鉴定为地衣芽孢杆 菌，被基因型鉴定法鉴定为枯草芽孢杆菌。由枯草 杆菌 DB和 SR产生的浓缩的酶类可以通过水解醇溶 蛋白片段从而减少麦醇溶蛋白的变应原性。不仅如 此，由枯草杆菌 DB 产出的酶类还能通过在 Gln35－ Ser36位置上水解 β－乳球蛋白的主要抗原决定簇来降 低β－乳球蛋白的变应原性［3］。 Frias和 Young Soo Song 等发现用米曲霉、米根 霉和枯草芽孢杆菌对敲碎的大豆种子进行固态发 酵，同时用只在种子里存在的微生物或者是接种胚 芽乳杆菌对碾米大豆进行液态发酵。实验结果显示 454 经胚芽乳杆菌发酵的豆粕免疫球蛋白 E 的变应原性 降低的最多(在 96%～99%之间) ，这取决于所用血浆 的敏感性。在进行固体发酵的产品中，用米曲霉和 根曲霉进行发酵的产品其变应原性降低的最少(分 别为 66%和 68%，人血浆抗体为 97.5KUA /L) ，用枯 草芽孢杆菌接种的样品其变应原性分别减少了 81% ～86%［4］。 肌动蛋白也是大豆中的一种过敏原。纳豆，酱 油和酸豆乳都是由全豆发酵制成的大豆产品。 Plaimein A和 Elvira Gonzalez de Mejia 的实验结果显 示经纳豆芽孢杆菌发酵后，与大豆粉相比:纳豆中肌 动蛋白含量减少了 12.8%～35.4%;酱油中肌动蛋白 含量减少了 12.8%～46.3%;由于水解，酸豆乳显示出 较低的肌动蛋白浓度，其减少达到显著水平(p ＜ 0.05)。对大豆粉进行固态和液态发酵，其降低百分 比并没有统计学上的差异，分别为 21.3%～41.7%和 27.7%～46.4%。对脱脂大豆粉和大豆粉分别进行自 然液态发酵和用植物乳杆菌液态发酵。结果显示， 这两种液态发酵对大豆肌动蛋白的降低并没有显著 性差异，其降低程度都在 55.8%～57.9%范围内变动。 这些发酵大豆产品与经双歧杆菌、植物乳杆菌和酿 酒酵母共同进行液态发酵的豆粕粉相比，其肌动蛋 白降低的较少，后者肌动蛋白降低的程度在 68.3%～ 71.4%范围内变动。这可能是由于双歧杆菌、植物乳 杆菌和酿酒酵母这些菌株具有比自然发酵中的微生 物更高的蛋白水解活动［5］。 大豆蛋白 glycinin 和 β－ conglycinin 已经被证实 能够引起仔猪的过敏性。在 Song 和 Pérez 等进行的 实验中运用的两种大豆来源是 SBM(Glycinemax.， Merril)和 FSBM(PepSoyGen，SAIInt.Co，Geneva，IL) ， FSBM是由一些菌群的混合物进行固态发酵得到的。 除此之外，还有 6 种大豆加工来源用来和 SBM 和 FSBM中大豆蛋白的免疫原性做比较，包括两种商用 低致敏性大豆产品和四种实验生产的发酵大豆 (FSB)。商用低致敏性大豆产品是由阿彻丹尼尔米 德兰公司提供的饲料级低致敏性 Soycomilp 大豆蛋 白浓缩物和 Ardex AF 大豆分离蛋白。四种 FSB 在 发酵过程中运用了不同的微生物进行发酵，分别为: 酿酒酵母、植物乳杆菌、双歧杆菌和自然发酵。用 FSBM饲喂仔猪，能够减少仔猪血浆对 β－conglycinin 的 α、α’单元和大豆球蛋白的酸性亚基免疫反应性。 与以上的结论相一致，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰 胺凝胶电泳对发酵过程中进行分析，也观察到了具 有抗原性的大分子蛋白质的部分消化。而对 ELISA 值的线性回归分析却发现随着膳食中 FSBM的增加， 仔猪血浆的免疫反应性并没有显著的变化。用 FSBM发酵得到的大豆粉的蛋白质水解的程度没有 一些低过敏性产品如 ArdexA 和 Soycomil－ P 降低的 多。除此之外，FSBM比其他的 FSB具有更多的能够 引起免疫反应的蛋白质［6］。 以上这些实验结果说明:a.大豆产品通过发酵可 以降低其变应原性，并且利用不同的菌种进行发酵， 其大豆蛋白中过敏原降解的程度不同，例如:在进行 固态发酵的产品中，用枯草芽孢杆菌比用米曲霉、米 根霉对产品进行发酵变应原性降低的多;用双歧杆 菌、植物乳杆菌和酿酒酵母共同对大豆粉进行液态 发酵比自然液态发酵和用植物乳杆菌进行液态发酵 其大豆粉中肌动蛋白降低的更多。b.固态发酵和液 态发酵对大豆过敏原降低的程度有区别，因此可以 通过提高发酵条件来更好地减少大豆蛋白的免疫反 应性，生产安全性更高的大豆产品。 2 发酵牛乳制品 牛乳蛋白营养丰富，可作为母乳替代品，但某些 婴儿食用婴儿配方乳粉会引起牛乳蛋白过敏。大量 的流行病学研究发现，牛乳蛋白过敏(Cow Milk Protein Allergy，CMPA)是新生儿和婴儿中最普遍的 一类过敏，在西方国家发病率约为 1.5%～7%。牛乳 蛋白引起的过敏可造成过敏性鼻炎、哮喘、湿疹、特 异性皮炎、腹泻、胃肠出血等疾病。导致儿童生长发 育缓慢并影响消化吸收，甚至威胁生命。近年来的 研究表明，食用发酵食品，尤其是以牛乳为基料的乳 制品可减轻一些遗传性过敏的症状并限制病症的发 展。因此将益生菌应用于牛乳蛋白中，开发新的功 能水解物是减缓过敏的有效技术［7］。 Ehn和 Allmere 等用 ELISA 抑制方法测试了发 酵和蛋白质水解对全奶中 β－乳球蛋白与 IgE结合能 力的影响。实验对来自九位牛奶过敏患者的血浆进 行了测试。大体上，用乳酸菌对牛奶进行发酵时，即 使 β－乳球蛋白浓度逐渐降低，但对与 IgE 的结合能 力却影响不大。但是，实验发现，用胰蛋白酶进行蛋 白质水解却可以大幅度降低 β－乳球蛋白的浓度以 及与 IgE的结合能力［8］。 Maier和 Okun等用毛细管区带电泳和酶联免疫 吸附测定法对发酵过程中抗原降解情况进行测定。 和预期的一样，不管是生的还是经消毒的牛奶，从其 中分离出的 β－乳球蛋白都表现出了极小的可消化 性(在 2h内消化了不到 20%)。但是，当将生的或经 消毒的牛奶发酵后，其蛋白质在胃中的消化率显著 升高(2h内消化了 45%)。与消化率的变化相一致， 所有经发酵的样品的免疫化学反应都比未经发酵的 样品低。并且，工业化生产的酸奶和益生菌乳与在 实验室里自然发酵的牛奶相比，其免疫反应性具有 更显著的降低。前者其 β － 乳球蛋白降低到 55～56μg /g样品，而后者其 β－乳球蛋白单位仍保持 在 mg /g样品的范围内［9］。 Kleber和 Weyrich 等用鸡卵黄中的多克隆抗体 对牛乳中的 β－乳球蛋白进行间接竞争性酶联免疫 吸附测定，通过其抗体反应性来衡量 β－乳球蛋白的 浓度。实验结果证明，用乳酸菌发酵牛奶能够降低 其免疫反应性。除此之外，当嗜热链球菌嗜热亚种 与乳酸菌以 1∶1 的比例混合时，对抗原性的降低起到 了协同作用。在一些乳酸菌的作用下，脱脂牛乳最 初的 β－乳球蛋白抗原性降低了 90%，甜乳清抗原性 降低超过 70%，但是，这种方法却不能彻底消除其抗 原性［10］。 Linda Monaci 和 Virginie Tregoat 等发现在体外 实验中，发酵确实能够有效地降低丙氨酸和β－LG的 455 抗原性。但是，在对过敏患者进行体内实验时发现， 相关蛋白的抗原性仍然存在或者是只降低了一点。 只有在运用乳酸菌比如干酪乳杆菌进行发酵时才有 意义。干酪乳杆菌是一种益生菌并且具有降低蛋白 变应原性的潜在优势［11］。 Irena Tzvetkova 和 Svetla Danova 等在酪蛋白酸 钠、β－酪蛋白或者是乳清蛋白培养基上培养从巴尔 干自制酸奶分离出的 21 种乳酸菌菌株。经过 72～96h的培养，80%～90%的 β－酪蛋白被消耗掉了。 它们也显示出了对 α－乳清蛋白的水解活性，可以将 α－乳清蛋白的浓度降低 5%～55%，所用菌株不同，降 低的幅度也不同。菌株降解 β－乳球蛋白的能力低 于降解 α－乳清蛋白。在发酵的过程中，牛奶蛋白被 发酵产物乳酸酸化了，由细菌产生的蛋白酶和肽酶 也对其进行了分解。伴随蛋白质水解而来的是抗原 决定簇数量的减少，最后导致水解蛋白变应原性的 减弱［12］。 郭鸽和任大喜等选用实验室收藏的四株乳杆 菌，分别编号为 KLDS3.315、KLDS5.516、KLDS4.342 和 KLDS2.227。对其进行分离、纯化、筛选。淘汰了 KLDS4.342 和 KLDS2.227。KLDS3.315 在添加了乳 清蛋白的脱脂乳中生长良好，蛋白水解力强，降低残 余抗原含量多;而 KLDS5.516 在酪蛋白优化的培养 基中降低残余抗原含量大。这说明两株菌带有对酪 蛋白和乳清蛋白特异性水解的酶类。经菌种的 16S rDNA基因序列及聚类分析判定 KLDS3.315 为瑞士 乳杆菌 L.helveticu［7］。 一种名为 SlaB 的发酵剂是由嗜热链球菌 CRL804、德氏乳杆菌保加利亚亚种 CRL656 和嗜酸 乳杆菌 CRL636 在每毫升食品中的群落总数以 1∶1.5∶6.4的比例构成。所有这些乳酸菌菌株在经过 12h的培养之后都能够水解 41%～85%的 β－乳球蛋 白，同时释放出亲水肽类;SlaB 可以在 12h 的培养后 水解 92%的 β－乳球蛋白，并在 15～20min 时洗脱出 亲水肽和 3 种缩氨酸。实验结果显示在这项实验中 运用的乳酸菌菌株在含 35%蛋白质的乳清蛋白浓缩 物中经过 12h的培养后可以生长地很好。以前的实 验证实，如果运用重组乳清进行培养，在经过 24h 的 培养后乳酸菌才能够生长和降解乳清蛋白。这项实 验结果说明，与运用重组蛋白培养相比，运用含 35% 蛋白质的乳清蛋白浓缩物对乳酸菌进行培养，可以 提高菌株细胞的生长速度和菌株的解蛋白活性［13］。 这些国内外的研究结果说明:a.用乳酸菌对奶制 品进行发酵，普遍能够降低其抗原性，但不能消除其 抗原性;b.在体外实验中，进行发酵确实能够有效地 降低丙氨酸和 β－LG 的抗原性。但是在对过敏患者 进行体内实验时发现，相关蛋白的抗原性仍然存在 或者是只降低了一点。c.所用菌株不同，使抗原性降 低的程度也不同。同时，选用不同的菌株对牛乳进 行发酵可能具有协同作用。例如:当嗜热链球菌嗜 热亚种与乳酸菌以 1∶1 的比例混合时，对抗原性的降 低起到了协同作用;当嗜热链球菌 CRL804、德氏乳 杆菌保加利亚亚种 CRL656 和嗜酸乳杆菌 CRL636 在每毫升食品中的群落总数以 1∶1.5∶6.4 的比例构成 时，对降解 β－乳球蛋白能够起到协同作用。d.同一 种菌株可能对不同的蛋白降解能力不同。例如:在 酪蛋白和乳清蛋白中，瑞士乳杆菌能够更好地利用 后者。e.发酵的条件不同，其产物抗原性降低的程度 也不同。例如:工业化生产的酸奶和益生菌酸乳与 在实验室里自然发酵的牛奶相比，其免疫反应性具 有更显著地降低。因此，可以通过研究适合的发酵 条件来生产更加安全的奶制品。 3 发酵小麦制品 小麦过敏多属于迟发性过敏反应，有较高的病 患率和漏诊率，并发症状比较多，严重影响了过敏患 者的生活，它已经是食品工业和食品安全领域的一 个重要挑战。国外对小麦过敏开展了大量研究，但 研究尚不全面，目前研究处于平台期，还有待进一步 探索。比较突出的问题是:很难确定小麦中的主要 过敏原以及引起过敏反应的最低激发量。我国对小 麦过敏的研究几乎为空白，根本谈不上对小麦过敏 的系统研究。因此，在我国开展小麦过敏的研究具 有重要的理论价值和实际意义［14］。 目前，对乳糜泻唯一有效的治疗方法是终生不 接触含麦胶的食物。Rizzello 和 De Angelis等通过运 用一种发酵乳酸菌和真菌蛋白酶的混合物经过长时 间发酵来减少小麦面粉的毒性。R5 抗体为基础的 夹心分析和竞争性酶联免疫吸附测定的结果显示， 发酵过的面筋经胃蛋白酶，胰蛋白酶消化后面筋中 剩余麦胶的浓度为 12ppm。白蛋白、球蛋白、麦醇溶 蛋白已经被完全水解，但是，仍有大约 20%的麦谷蛋 白存在。运用 SCX－LC /CapLC－ESI－Q－TOF 质谱分 析和 R5 抗体为基础的免疫印迹法检测不到低分子 质量的抗原决定簇。所有的肠道 T 细胞系都没有对 胃蛋白酶、胰蛋白酶消化产生免疫反应性［15］。 Leszczynska和 Diowksz等讨论了同型、异型乳酸 发酵细菌与酵母混合培养发酵对降低小麦面粉抗原 性的作用。运用间接非竞争酶联免疫吸附测定法来 检测麦醇溶蛋白免疫反应性降低的多少。实验发现 当运用乳酸菌与酵母混合培养发酵时麦醇溶蛋白的 免疫反应性降低的最多［16］。 Hyo－ Hyung Lee 和 Jin － Hyeong Lee 等研究了 nuruk 对降低小麦中抗原蛋白质的作用。在发酵过 程中，水分含量从 24.2%降低到了 13.6%。粗脂肪和 蛋白质含量在发酵过程中逐渐增加。经过 15d 的发 酵，还原糖和总糖含量达到最大值，分别为 27.45%和 39.00%，但是却没有检测到碱性蛋白酶活性。发酵 过程中 α－淀粉酶的活性逐渐增加，并在 15d 后达到 最大值将近 2833U /g，糖化酶活性在发酵 10d 后达到 最大值将近 497.9U /g。用聚丙烯酰胺凝胶电泳验证 发酵过程中从 nuruk 中分离出的蛋白质组分的降解 程度。这些用 nuruk 发酵的结果为研发更安全的小 麦产品来阻止过敏地发生提供了有效的工具［17］。 这些实验结果说明:a.在发酵的过程中，小麦面 粉中各种成分的含量发生了很大的变化，例如还原 糖、蛋白质含量等，这可能为抗原性的变化提供了潜 在条件。b.经过发酵，小麦面粉中的一些致敏蛋白质 456 被水解，抗原性降低，但是发酵并不能彻底消除其抗 原性。c.在发酵的过程中，一些菌类会产生多种多样 的酶类，这些酶类能够分解小麦中的某些成分。可 能对抗原性的降低起到了一定作用。d.用不同的菌 类对小麦进行发酵会有不同的效果，并且，当将不同 的菌类进行混合培养时可能会对抗原性的降低起到 协同作用。 4 发酵花生制品 花生蛋白质是一种资源广泛，价格低廉，营养全 面的植物蛋白质，其组成特殊，90% 是阴离子球蛋 白，10%是水溶性蛋白，在自然状态，其功能特性局 限在一定范围内，目前被作为一种极具开发潜力的 乳糖不耐症消费者的蛋白基料和牛乳等动物奶类替 代品。但是由于花生过敏反应的严重性、长期性以 及不断增加的发病率而降低了花生蛋白的利用 价值［18］。 Ara hl及 Ara h2 是花生的主要致敏原。美国北 卡罗莱纳农工州立大学研究显示，一种特殊的发酵 方法能够降低花生食品中的致敏性蛋白质的水平， 此种方法可以使花生中名为 Ara hl及 Ara h2 的主要 致敏性蛋白质降低达 70%，但对产品的质量并没有 产生严重影响［19］。 5 韩国传统发酵食品 根据韩国的一项研究，“Saeujeot(一种经过盐腌 和发酵的虾)是传统的韩国发酵食品。尽管虾经常 会引起敏感个体的严重过敏反应，但却很少有人来 研究虾的变应原性。”Seong Mi Kim 和 Jin Gyu Park 等用间接竞争 ELISA 法对发酵过程中 saeujeot 变应 原性的变化进行监测。分别在三种不同的温度(25、 15、5℃)和三种不同的盐浓度(10%、15%、25%)下 进行发酵。结果发现，当在较高的温度、较低的盐度 下进行发酵时，单克隆抗体与 saeujeot 中变应原的结 合能力降低的最多;在 25℃、10%的盐度下发酵 5d 后，单克隆抗体与 saeujeot中变应原结合的能力降低 到 5%［20］。 6 结论与展望 上面列举了一些国内外近期运用发酵法降低食 品过敏原的研究成果，并对这些成果进行了总结，提 出自己的看法。从这些研究成果来看，虽然目前在 去除食品过敏原这一方面，发酵法的应用不如辐照、 酶解、加热等方法应用的广泛，国内外，特别是国内 关于这方面的研究还不够深入。但现有的一些研究 成果已经证实，运用发酵法脱除食品中的过敏原具 有光明的前景。通过调整发酵条件和选择合适的菌 株等方法可以很大幅度地降低食品的致敏性，生产 出安全、营养、保健的发酵食品。 参考文献 ［1］ IFTS.The Institute of Food Science ＆ Technology information statement:Food Allergy［R］.London:IFTS，2005(1) :4－7. ［2］唐传核，彭志英 .低过敏以及抗过敏食品研究进展［J］.食 品与发酵工业，2000，26(4) :44－49. ［3］Phromraksa P，Nagano H，Boonmars T，et al.Identification of proteolytic bacteria from thai traditional fermented foods and their 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The research progress on strain selection，optimization of medium and process conditions，extraction，measurement and function of lovastatin were reviewed. Key words:Monascus rubber;Aspergillus terreus;lovastatin;monacolin K 中图分类号:TS201.2 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2011)08－0457－04 檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾 ［19］ Beyer K，Morrow E，Li Xiumin，et al. 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