生物芯片进展

收稿: 2009 年 5月 * 国家自然科学基金项目(No. 20827001)资助 * * Corresponding author e2mail: sjxiao@nju. edu. cn 生物芯片进展* 肖守军* * 陈 凌 许 宁 (南京大学化学化工学院 配位化学国家重点实验室 南京微结构国家实验室 南京 210093) 摘 要 生物芯片是近 20年来生物技术领域发展迅速和获得重大突破的高新技术,本综述介绍了经典 的平铺生物芯片(DNA和蛋白质芯片)之后, 重点介绍了近十年来发展的新的生物芯片的概念和:质谱 为读出机制的表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(SELDI)芯片、高通量 DNA测序技术、基于胶体光子晶 体的微球高通量生物技术、三维阵列生物芯片技术和微流控等生物芯片技术。同时描述了各种生物芯 片技术的优点、应用范围和有待解决的问题, 最后展望了生物芯片技术的未来。 关键词 生物芯片 读出机制 蛋白质芯片 三维阵列芯片 微球高通量检测 高通量 DNA 测序 微流控生物芯片 中图分类号: O65; O629. 7 文献标识码: A 文章编号: 10052281X(2009) 1122397214 Biochip Development Xiao Shoujun* * Chen Ling Xu Ning ( School of Chemistry and Chemical Engineering, State Key Laboratory of Coordination Chemistry, Nanjing National Laboratory of Microstructures, NanjingUniversity, Nanjing 210093, China) Abstract Biochip is one of the breakthrough technologies developed in the recent twenty years. In this review we first introduce the planar DNA and protein microarrays, then focus on the newly developed high technologies of SELDI (surface enhanced laser desorptionPionization) biochip, high throughput DNA sequencing, high throughput photonic crystal micro2bead bio2coding, three dimensional gel2pad biochip, and microfluidic biochip. We describe the advantages of each type of biochips, limits of its applicat ions, and problems to be solved. The future of biochip technologies is prosperous. Key words biochip; read2out mechanism; protein microarray; three dimensional biochip; high throughput micro2 bead bio2coding; high throughput DNA sequencing; microfluidic biochip Contents 1 Introduction 2 DNA microarray 2. 1 Introduction to DNA microarray 2. 2 Preparation of DNA microarray 3 Protein microarray 3. 1 Introduction to protein microarray 3. 2 Preparation of protein microarray 4 Biochip read2out mechanism 4. 1 Fluorescence 4. 2 Mass spectroscopy 4. 3 Electrical read2out mechanism 5 SELDI mass protein biochip 6 High throughput DNA sequencing 7 High throughput photonic crystal micro2bead bio2 coding 8 Three dimensional biochip 第 21卷 第 11期 2009 年 11月 化 学 进 展 PROGRESS IN CHEMISTRY Vol. 21 No. 11 Nov. , 2009 8. 1 32D gel2pad microarray 8. 2 32D porous silicon biochip 9 Microfluidic biochip 10 Outlook 1 生物芯片简介 生物芯片是 20世纪 80年代末迅速发展起来的 一项高新生物技术,它的内涵是指通过机械手臂点 样技术或微电子光刻技术在平方厘米量级的固相载 体表面构建成千上万个不同探针分子微点阵的微型 生物化学系统, 以实现对细胞、核酸、蛋白质、糖 类及其他生物组分准确、快速和大信息量的检测。 出现之初, 它被认为是继大规模集成电路芯片之后 又一次具有深远意义的科学技术革命,被 Science 杂 志在 1998年和2008年两度评为年度十大科技突破 之一。美国著名的财经杂志 Fortune 在 1997年 3月 对其重大意义作了如下阐述: /微处理器在本世纪使 我们的经济结构发生了根本改变,给人类带来了巨 大的财富,改变了我们的生活方式。然而,生物芯片 给人类带来的影响可能会更大, 它可能从根本上改 变我们的医学行为和生活质量, 从而改变世界的面 貌0 [ 1]。 经过了十多年的发展, 人们已将生物芯片的定 义外延扩展到高通量筛选( high throughput screening, HTS)和测试的生物技术。以生物芯片为代表的高 通量测试技术包含以下特征:高通量、微型化和自动 化。详细来说, 它以固体微板或微珠作为探针分子 载体, 平行地在厘米尺度的芯片上构建成百到千上 万个的微阵列, 在分子和细胞水平上利用探针分子 与目标生物分子的相互作用来识别和捕获目标物, 它将生命科学中许多不连续的常量操作过程(如样 品制备、生化反应、富集和检测步骤)集成到芯片上 并使这些分散的过程连续化和微型化, 以实现对大 量生物样品和测试指标进行快速和并行处理的目 的。所有的微阵列样品点在同一时间用灵敏快速的 测试方法进行检测和采集数据, 整个实验过程主要 由自动化操作系统执行和完成, 并用计算机软件对 数据进行分析处理,最后与相应的数据库比对 得出结论, 生物芯片技术是以上所述的这样一个整 体技术体系。 生物芯片的商业模式一般有两种方式, 一种是 商业公司构建了标准的DNA或蛋白质(图1)的文库 芯片或根据顾客需求的文库芯片,这些探针文库分 子被固定在芯片表面, 芯片能被储藏和运输到客户 手里,客户在使用过程中,使芯片微点阵上的探针分 子与待测样品溶液里的目标分子相互作用或杂交, 目标分子本身带有标记信号或再用标记了信号的信 标分子与目标分子作用, 目标分子的信号被显示和 放大从而被读出, 达到可定性和定量地检测被捕获 的目标分子的目的, 从而用于基因组和蛋白组的分 析、疾病的诊断和药物的筛选等。另一种模式是商 户只是提供活化的载片表面如氨基载玻片等,客户 使用自动点样仪制备探针阵列芯片并进行检测, 这 种模式下,主要的工作由客户承担。 生物芯片最常用的分类方法有下面几种(图 2) :根据其功能可分为基因芯片(包括 DNA和 RNA 芯片)、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等; 根据 其物理结构可分为微点阵(或阵列)芯片、3D胶垫式 微阵列芯片、微珠芯片、微流控(microfluidic)芯片和 芯片实验室( lab chip)等。由于各种分类相互也有 交叉,在这篇综述文章中,首先介绍生物芯片中最基 础的基因芯片和蛋白质芯片的基本原理和概念, 接 下来重点介绍一些新型生物芯片的研究进展。 图 1 DNA(左)和蛋白质(右)的三维结构示意图 Fig. 1 Schematic three dimensional structures of DNA ( left) and protein ( right) 图 2 各种不同类型的生物芯片示意图 Fig. 2 Schematic structures of different biochips 2 微点阵 DNA芯片 2. 1 DNA芯片介绍 DNA(或基因)芯片的基本原理是 DNA 分子的 杂交,这是由 DNA分子本身所独有的性质决定的。 #2398# 化 学 进 展 第 21 卷 每一个核酸分子是由数个或更多的碱基单体组成的 线性大分子结构。著名的Watson和 Crick的DNA双 螺旋结构阐明了核酸分子中的碱基具有相互配对的 特性。当一个核酸分子的碱基序列与另一个核酸分 子的碱基序列互补时, 那么这两个核酸分子的互补 碱基就一一对应地结合起来并在生理条件下稳定地 存在, 这就是 DNA分子的杂交。 DNA芯片采用的微阵列技术使得一次性高通 量和平行检测成为可能。检测基因表达的经典方法 主要有印迹杂交( Southern 和 Northern)、差异杂交、 RT2PCR和原位杂交等技术。这些方法都只能对少 数几个基因的表达进行分析。但生物体是一个复杂 的系统,需要对多个或整个基因组进行诊断和分析, DNA芯片的概念和发展适应了这一社会需求。 DNA芯片是生物芯片中最基础、研究开发最 早、最为成熟和目前应用最广泛的产品,它是随着人 类基因组( human genome project, HGP)的实施, 伴随对基因组测序的需求应运而生的。1991 年位 于美国北加州硅谷的 Affymetrix公司的Fodor 发明了 一种利用光刻技术在固相支持物表面上选择性地进 行图案化光化学从而合成多肽的方法[ 2] , 并在此基 础上于 1993年设计出了平行制备多种寡核苷酸的 生物芯片[ 3]。直至 1996年底, 该公司充分结合并灵 活运用了集成电路的照相平板印刷、计算机控制、光 化学、寡核苷酸合成、荧光标记、核酸探针分子杂交 和激光共聚焦荧光扫描等高新技术,研制出世界上 第一块商业化的 DNA芯片。在此之前, 美国斯坦福 大学P. Brown 教授的实验室发明了以机械自动手 臂点样在玻璃载片上的 cDNA 芯片[ 4] , 标志着基因 芯片技术进入了广泛研究和应用的时期。基因芯片 技术被科学家们迅速应用于动植物和人类基因的研 究领域,它们在核酸研究领域中得到了长足的发展, 实现了部分商业化的过程。 2. 2 DNA芯片的制作 DNA芯片的制备过程是将已知序列的成千上 万条寡核苷酸文库或 cDNA探针文库规律地密集排 列在生物芯片(如玻片和高分子膜等)上, 然后将要 研究的目标核酸序列(如 DNA、RNA 或 cDNA)用荧 光标记后, 在芯片上与探针杂交, 再通过激光共聚 焦荧光显微镜或电荷耦合器件( CCD, charge coupled device)对芯片扫描, 并配合计算机系统分析, 对每 一个探针样品点上的荧光信号作出比较和检测, 从 而快速、准确地得出所需信息。设计、合成和纯化 DNA探针文库是制作 DNA 芯片最繁琐和关键的前 期工作。 图 3 光导合成法原理的流程示意图 Fig. 3 Schematic flow2chart for preparation of a DNA microarray by photolithography DNA 芯片的制作主要可分为两大类。一类是 目前通用的机械手臂自动点样法(即 P. Brown 法)。 将预先制备好的 DNA 文库里的微量探针样品, 通过 机械手臂的微量接触点样装置或微量自动喷墨点样 仪规则地分布在固体载片上, DNA探针分子通过物理 吸附或化学键合的方式被固定在载片上来制备DNA 点阵芯片。此种方法适用的探针可以是整个基因(长 度几百至上千个碱基, 从PCR制得)或者是较长链的 寡核苷酸(长度几十至上百个碱基合成制得)。运用 这种方法制作的探针密度可达到几百个点Pcm2。此 方法的优点是利用了天然的 DNA文库,因此具有更 强的亲合能力和特异性杂交,缺点是每个样品在微 阵列制作前都需要合成、纯化和保存等。 另一类是在半导体硅片或玻璃片上, 以原位聚 合的方法合成寡核苷酸阵列, 即前面介绍的 Affymetrix公司 Fodor 发明的光导合成法 (如图 3)。 在经过处理的载玻片表面铺上一层硅烷偶联剂的连 接分子, 分子的末端羟基用光敏保护基因 X封闭。 利用微电子光刻技术的平板照相技术对芯片进行紫 外曝光,曝光区域光敏保护基团 X离去, 并产生游 离羟基, 利用 DNA固相化学反应在游离羟基区域 加上带有基团 X 的第一个核苷酸, 清洗和干燥后, 利用光刻的套刻技术可在芯片另外的特定位点进行 另一核苷酸的加成。重复上述步骤, 直至合成到所 需的寡核苷酸链的长度为止[ 2, 3]。这类原位合成法 一般适用于合成短链的寡核苷酸(长度大约在 25个 碱基左右)。该法的优点是能直接人为设计寡核苷 酸序列,并将它们在线合成来制造芯片,或根据顾客 的定制给出高密度的寡核苷酸芯片, 若能保证合成 中每一步的高精确度, 可以最大限度地消除芯片之 间的差异。运用这种方法制作的芯片理论上若产生 1Lm2 大小的点阵, 密度可高达 108 点Pcm2。但由于 检测的限制, 现在的实际制备密度与点样法相当。 #2399#第 11 期 肖守军等 生物芯片进展 它的缺点也很明显, DNA 固相合成在平板上的产率 远低于在树脂中的产率, 因此原位合成法不能超过 25个寡核苷酸的长度,实际上几个循环后的出错率 就很大了,它的制作周期也较长, 价格偏高, 目前该 技术已不被看好。 3 微点阵蛋白质芯片 3. 1 蛋白质芯片介绍 微点阵蛋白质芯片是由基因芯片技术直接发展 而来的,它是沟通基因组学和蛋白质组学的工具和 桥梁,目前仍处于发展过程中。在生物体内, 核酸分 子(包括绝大多数的 DNA和 RNA)通常是机体存储 和传递各种信号的载体, 而最终具有执行功能的基 本单元是核酸所表达出的蛋白质,核酸表达时根据 机体的需求,产生在功能、结构和数量上都不尽相同 的蛋白质。基因芯片虽能侦测体内细胞 mRNA 和 DNA的变化,但不能侦测真正影响细胞生理状态的 蛋白质。 如前所述, DNA是双螺旋结构并且严格遵守碱 基配对原则(A2T, C2G)。磷酸根在螺旋的外侧构成 两条方向相反的多核苷酸链骨架;碱基在螺旋内侧, 两两对应。因此, DNA 的结构是单一和稳定的, 并 具有高度的亲合性和特异性, 配对 DNA的作用位点 是一一对应的, 即使干燥储存也不会丧失活性。与 DNA不同, 蛋白质是高度复杂和精巧的分子。它是 由一条或多条多肽链通过共价键(主要是二硫键)或 非共价力结合而成的, 氨基酸是其基本结构单元。 蛋白质的结构非常复杂, 主要包括以肽链线型结构 为基础的一级结构,以及由肽链卷曲和折叠而形成 的三维结构:蛋白质的二级、三级和四级结构。具有 独特的三维结构和生物活性是蛋白质分子区别于非 生物的有机和高分子最显著的特征。天然活性蛋白 质都具有特征且稳定的三维结构,一旦这种三维结 构遭到破坏,即使它的一级结构不变,蛋白质的生物 功能也会完全丧失。因此, 在制备蛋白质芯片时必 须保持蛋白质的三维结构以保持其生物活性。由于 蛋白质的类型多样,其亲合性和特异性也有很大的 区别。另外, 特定的蛋白质和生物体内的矿物质、 水、排泄物、脂类分子及其他蛋白质混合在一起, 浓 度很低,在不同时期其丰度变化可达 10 个数量级。 因此,要求检测手段具有非常高的灵敏度、特异性和 大的动态响应范围。基因表达的研究告知: mRNA 的丰度和蛋白质的表达没有必然联系, 二者不是线 性关系,基因芯片检测的结果不能告知生物体内的 蛋白质水平,因基因的蛋白质表达是动态的,在不同 阶段基因表达蛋白质的开启和关闭也是科学家目前 不能预测的, 同时很多蛋白质的功能随翻译后修饰 的不同而变化。因此要获得完整的生物信息,就有 必要直接研究基因的表达产物 ) ) ) 蛋白质, 以了解 人体的健康状况并进行诊断和治疗, 蛋白质特殊的 功能和复杂性都有待探索和解释[ 5]。 人类基因组大规模测序工作已经完成, 功能基 因组学和蛋白质组学成为当今生物学界的主要研究 内容之一,蛋白质组学的研究迫切需要一种能够快 速、准确、并行处理和检测蛋白质分子的方法。传统 的酵母双杂交方法、Western 印迹法、免疫印迹法 ( immunoblot )、酶联免疫吸附法( ELISA)等蛋白质科 学常用技术存在着操作繁琐、费时费力、不能大规模 并行处理样品的缺点。二维蛋白质电泳是目前公认 的一次性大批量处理和检测蛋白质样品的通用方法 和工具,但是操作也较复杂和耗时。而且,二维蛋白 质电泳的最低检测限为 1ngP点, 被认为只能有效地 分辨生物体中高丰度表达的蛋白质样品, 而与很多 疾病相关的重要蛋白质的表达量都比较低,不能被 分辨出来;另外,二维蛋白质电泳虽然能根据蛋白质 的分子量和结构将蛋白质分区, 但不能精确确定蛋 白质的分子量,电泳分离后的蛋白质条带还要进行 进一步的质谱测定。而蛋白质芯片具有快速、准确 和并行检测等优点, 作为检测蛋白质存在和运动变 化的高效工具,它将为人类社会急需的疾病诊断和 治疗、新药开发、分子生物学、食品卫生及环境监测 等领域带来变革。蛋白质芯片可以直接测定蛋白质 的相对水平及与其他分子的交互作用情况,也能反 馈出基因的活动情况, 因而蛋白质芯片有着比基因 芯片更加直接的应用前景。 3. 2 微点阵蛋白质芯片的制备 形成蛋白质微阵列图案的主要方法有:接触式 自动点样法、非接触或喷墨式自动点样法、PDMS印 章法[ 6]及光刻法[ 7]。 微加工技术是人类迄今所能达到的精度最高的 自上而下( top2down)的加工技术,光刻技术是其重要 支撑手段之一。根据光刻过程中曝光所用的射线不 同,光刻方式可分为紫外线光刻、X射线光刻、电子 束光刻和粒子束光刻。无论用哪种射线和方式进行 光刻,其工艺步骤大体是一样的,包括涂胶、前烘、曝 光、显影、漂洗、坚膜等步骤。 考虑到蛋白质芯片的特殊要求,合适的基底材 料应符合以下条件:尺寸精确、平滑、平整、均一、耐 #2400# 化 学 进 展 第 21 卷 受性强、荧光惰性、反应效率高和可结合性强[ 8]。现 有的基底主要包括玻璃片或石英玻璃片、硅片、金 膜、凝胶、滤膜及它们的衍生物等。芯片载体的低荧 光背景能提高检测的灵敏度。玻璃片或石英玻璃片 是普遍使用的固相基片, 玻璃片表面形成点阵的方 法主要是喷墨式或接触式自动点样,并且可以标准 化及与大多数商业扫描仪兼容。但玻璃片会吸收部 分紫外和可见激发光,发出干扰测定的二次荧光;石 英玻璃片几乎没有二次荧光效应, 但基片价格较高。 基于性价比的原因,常用的基片还是玻璃片和高分 子载片。另一方面, 这类平铺的芯片的容量较小, 结 合蛋白质的能力及水分保持能力较差。为了避免蛋 白质干燥, 需要在样品缓冲液中按照一定比例加入 甘油或在点样时使用加湿器保持环境的湿度。载片 的表面并不能直接固定蛋白质, 制备微阵列之前载 片表面需经特殊处理, 如多聚赖氨酸修饰或戊二醛 表面活化。表面疏水的基片易于点样, 同时水滴收 缩形成大小一致的球状,从而构成均一的点阵。表 面的活性基团用来物理吸附(如聚赖氨酸的静电吸 附)和共价偶联蛋白质。 黏附蛋白质的交联层一般由自组装的单分子膜 构成, 最熟知的单分子膜是硅烷偶联剂和多聚赖氨 酸。不同的材质决定蛋白质的固定方式和检测方 式。蛋白质固定到固相基片上有扩散、吸附、共价偶 联和亲合结合 4种方式(图 4) [ 9]。 图4 蛋白质固定的不同方式:扩散 (左上 )、吸附 (右 上)、共价偶联(左下)、和亲合结合(右下) [ 9] Fig. 4 Immobilization of proteins with different approaches: diffusion ( upper left ) , adsorption ( upper right ) , covalent binding ( bottom left) , and affinity binding (bottom right) [9] 亲脂基底(如尼龙和赛璐珞)及带正电荷的表面 (如多聚赖氨酸)主要是利用吸附作用。物理吸附是 固定蛋白质最简单的方式, 主要作用力有疏水作用 力、离子键、氢键和范德华力。吸附作用一般意义上 讲是一种弱连接, 对保持相对自由的蛋白质的活性 有一定的优势,但缺点也很多,比如吸附在疏水表面 的蛋白质或蛋白质和固相基质间作用位点过多都容 易导致蛋白质的变性, 而且非常容易发生非特异性 吸附。吸附的蛋白质的分布是随机的,固定不牢固, 易被冲洗下来。 醛基、环氧基和活性交联剂的表面是通过共价 偶联固定蛋白质的。共价连接的方式作用位点少, 但作用力强、固定牢固、整体反应也容易控制。如果 知道蛋白质分子的三级结构,就有可能实现定点修 饰,使其生物活性部位向外, 达到一种/定向0的效 果,提高灵敏度。但如果连接的是活性位点,则蛋白 质失活, 而且选择性也比较差。例如通常用到的蛋 白质内自由氨基的交联因绝大部分蛋白质含有多个 氨基,不能确定哪个或者几个氨基被固定到基片上, 交联后蛋白质的活性不能准确地确定, 这很可能是 很多商业芯片的测试结果不能很好地重复的原因。 水凝胶和琼脂糖凝胶表面构成了三维结构,它 们可利用扩散作用来捕获蛋白质, 特点是高结合容 量、低噪声背景和无需蛋白修饰,水凝胶体系能够很 好地保持蛋白质的三维结构从而保持蛋白质的活 性,在下面的章节里还要专门讨论。 亲合结合主要是利用一些特定相互作用,比如 NiÒ2NTAPhistag和 biotinPavidin等一些特异性强的相 互作用系统。这种方式蛋白质的固定位点确定、固 定强度适当、分布均一、蛋白质取向也能保证,故能 保持蛋白质的活性, 特异性作用强, 噪声背景也很 低。但这些特异性作用的蛋白质需要在表达时就进 行标记, 如与 NiÒ2NTA 作用的蛋白质需组氨酸标 记,与抗生素作用的蛋白需用生物素标记等。 在许多情况下, 共价或非共价结合的亲合标签 比直接固定蛋白质更具优势。亲合标签或抗原决定 表 1 蛋白质芯片常用的亲合标签[10] Table 1 List of affinity tags for protein microarray[10] affinity tags mode of attachment poly2amino acid poly2His nickel resin poly2lysine amide & Schiff base l inkages poly2cysteine thioether linkage biotin streptavidin protein G ant ibody Fc protein A ant ibody Fc recombinant fusion proteins ant ibody GST ant i2GST MBP ant i2MBP TRX ant i2TRX GFP ant i2GFP poly2His nickel resin #2401#第 11 期 肖守军等 生物芯片进展 簇标签可以是多肽、聚合氨基酸(例如与镍结合位点 连接的多聚组氨酸,以氨基或席夫碱连接的多聚赖 氨酸, 与硫醚连接的多聚半胱氨酸)、完整的蛋白质 (例如 G蛋白、谷胱甘肽 S转移酶或 GST、绿色荧光 蛋白质或 GFP、硫氧还蛋白)、有机生物共轭体(例如 生物素)、一对偶合试剂或交叉连接子等(表 1) [ 10]。 4 生物芯片读出机制 既然生物芯片的特征是高通量、微型化和自动 化,这就要求它的读出技术也是高通量和快速的。 目前使用最广泛的读出技术是荧光扫描;质谱检测 技术的发展也非常迅速, 已有多款质谱检测的生物 芯片。除此之外,电信号和光信号也是生物芯片重 要的读出技术。 4. 1 荧光扫描检测的原理 荧光是光致发光的结果, 当特定波长的光子(单 色激发光)被所照射的分子吸收后,分子的电子能级 发生跃迁,而这些处于激发态的分子是不稳定的, 在 适当的条件下, 这部分被吸收的能量又以辐射的形 式释放出去,这就是光致发光。 荧光分析是用芯片里阵列的点阵所发出的荧光 强度来测定试样里荧光物质的含量。在生物芯片的 检测中,荧光强度 F 可以表示为: F = 5I OKC,其中 5 是荧光效率(入射光的量子与出射荧光的量子之 比) , IO是入射光的强度, K为常数, C为目标分子的 表面覆盖度。荧光强度与荧光物的表面覆盖度成正 比,这样就可以定量地检测薄膜表面荧光物质的含 量。荧光检测已经成为检测生物芯片最直观和方便 的方法。生物芯片点阵捕获的目标分子在点阵上是 均匀的,要得到目标分子的绝对含量(如 5 和K ) 是 有一些困难的, 故绝大部分的工作用了相对量来定 量描述生物芯片的数据。为了能够得到与其他方法 交叉验证的数据,内标法和标准曲线法是通常使用 的定量分析方法。 在微阵列分析中,多色荧光标记可以在一个分 析中同时对两个或多个生物样品进行多重分析, 多 重分析能大大地增加基因表达和突变检测结果的准 确性,排除芯片与芯片间的人为因素。 荧光扫描检测技术主要有两种: CCD成像扫描 仪和激光共焦扫描仪。CCD结构简单, 一次成像,不 需要二维移动平台,经济实惠,但分辨率低, 视场也 不够大。激光共焦扫描成像检测是目前的主流技 术,采用激光作光源,光电倍增管检测。一旦荧光标 记的样品和微点阵结合后,未结合的成分被洗去, 结 合到微点阵芯片的样品点(约几十至几百 Lm2)在激 光激发下成为一个荧光发射透镜,使整个影像聚集, 荧光通过一系列的反光镜、滤光片和晶体后与不要 的光分开,然后被光电倍增管( PMT)转换成一种电 信号进行检测。激光共聚焦扫描成像技术使得荧光 为基础的数据获得和定量分析成为可能, 快速的荧 光检测技术是芯片检测技术的一次革命。 4. 2 质谱方法 质谱在研究物质组成和结构方面一直占有极其 重要的地位, 可以提供化合物的相对分子质量(Mr) 及丰富的结构信息。传统的质谱离子化方法包括电 子轰击和化学电离, 不适于难挥发和热不稳定的强 极性物质的测定, 因而对生物大分子的测定无能为 力。新的软电离技术的诞生, 如快原子轰击( FAB)、 电喷雾电离 ( ESI ) 和基质辅助激光解吸电离 (MALDI) , 使得在 Lmol#L- 1和 nmol#L- 1的水平上可 以准确分析分子量高达几万到几十万的生物大分 子。将这些软电离技术与多级质谱相结合可以获得 蛋白质和多肽分子的结构信息, 因此在蛋白质和多 肽等大分子物质的分析领域中得到了广泛应用。目 前蛋白质组学中常用到的一种质谱技术是电离飞行 时间质谱 (MALDI2TOF2MS)和由此演化而来的表面 增强激光解析离子化飞行时间质谱 ( SELDI2TOF2 MS)。由于 SELDI 的特殊性, 第 5节专门分一节来 描述。 4. 3 电化学分析方法和其他方法 安培检测法是根据待测物质在恒(或脉冲)电位 工作电极上发生电化学反应所产生的氧化电流或还 原电流对待测物质进行定量的检测方法, 其灵敏度 很高,具有一定的选择性;电导检测是根据带电组分 对溶液电导率的贡献而进行检测的, 理论上离子型 组分均可进行电导检测。微流控和毛细管电泳芯片 分析系统中常用电化学检测方法。Intel、Motorola和 CombiMatrix等公司投资的生物芯片都是利用和电化 学分析相关的技术来进行检测的。 其他的如光反射干涉谱、表面等离子共振、红外 和拉曼光谱等在生物芯片的检测上都有文献报道。 5 SELDI蛋白质质谱芯片技术 表面增强激光解吸离子化( SELDI)蛋白质质谱 芯片技术是 Taylor 医学院的 Hutchens 等发展起来 的[ 11]。作为 SELDI 芯片载体的材料必须是导电的, 这样才不至于导致电荷的积累,实际上 SELDI蛋白 质质谱芯片是集亲合层析、富集、分离和检测于一体 #2402# 化 学 进 展 第 21 卷 的技术。这种技术利用芯片载体(如硅、金、银等金 属)表面的化学修饰,将表面处理成化学类型或生物 类型的芯片。化学类型的芯片表面如亲疏水型、阳 离子交换型、阴离子交换型和金属离子螯合型等, 根 据蛋白质物理和化学性质的不同,芯片表面上的点 阵选择性地从待测生物样品中捕获目标物, 将其结 合在芯片的亲合层析面上,经原位清洗和浓缩后, 结 合TOF2MS 技术, 对捕获的多肽或蛋白质进行质谱 分析[ 11,12]。利用芯片表面修饰分子物理和化学性质 的不同,对蛋白质分子进行分类和鉴定,如表面使用 亲疏水的材料, 则它吸附与之对应的表面亲或疏水 的蛋白质。SELDI芯片有许多优点:它避免了复杂 的样品预处理过程, 可直接用于分析患者的血液、尿 液、脑脊液、胸腔积液等体液以及细胞裂解液;样品 用量少,一般在 015 ) 15Ll 或几百个细胞;可同时测 定多个生物标记物, 并用于发现一些低丰度和小分 子量的蛋白质;敏感性高,可达到 1fmol 量级;对疏 水性蛋白质特别是膜蛋白有独特鉴定作用等。 生物类型的芯片实质上是一些固定有特异性结 合的蛋白质探针的点阵, 特异性结合的生物分子作 用类型如抗原2抗体、受体2配体、DNA2蛋白质、DNA2 RNA等。它的优点是特异性高, 可直接检测到未知 的蛋白质, 单克隆抗体芯片可替代 Western Blot , 可 以互补流式细胞仪不足的功能等。 美国芝加哥大学化学系的Mrksich 教授领导的 课题小组以贵重金属金、银和铂等为基底,结合自组 装膜和膜上的生物特异性反应, 用质谱技术检测了 酶的活性等。图 5显示了一种酶只对它的底物多肽 进行磷酸化[ 13]。 6 高通量 DNA测序技术 在基因芯片的基础上,科学家和一些公司合作, 发展了高通量测序技术, 该技术的典型代表是罗氏 公司(Roche)的 454测序仪(Roch GS FLX sequencer) , Illumina 公司的 Solexa 基因组分析仪 ( Illumina Genome Analyzer ) 和 ABI 的 SOLiD 测序仪 ( ABI SOLiD sequencer)。高通量测序的基本原理是合成测 序,与基因芯片的杂交测序相比,它省略了文库构建 这一繁重的实验步骤。 图6是罗氏公司 454测序仪合成测序原理的示 意图。将被测模板 DNA结合上通用的锚定接头, 分 离并一一对应固定到微珠或平板的特定区域, 在特 定的区域用乳液 PCR扩增至百万倍后, 加入测序试 剂:如 DNA 引物和 DNA聚合酶,然后依次加入 4种 图 5 SELDI 质谱技术用于检测酶的活性, 图中, 一个 protein kinase G的多肽底物被固定在自组装膜上的马来 酰亚胺官能团上(A) , ( B)为用质谱检测的该多肽的分子 量(上图)和酶作用后多加了一个磷酸基团的多肽分子量 (下图) , ( C)固定了 4 个不同分子量多肽的样品的质谱 (上图)和经酶作用后只有该酶的底物多肽(M4)被磷酸 化的质谱[ 13] Fig. 5 Assay of enzyme activity by matrix2assisted laser desorptionPionization spectroscopy. A peptide of the substrate of protein kinase G was linked by maleimide species of a self2 assembled monolayer on gold and then was phosphorylated by an enzyme PKGPATP (A) . Mass spectra of the monolayer before ( B) and after (C) the enzyme reaction reveal that the mass of the peptide2terminated alkanethiol increased by 80Da, corresponding to the expected phosphorylation. A multi2analyte assay was performed by immobilizing a mixture of four peptide substrates. Treatment of the monolayer with casein kinase 1 resulted in phosphorylation of only a single peptide, which was easily detected in the mass spectra[13] #2403#第 11 期 肖守军等 生物芯片进展 脱氧核苷酸( dNTP)、引物以及待测 DNA为模板开始 延伸,加入的一个 dNTP 是否在模板上延伸, 可以用 多种方法来测定, 454测序仪使用了焦磷酸测序的 发光方法来测定碱基的延伸, 重复上述的步骤,就能 够确定每一个片段的序列, 最后将所有序列进行组 合,就可得到基因的序列[14, 15]。 Solexa的方法为克隆单分子阵列 ( clonal single molecule arrayTM) 技术, 它不同于 454测序仪的方法 是将引物固定在载玻片表面, 待测序的带有通用锚 定接头的单个基因组 DNA 片段稀释后随机地被引 物稀疏地固定在载玻片表面, 随后用桥联 PCR 复 制,在该DNA附近形成大约 1 000个完全一样拷贝 的微小 DNA 簇( cluster)。最后测序时, 采用 Sanger 测序类似的步骤, 分别加入 4 种不同荧光标记的 dNTP,芯片荧光扫描系统同时检测芯片中那些被固 定的 DNA簇的引物延伸过程,最终用软件分析得到 整个基因组序列。 ABI 的 SOLiD ( supported oligo ligat ion detection) 测序技术来源于 Church 课题组发明的连接测序 (sequencing by ligation) 方法[ 16] , 连接测序名称的原 因是他们使用了 DNA 连接酶来进行测序。该法首 先将断裂的DNA 片段固定在微珠上, 通过乳液 PCR 扩增后,将微珠以点阵的方式排布。加入测序引物 与微珠上 DNA 片段的已知起始序列发生结合。随 后加入长度为 8个碱基的 3c端起始的半简并引物, 该半简并引物的第 4位和第 5位的碱基是确定的, 根据碱基的不同组合, 在末端标记不同的荧光素。 当正确的半简并引物结合到待测 DNA片段上时, 连 接酶识别接头处的 4个碱基(起始端的两个在已知 引物的5c端,终结端的两个在半简并引物的3c端)并 连接起来, 通过化学方法将第 6位到第 8位的碱基 切除, 释放出荧光团, 通过测荧光确定序列的配对, 亦即第4和第 5位碱基序列。同时, 连接酶启动下 一轮的连接,上一轮的第 4和第 5位碱基将作为连 接的起始端。由于每次连接切除后都是 5 的倍数, 所以 SOLiD测序的平均读长在 25 ) 35bp。由于每次 读序为两个碱基,每个碱基被读两次, SOLiD测序仪 具有很高的序列读取精确度和数据输出量。所有上 述的高通量测序技术都还有待发展和完善, 但高通 量测序技术被 Science评为 2008年度十大最有影响 力的科技发明之一,可以预见,在不久的将来, 它们 将替代现有的测序技术。 7 基于胶体光子晶体的微球高通量生物检测 阵列型生物芯片进行检测时,一个被检测的分 图 6 454 高通量 DNA 测序原理: ( a)基因 DNA 被分离、 断裂、连接到锚定接头上并变性为单链, ( b) DNA 单链被 结合到微珠上, 一个微珠连接一条 DNA, 微珠被分离和 分配到含有上百万个小孔的平板上, 加入 PCR 试剂反应 后, 每个微珠带有上千万条同一个 DNA 片段的拷贝, ( c) 将小孔内的 DNA变性, 微珠上携带的单链 DNA 模板被 富集并转移到有光纤的微孔板上, ( d)更小的携带固相焦 磷酸测序酶的微珠被加入到每个微孔, ( e)在加入微珠之 前带有光纤探头的微孔平板的扫描电镜图片, ( f) 454 测 序仪含有的主要部件为:含有 A、T、G、C脱氧核苷酸单体 ( dNTP)的溶液加入系统( i) , 包含光纤探头微孔平板的流 动池( ii) , CCD成像系统和计算机控制系统( iii) [ 15] Fig. 6 Principle of the 454 high throughput DNA sequencing. ( a) Genomic DNA is isolated, fragmented, ligated to adapters and separated into single strands. ( b) Fragments are bound to beads under conditions that favor one fragment per bead, the beads are isolated and compartmentalized in the droplets of a PCR2reaction2mixture2in2oil emulsion and PCR amplification occurs within each droplet, resulting in beads each carrying ten million copies of a unique DNA template. ( c) The emulsion is broken, the DNA strands are denatured, and beads carrying single2stranded DNA templates are enriched ( not shown) and deposited into wells of a fiber2optic slide. ( d) Smaller beads carrying immobilized enzymes required for a solid phase pyrophosphate sequencing reaction are deposited into each well. ( e) Scanning electron micrograph of a portion of a fiber2optic slide, showing fiber2optic cladding and wells before bead deposition. ( f) The 454 sequencing instrument consists of the following major subsystems: a fluidic assembly ( object i) , a flow cell that includes the well2containing fiber2optic slide ( object ii) , a CCD camera2based imaging assembly with its own fiber2optic bundle used to image the fiber2optic slide ( part of object iii) , and a computer that provides the necessary user interface and instrument control (part of object iii) [ 15] #2404# 化 学 进 展 第 21 卷 子往往要穿越很多检测点后才能到达相应的探针分 子所在位置。这样即使是在使用少量的被检测液的 情况下,扩散过程是一个耗时且必不可少的过程。 因此, 如何缩短目标分子到达探针分子的扩散时间 是提高检测速度的关键。 提高目标分子和探针分子的反应速度可以通过 将固定探针分子的载体变成与被检测液充分混合的 流动载体得以实现 (图 7)。探针分子和被检测分子 在溶液中的充分混合极大地减少了相互作用的时 间。但是在使用流动载体时由于流动载体的空间不 确定性, 空间坐标不能被用来对探针分子进行编 码,因此需要一个新的对探针分子进行识别编码的 方法。 图 7 生物分子阵列(上图)和微球检测法(下图)示意图 Fig. 7 Biomolecular sensing by microarraying ( upper ) and micro2bead bio2coding ( lower) 现有的流动载体编码方法主要是光学编码如: 荧光染料分子编码、量子点编码、红外光谱自编码 等。其中 Luminex公司基于荧光编码微球的液相生 物芯片已经取得了巨大的商业成功。因此, 近几年 以来, 关于流动载体的编码一直是新型生物芯片的 研究热点。 东南大学生物电子学国家重点实验室的顾忠泽 课题组提出并实现了利用自组装胶体光子晶体微球 对生物分子进行编码的设想[ 17 ) 19]。该编码载体是 由单分散的纳米粒子(粒子为球形,直径一般在几十 纳米到几百纳米之间。粒径的分散度要求在 5% 以 内)通过自组装形成的具有三维有序结构的纳米材 料(图 8)。粒子在自组装过程中形成密堆积纳米结 构。光子晶体中的球形粒子的周期排列会形成光带 隙结构。光带隙的频率由构成光子晶体的纳米微球 的粒径决定。和带隙频率相同的入射光会被光子晶 体反射, 从而在反射光谱上出现一个反射峰。光子 晶体流动载体就是利用该反射峰的位置进行编码。 在利用光子晶体编码载体进行多元检测时,首先用 不同粒径的单分散球型粒子制备光子晶体微球, 然 后在不同的光子晶体微球上分别修饰不同种类的探 针分子。由于光带隙的位置随组成光子晶体的纳米 粒子的大小而变化, 因此在任何一种光子晶体载体 上固定的生物分子的种类都可以通过测定反射峰的 位置来确定。在检测时, 将分别修饰有不同探针分 子(如一抗)的光子晶体编码微球与待测样品溶液混 合,使探针分子与样品中的靶分子(如抗原)结合,然 后洗去样品溶液, 加入标记分子(如荧光标记二抗) 再次结合靶分子(抗原)。这样靶分子(抗原)的有无 可以通过检测标记分子的信号(如荧光、化学发光 等)来确定,而靶分子(抗原)的种类, 则可以通过与 一抗偶联的光子晶体微球的编码(光子晶体反射峰 位置)来确定。 图 8 光子晶体微球的显微镜照片。( a)光子晶体微球; ( b)微球在支撑表面排列的光子晶体纳米结构 Fig. 8 Photonic crystal micro2beads by scanning electron microscopy: ( a) a single bead was observed and ( b) a photonic crystal structure on a supporting surface was illustrated 图 8中的光子晶体微球由直径为 260nm的纳米 粒子组成。可以看出光子晶体微球表面与其他微球 不同,具有有序的纳米周期结构。这种周期结构增 大了微球的表面积, 从而增加了球表面探针分子的 固定量。用作编码的反射峰来自于光子晶体微球的 纳米结构,通过改变组成光子晶体的纳米微球的大 小可以非常简单地对光子晶体微球的编码信息进行 设计。与荧光染料编码相比,这种来自于纳米结构 的编码具有无与伦比的稳定性, 不会产生任何荧光 漂白和荧光猝灭现象。 图 9是 3种不同编码的光子晶体球及其在免疫 分析中的应用[ 20]。由于光子晶体微球不含有染料 和量子点等发光物质, 因而荧光本底很低。这种编 码方法有效解决了 Luminex 的 xMAP 技术平台中的 #2405#第 11 期 肖守军等 生物芯片进展 荧光编码稳定性差、荧光背景高和荧光干扰等诸多 问题, 而且可以利用光子晶体的反结构对生物分子 进行非标记传感,同时具有制备成本低、检测灵敏度 高、检测所需设备简单等优点,在流行病检测、癌症、 心血管疾病早期诊断等需要快速、高灵敏度、多元检 测的领域具有广泛的应用前景。 图 9 利用光子晶体编码微球的多元检测。红色, 绿色 和蓝色光子晶体微球分别由 250nm, 220nm 和 200nm单 分散 PMMA纳米粒子自组装得到。在红绿蓝三种光子 晶体微球的表面分别包被有人 IgG, 兔 IgG和小鼠 IgG,并 封闭了未包被蛋白的空位点。将这三种颜色的微球与含 有FITC标记羊抗人 IgG和羊抗兔 IgG的样品溶液共同温 育,反应结束后进行充分洗涤。在检测时,利用装有光纤 光谱仪的荧光显微镜先后检测微球反射光谱(编码)和微 球表面的荧光(标记信号) ,并将荧光标记信号和编码信 号对应起来[20] Fig. 9 Multiplex immunoassay based on colloidal crystal beads. Three kinds of antigens were immobilized on three kinds of encoded colloidal crystal beads. Three encoded beads with red, green, and blue colors ( right ) were immobilized with human IgG, rabbit IgG, and mouse IgG respectively, and exposed to a sample solution containing FITC2tagged goat anti2 human IgG and goat antirabbit IgG. The fluorescence was detected on red and green beads but not on blue beads through the fluorescence spectra or fluorescence microscopic images ( left) respectively. The bead codes were identified by either the optical reflection spectra or color images[ 20] 8 三维阵列芯片 目前使用广泛的平铺探针点阵是建立在低荧