SNT 2657-2010 国境口岸组织胞浆菌检验方法

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛犖／犜２６５７—２０１０ 国境口岸组织胞浆菌检验 犈狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀犳狅狉犎犻狊狋狅狆犾犪狊犿犪犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋 ２０１０１１０１发布 ２０１１０５０１实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 前　　言 　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广西出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：吴文旺、谭勇、胡慧宁、陆建新、潘光合、方晋。 Ⅰ 犛犖／犜２６５７—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 国境口岸组织胞浆菌检验方法 １　范围 本标准规定了国境口岸组织胞浆菌的检验对象、方法、结果报告及阳性结果的处置。 本标准适用于国境口岸组织胞浆菌的实验室检验。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求 Ｄｏｃ９２８４ＡＮ／９０５　危险物品安全航空运输技术细则（２００７年～２００８年） ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 ３．１ 组织胞浆菌　犎犻狊狋狅狆犾犪狊犿犪 组织胞浆菌属真菌界半知菌亚门丝孢菌纲丝孢菌目从梗孢科，为双相型真菌，在２５℃条件下培 养为霉菌相，在３５℃培养及组织内为酵母相。对人类具有病原性的有荚膜组织胞浆菌和组织胞浆菌杜 波变种。 ３．２ 组织胞浆菌病　犺犻狊狋狅狆犾犪狊犿狅狊犻狊 组织胞浆菌引起的感染性真菌病。通常经呼吸道传染，侵犯肺部引起急慢性肺部损害，临床主要表 现为发热、咳嗽、咯血、胸痛、呼吸困难、盗汗、消瘦，严重者可引起全身播散，主要累及单核巨噬细胞系 统，如肝、脾、骨髓、淋巴结等；也可侵犯肾上腺、皮肤、胃肠道等。该病遍及全球，主要流行于温带地区。 ４　对象 ４．１　来自流行区的出入境人员。 ４．２　国境口岸可疑组织胞浆菌病病人。 ４．３　申请检验的其他人员。 ５　准备 ５．１　器材与试剂 实验室检验常用器材参见附录Ａ，培养基和试剂参见附录Ｂ。 ５．２　实验室生物安全 实验室生物安全符合ＧＢ１９４８９的规定。大量活菌操作，在生物安全三级（ＢＳＬ３）实验室进行；动 １ 犛犖／犜２６５７—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 物感染实验，在动物生物安全三级（ＡＢＳＬ３）实验室进行。标本检测，包括样本的病原菌分离纯化、药物 敏感性试验、生化鉴定、免疫学实验、涂片、显微观察等初步检测活动，在生物安全二级（ＢＳＬ２）实验室 进行。标本或活菌培养物运输应符合国际民用航空组织Ｄｏｃ９２８４ＡＮ／９０５中Ａ类传染性物质的要求。 ６　标本采集和处理 ６．１　血液标本 静脉采血１５ｍＬ，其中１０ｍＬ置含适量肝素抗凝剂的无菌管中，用离心力１５００犵～２０００犵离心 １５ｍｉｎ，取中间层进行真菌培养和涂片检查；另５ｍＬ分离血清进行血清学检查。 ６．２　骨髓标本 采集０．５ｍＬ～２ｍＬ抽吸标本置含肝素的灭菌容器中待检。 ６．３　下呼吸道标本 推荐每天一次连续三次痰标本送检和培养，或者收集支气管肺泡灌洗液检查。 ６．４　肝、脾、淋巴结穿刺液 进行直接涂片和培养。 ６．５　皮肤及粘膜损害渗出物 进行直接涂片和培养。 ６．６　组织标本 取肝、脾组织制成涂片或进行组织病理检查。 ６．７　标识 所采集的标本应进行标识，标识应具有唯一性。 ７　实验室检验 ７．１　检验程序 检验程序参见附录Ｃ。 ７．２　病原学检验 直接涂片检查、分离培养、生化反应、动物接种方法参见附录Ｄ。 ７．３　血清学检验 双向免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）参见附录Ｅ。 ８　结果报告 ８．１　直接涂片检查阳性，报告“涂片检查找到真菌孢子”，并注明细胞内或细胞外；直接涂片检查阴性， ２ 犛犖／犜２６５７—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 报告“涂片检查未找到真菌孢子”。 ８．２　分离培养阳性，且尿素酶试验阳性，明胶液化试验阴性，报告“检出荚膜组织胞浆菌”。 ８．３　分离培养阳性，且尿素酶试验阴性，明胶液化试验阳性，报告“检出组织胞浆菌杜波变种”。 ８．４　分离培养阴性，报告“培养八周末见菌落生长”。 ８．５　双向免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验阳性，报告“组织胞浆菌抗体呈阳性反应”，并注明检验方 法；反之报告阴性，也注明检验方法。 ９　阳性结果的处置 对分离培养出的组织胞浆菌菌株应送上一级实验室做复检或鉴定。阳性结果应按规定向上级主管 部门报告。 ３ 犛犖／犜２６５７—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犃 （资料性附录） 实验室检验常用器材 犃．１　病原学检验常用器材 犃．１．１　霉菌培养箱（２５℃和３５℃）。 犃．１．２　显微镜。 犃．１．３　高压灭菌器。 犃．１．４　普通冰箱。 犃．１．５　离心机。 犃．１．６　生物安全柜。 犃．１．７　水浴锅。 犃．１．８　玻璃器皿、解剖用具、接种工具。 犃．１．９　动物饲养器具等。 犃．２　血清学检验常用器材 犃．２．１　酶联免疫测定仪。 犃．２．２　洗板机。 犃．２．３　电热恒温箱。 犃．２．４　普通冰箱。 犃．２．５　普通离心机。 犃．２．６　９６孔聚乙烯反应板。 犃．２．７　微量加样器。 犃．２．８　振荡器。 犃．２．９　玻片、打孔器。 ４ 犛犖／犜２６５７—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犅 （资料性附录） 常用培养基及试剂 犅．１　病原学检验常用培养基及试剂 犅．１．１　沙氏琼脂培养基（犛犇犃） 犅．１．１．１　组成 葡萄糖　　　　　　　　４０．０ｇ 蛋白胨　　　　　　　　１０．０ｇ 琼脂　　　　　　　　　１５．０ｇ 蒸馏水　　　　　　　　１０００ｍＬ 犅．１．１．２　制法 上述混合后１２１℃１０ｍｉｎ灭菌，冷却至５０℃左右加入庆大霉素５０ｍｇ、放线菌酮２００ｍｇ，混匀， 分装试管（１８ｍｍ×１８０ｍｍ）每管加培养基７ｍＬ，置斜面，冷后备用。 犅．１．２　脑心浸汁培养基（犅犎犾） 犅．１．２．１　组成 脑心浸膏　　　　　　　　３５．０ｇ 琼脂　　　　　　　　　　１５．０ｇ 蒸馏水　　　　　　　　　１０００ｍＬ 犅．１．２．２　制法 上述混合后，１２１℃１０ｍｉｎ灭菌后冷却至５０℃左右，分装试管（１８ｍｍ×１８０ｍｍ）每管加培养基 ７ｍＬ，置斜面，冷后备用。不加琼脂为液体培养基。 犅．１．３　尿素琼脂 犅．１．３．１　组成 葡萄糖　　　　　　　　４０．０ｇ 琼脂　　　　　　　　　２０．０ｇ 蛋白胨　　　　　　　　１．０ｇ 氯化钠　　　　　　　　１５．０ｇ 磷酸二氢钾　　　　　　４２．０ｇ 酚红　　　　　　　　　０．０１２ｇ ２０％尿素（后加） 蒸馏水　　　　　　　　１０００ｍＬ 犅．１．３．２　制法 各成分混合均匀后调ｐＨ至６．８，加入琼脂２０．０ｇ，１２１℃１０ｍｉｎ灭菌，冷却至４５℃～５０℃时，每 ５ 犛犖／犜２６５７—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ４５０ｍＬ培养基中加入抽滤灭菌的２０％尿素５０ｍＬ，均匀后分装试管（１２ｍｍ×１００ｍｍ）每管３ｍＬ置 斜面，冷后备用。 犅．１．４　明胶培养基 犅．１．４．１　组成 明胶　　　　　　　　　　１２．０ｇ 肉浸液　　　　　　　　　１００ｍＬ 犅．１．４．２　制法 １００ｍＬ肉浸液中加入明胶１２．０ｇ，隔水加热溶解，矫正ｐＨ至７．２，趁热以绒布过滤。分装小试管 （１２ｍｍ×１００ｍｍ）每管３ｍＬ，１２１℃１５ｍｉｎ灭菌后置斜面，冷后备用。 犅．１．５　瑞氏染液 犅．１．５．１　组成 缓冲液：磷酸钾　　　　　　　　１．６３ｇ 磷酸氢二钠　　　　　　３．２０ｇ 蒸馏水　　　　　　　　１０００ｍＬ ｐＨ７．０ 染液：瑞氏染色粉　　　　　　　０．３ｇ 中性甘油　　　　　　　　３．０ｍＬ 甲醇　　　　　　　　　　９７．０ｍＬ 犅．１．５．２　制法 在研钵中研磨粉，加甘油，再研磨，加甲醇，充分混合，倒密闭瓶中，用前过滤。 犅．１．６　吉姆萨染液 犅．１．６．１　组成 缓冲液：磷酸钾　　　　　　　　２．５９ｇ 磷酸氢二钠　　　　　　６．７ｇ 蒸馏水　　　　　　　　１０００ｍＬ ｐＨ７．０ 染液：吉姆萨粉　　　　　　　　０．６ｇ 中性甘油　　　　　　　　５０ｍＬ 甲醇　　　　　　　　　　５０ｍＬ 犅．１．６．２　制法 在研钵中研磨粉，加甘油，再研磨，加甲醇，充分混合，倒密闭瓶中。 犅．１．６．３　最终染液 缓冲液６ｍＬ加染液２ｍＬ充分混匀。 ６ 犛犖／犜２６５７—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 犅．２　血清学检验常用试剂 犅．２．１　双向免疫扩散试验试剂 犅．２．１．１　狆犎８．６，０．１犿狅犾／犔巴比妥巴比妥钠缓冲液 巴比妥　　　　　　　　１．８４ｇ 巴比妥钠　　　　　　　１０．３ｇ 硫柳汞　　　　　　　　１００ｍｇ 蒸馏水　　　　　　　　至５００ｍＬ，加热溶解。 犅．２．１．２　２１０犵／犔琼脂 称取琼脂糖１０ｇ置１０００ｍＬ三角烧瓶中，加蒸水５００ｍＬ，水浴煮沸溶解后调整ｐＨ８．６，０．１ｍｏｌ／Ｌ巴 比妥巴比妥钠缓冲液５００ｍＬ，加０．１ｇ叠氮钠防腐，混匀后分装置４℃冰箱保存备用。 犅．２．１．３　组织胞浆菌诊断抗原液 由有资质的机构提供，选择适宜的稀释度。 犅．２．２　酶联免疫吸附试验（犈犔犐犛犃）试剂 犅．２．２．１　包被稀释液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ碳酸钠碳酸氢钠缓冲液，ｐＨ９．６）： 碳酸钠　　　　　　　　１．５ｇ 碳酸氢钠　　　　　　　２．９ｇ 叠氮钠　　　　　　　　０．２ｇ 双蒸水　　　　　　　　１０００ｍＬ，调ｐＨ９．６。 犅．２．２．２　封闭液（５％小牛血清／ＰＢＳ溶液）： 小牛血清　　　　　　　　５０ｍＬ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）　　　　　　９５０ｍＬ。 犅．２．２．３　洗涤液（ＰＢＳＴ，ｐＨ７．４）： 氯化钠　　　　　　　　　８．０ｇ 磷酸二氢钾　　　　　　　０．２ｇ 十二水磷酸氢二钠　　　　２．９ｇ 氯化钾　　　　　　　　　０．２ｇ 硫柳汞　　　　　　　　　０．１ｇ 吐温２０　　　　　　　　 ０．５ｍＬ 双蒸水　　　　　　　　 １０００ｍＬ，调ｐＨ７．４。 犅．２．２．４　样本稀释液（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）： 氯化钠　　　　　　　　　８．０ｇ 磷酸二氢钾　　　　　　　０．２ｇ 十二水磷酸氢二钠　　　　２．９ｇ 氯化钾　　　　　　　　　０．２ｇ 硫柳汞　　　　　　　　　０．１ｇ 双蒸水　　　　　　　　　１０００ｍＬ，调ｐＨ７．４。 犅．２．２．５　酶标记第二抗体、阴阳性对照血清：由有资质的机构提供。 ７ 犛犖／犜２６５７—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 犅．２．２．６　底物液（ＴＭＢ过氧化氢尿素溶液）： 底物液Ａ（３、３′、５、５′四甲基联苯胺，ＴＭＢ）： ＴＭＢ　　　　　　　　　２００ｍｇ 无水乙醇　　　　　　　１００ｍＬ 双蒸水　　　　　　　　至１０００ｍＬ。 底物液Ｂ缓冲液（０．１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠缓冲液，ｐＨ５．０～５．４）： 磷酸氢二钠　　　　　　　　　　　　１４．６０ｇ 柠檬酸　　　　　　　　　　　　　　９．３３ｇ ０．７５％过氧化氢尿素　　　　　　　　６．４ｍＬ 三蒸水　　　　　　　　　　　　　　１０００ｍＬ，调ｐＨ５．０～５．４ 将底物液Ａ和底物液Ｂ按１∶１混合即成ＴＭＢ过氧化氢尿素应用液。 犅．２．２．７　终止液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液）：双蒸水６００ｍＬ，浓硫酸１００ｍＬ（缓慢滴加并不断搅拌），加双蒸 水至９００ｍＬ。 ８ 犛犖／犜２６５７—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犆 （资料性附录） 组织胞浆菌检验程序 图犆．１　组织胞浆菌检验程序 ９ 犛犖／犜２６５７—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犇 （资料性附录） 病原学检查 犇．１　直接涂片检查 犇．１．１　瑞氏染色 犇．１．１．１　将涂片平放染色架上。 犇．１．１．２　加瑞氏染液数滴，以覆盖涂片为宜约１ｍｉｎ。 犇．１．１．３　滴加约等量的缓冲液与染液混合，室温下染色５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ。 犇．１．１．４　用流水冲去染液，干燥后油镜检查。 犇．１．２　吉姆萨染色 犇．１．２．１　把涂片浸入１００％甲醇３ｍｉｎ～５ｍｉｎ。 犇．１．２．２　用混合好的吉姆萨染液覆盖玻片，放置１５ｍｉｎ。 犇．１．２．３　用流水冲去染液，待干燥后油镜检查。 犇．１．３　结果 犇．１．３．１　油镜下检查，荚膜组织胞浆菌表现为２μｍ～４μｍ直径、大小一致的圆形或卵圆形、芽生、有 荚膜孢子，一端较尖，一端较圆，周围有一个似荚膜的亮圈，通常在大单核或多形核细胞内，有时在组织 细胞外，多聚集成群，应怀疑组织胞浆菌。 犇．１．３．２　组织胞浆菌杜波变种为１２μｍ～１５μｍ大小的、厚壁、圆形、芽生孢子，细胞内可见脂肪小滴， 少数可见基底出芽。 犇．１．３．３　找到符合以上形态特征的真菌孢子为直接涂片检查阳性；反之，为直接涂片检查阴性。 犇．２　分离培养 犇．２．１　总则 组织胞浆病的确定诊断需要依靠培养分离真菌。骨髓培养较敏感，血液应离心后取中间层作培养， 其他标本直接种沙氏琼脂培养基（ＳＤＡ）和脑心浸汁培养基（ＤＨＩ），分离出单菌落后接种生化培养基，有 条件应接种动物。 犇．２．２　接种沙氏琼脂培养基（犛犇犃）２５℃培养 菌落特征呈霉菌相生长。两种组织胞浆菌菌落形态相同，菌落生长慢，２周可形成直径３ｍｍ～ ４ｍｍ菌落，具浓密的气生菌丝，正面初为白色，逐渐转变成棕色，背面棕色。镜检见分枝、分隔、细长的 菌丝，有少量直径为２μｍ～４μｍ的圆形或梨形、壁光滑或有刺的小分生孢子，单个着生于两侧或短的 分生孢子梗上。４周左右可找到直径为８μｍ～１５μｍ大分生孢子，圆形或梨形，厚壁光滑或有棘突呈 齿轮状，着生于菌丝成直角的分生孢子梗顶端，这种齿轮状大分生孢子具有特征性。 犇．２．３　接种脑心浸汁培养基（犇犎犐）３７℃培养 菌落特征呈酵母相。约４周可见直径３ｍｍ～４ｍｍ的圆形、隆起、光滑、湿润、乳酪样酵母菌落。 ０１ 犛犖／犜２６５７—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 镜下荚膜组织胞浆菌的形态特征与直接涂片镜检相同；而组织胞浆菌杜波变种可见大酵母细胞。接种 液体培养基较固体培养基酵母相生长更好，涂片偶尔可见细小菌丝，其余均为酵母样孢子。 犇．２．４　结果判断 分离培养出双相型真菌，且符合Ｄ．２．２和Ｄ．２．３的菌落特征及镜下形态特征为阳性；培养８周无 菌落生长为阴性。 犇．３　生化反应 犇．３．１　尿素酶试验 接种尿素酶培养基２５℃培养４ｄ左右，荚膜组织胞浆菌可分解尿素；组织胞浆菌杜波变种不分 解尿素。 犇．３．２　明胶液化试验 接种明胶培养基２５℃培养７ｄ左右，荚膜组织胞浆菌不能液化明胶；组织胞浆菌杜波变种能液 化明胶。 犇．４　动物接种 推荐进行动物接种。豚鼠、大鼠、小鼠、田鼠、兔、猴都易感，但以小鼠和田鼠为佳。 标本或培养物以生理盐水制成菌悬液，腹腔注射５只小鼠，每只接种量为０．５ｍＬ，２周后处死１只 动物，以后每周处死１只，解剖取肝、脾组织直接涂片检查可发现并能重新培养分离出组织胞浆菌。 １１ 犛犖／犜２６５７—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犈 （资料性附录） 血清学试验 犈．１　双向免疫扩散试验 犈．１．１　实验步骤 犈．１．１．１　取１０ｇ／Ｌ琼脂糖，置５６℃水浴融解。 犈．１．１．２　将玻璃板（规格为７．５ｃｍ×２．５ｃｍ）放置水平台上，吸取已融化的１０ｇ／Ｌ琼脂糖５．６ｍＬ浇 注其上，凝固后即成３ｍｍ厚的琼脂板。 犈．１．１．３　选用两孔模式在琼脂板上成双打孔，孔直径３ｍｍ，孔间距１０ｍｍ。 犈．１．１．４　在一侧孔内加入组织胞浆菌诊断抗原液（适宜稀释度）约１０μＬ，在另一侧相对应的孔内加入 待测血清约１０μＬ。 犈．１．１．５　置３７℃湿盒内扩散反应２４ｈ。 犈．１．１．６　观察白色沉淀线。 犈．１．２　结果判断 待测血清与组织胞浆菌抗原之间出现２条沉淀线，外线为 Ｈ线（组织胞浆菌特异线），另一沉淀线 为 Ｍ线（真菌类沉淀线）为阳性，提示组织胞浆菌感染；无组织胞浆菌特异线为阴性。 犈．２　酶联免疫吸附试验（犈犔犐犛犃） 犈．２．１　实验步骤 犈．２．１．１　包被抗原：用包被稀释液适当稀释纯化的组织胞浆菌素（ＨＭＩＮ、ＰＨＭＩＮ，包被量每孔２０μｇ～ ２００μｇ），包被９６孔的聚乙烯板，每孔１００μＬ，４℃下过夜，洗涤液洗涤３次，２５０μＬ／孔，每次３ｍｉｎ，去除未 结合的抗原。 犈．２．１．２　封闭酶标反应板：将封闭液（５％小牛血清／ＰＢＳ溶液）加满各反应孔，４℃下过夜，洗涤液洗涤 ３次，２５０μＬ／孔，每次３ｍｉｎ。 犈．２．１．３　加待测血清、阴阳性对照血清，１００μＬ／孔，温育６０ｍｉｎ后，洗涤３次，２５０μＬ／孔，每次３ｍｉｎ， 去除未结合的待测抗体。 犈．２．１．４　加入酶标记抗体每孔１００μＬ，温育３０ｍｉｎ后，洗板３次，２５０μＬ／孔，每次３ｍｉｎ，去除未结合 的酶标抗体。 犈．２．１．５　加入酶底物应用液每孔１００μＬ，避光置湿盒３７℃温育３０ｍｉｎ。 犈．２．１．６　终止反应：每孔加２ｍｏｌ／Ｌ硫酸５０μＬ终止反应，１５ｍｉｎ后，用酶标检测仪波长４５０ｎｍ，测 定每孔ＯＤ值。 ２１ 犛犖／犜２６５７—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 犈．２．２　结果判断 用测定标本的ＯＤ值与阴性测定孔平均ＯＤ值的比值（Ｐ／Ｎ）表示，当Ｐ／Ｎ大于２．１为阳性，小于或 等于２．１为阴性。 ３１ 犛犖／犜２６５７—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 ０１０２— ７５６２ 犜／ 犖犛 中华人民共和国出入境检验检疫 行　业　标　准 国境口岸组织胞浆菌检验方法 ＳＮ／Ｔ２６５７—２０１０  中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街１６号 邮政编码：１０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本 ８８０×１２３０ １／１６　印张 １．２５　字数 ２３ 千字 ２０１１年４月第一版　２０１１年４月第一次印刷 印数１—１６００  书号：１５５０６６·２２１７８２　定价 ２１．００ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子发售