第七章 病毒病的实验诊断new

null第七章 病毒病的实验诊断第七章 病毒病的实验诊断 第一节 病毒病的常规实验诊断 一．病毒的分离和鉴定 1、采集病料后应尽快冷藏保存 -30℃可保存几个月，-70℃可保存几年 2、怀疑为疱疹病毒的感染材料，可置-50℃或4 ℃保存 3、现场采集病料，应尽快置冰 –盐混合的冰瓶内，送往实验室或冷藏地点。null（一）      病毒材料的准备 1． 脑、肝、肌肉等器官或组织 充分研磨后加入5倍量的Hank’s液（内含青霉素、链霉素各200U/ml），反复冻融3次。2000r/min离心 10min，取上清作接种物。 null2． 鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物 用内1000u/ml含青、链霉素（P.S）的Hank’s液，将其稀释3-5倍，充分混匀悬浮后，置4℃冰箱内感作2-4h或过夜，2000r/min 10min取上清作接种物。 一．病毒的分离和鉴定null3．咽喉拭子或鼻拭子 仔细用棉拭子擦拭咽喉部或鼻部，并迅速将其泡入盛有2-5ml Hank’s液（200-500u/ml P.S）的试管内，充分涮洗棉拭子，反复冻融3-5次，收集液体部分，2000r/min 10min，收集上清作接种物。一．病毒的分离和鉴定null4．粪便 用棉拭子插入肛门沾取或扑杀病畜后由肠管采集。用含1000u/ml P.S的Hank’s液作10-20倍稀释，4℃感作4h，2000r/min 10min取上清作接种物。 5. 无菌的体液或鸡胚液 直接作接种用 一．病毒的分离和鉴定（二）接种方法（二）接种方法1、实验动物 2、鸡胚 正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、脑炎病毒 3、组织培养细胞（盲传3代） 4、本动物 马传贫病毒、猪瘟病毒、鸡瘟病毒（三）组织培养细胞中病毒增殖的判定 （三）组织培养细胞中病毒增殖的判定 1．细胞病变（CPE） 腺病毒：细胞肿大、颗粒增多、病变细胞呈葡萄串状。 伪狂犬病毒：细胞圆缩、脱落、裂解，形成合胞体。 2. 细胞代谢的测定 生活细胞在代谢过程中产生各种酸类，使营养液的pH下降，而病毒感染的细胞由于代谢障碍，产酸能力降低，且因细胞破坏，释出碱性成分，营养液的pH下降不明显甚至上升。 腺病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒null3．抗原的测定 4．中和试验 5． 病毒间的干扰现象 乙型脑炎病毒 ——脊髓灰质炎病毒 流感病毒 —— 西方马脑炎病毒 猪传染性胃肠炎病毒 —— 牛病毒性腹泻-粘膜病病毒 6． 电子显微镜观察 7．  实验动物或鸡胚接种（四）病毒感染力的滴定 （四）病毒感染力的滴定 １．LD50 (半数致死量） ２．EID50（鸡胚半数感染量） ３．TCID50（组织培养半数感染量）（五）病毒理化学特性的测定 （五）病毒理化学特性的测定 判定标准：试验组的TCID50比对照组低2个对数以上判为阳性。 试验组 对照组 TCID50/0.1mL 10-2 10-5null1．病毒核酸型鉴定（药物抑制试验） FUDR、IUDR、BrUDR（5-溴脱氧尿苷） 原理：FUDR、IUDR、BrUDR是嘧啶的卤化物，进入细胞后发生磷酸化，掺入新合成的DNA以代替胸腺嘧啶，产生无功能分子，从而抑制DNA的合成。常用浓度为50ug/ml。2．脂溶剂敏感性试验2．脂溶剂敏感性试验（1）  乙醚敏感试验 取同批病毒分装于两个青霉素瓶中，每瓶16ml，在其中1瓶加入麻醉用乙醚，使终浓度为20%，两瓶均用橡皮塞塞紧后，置4℃冻箱内作用24h，其间不时振荡，随后以2000rpm离心20min。已加乙醚的小瓶，此时分为清晰的两层，上层为乙醚，下层为病毒液，用毛细吸管吸取病毒液，移入另一小瓶内，适当吹打，使残余乙醚挥发殆尽，然后滴定两组病毒的TCID50。null（2）   氯仿敏感性试验 向病毒液内加入纯氯仿，使其终浓度为4.8%，置4℃振荡混合10min。随后500rpm 5min，然后吸取上层液体，滴定病毒 TCID50。对照组病毒加入终浓度为4.8%的生理盐水，同样处理和滴定。然后测定两组病毒的TCID50。 3 胰蛋白酶敏感试验3 胰蛋白酶敏感试验 脊髓灰质炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒对胰酶有较强的抵抗力 痘病毒、呼肠孤病毒、疱疹病毒易被胰酶灭活null 取病毒液两瓶，每瓶1ml，在其中1瓶加入1ml 1%的胰蛋白酶，使终浓度为0.5%，另一瓶加入1ml 培养液，用橡皮塞塞紧瓶口，将小瓶倒转几次，使其充分混合，置37℃ 1h，随即加入灭活犊牛血清8ml，充分混合，终止胰酶的作用。最后滴定两瓶病毒的TCID50。 4．  耐酸性试验4．  耐酸性试验　 取等量病毒液两瓶，用0.1mol/L HCl将1个小瓶中的病毒液的pH调至3.0(or 5.0)，并在另一个小瓶内加入相同于用酸量的培养液作为对照，置37℃水溶或室温中感作2h(or 1h)，再用5.6% NaHCO3溶液将pH调回至7.2左右，对照组再加入相同于NaHCO3量的培养液。测定两者的TCID50。 5． 耐热性试验5． 耐热性试验 将病毒液分成等量的11小瓶，留1小瓶作对照，4小瓶分别置50℃、60℃、70℃、80℃水中1h，另6瓶置50℃水浴中分别感作5、10、15、30、60和180min，随后测定每瓶病毒的TCID50。 6．病毒粒子大小测定 6．病毒粒子大小测定 (1)  电子显微镜直接观察:磷钨酸负染后， 透射电镜观察 (2)  超速离心沉淀 (3)  滤过试验null 取澄清的病毒液20ml，留出1ml作为对照，将剩余的19ml病毒液在正压下依次通过孔经为450nm、225nm、100nm和50nm的各级微孔，每通过一种孔径的滤膜就吸取1ml滤液作为样品，并将剩余的滤液再通过一次滤膜。最后测定原病毒液以及各级滤液的TCID50。null 病毒液种类 TCID50/0.1ml 滤前病毒液 10-6.75 450nm孔径液 10-6.23 225nm孔径液 10-5.78 100nm孔径液 10-4.50 50nm孔径液 10-0.50二．免疫学检测二．免疫学检测目的： ①新分离毒株的种类及型别的鉴定。 ②检测发病动物体液中的Ab，或进一步比较动物急性发病期和恢复期血清中的Ab效价，了解病毒性Ab是否有明显的增长，从而判定病毒感染的存在。（一）中和试验（一）中和试验1. 终点法中和试验 固定病毒——稀释血清法中和试验 固定血清——稀释病毒法中和试验 2．蚀（噬）斑（痘斑）减数试验2．蚀（噬）斑（痘斑）减数试验（1）蚀斑技术 病毒蚀斑：又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。 nullTKTK--突变株与野毒株所形成空斑的比较突变株与野毒株所形成空斑的比较l左图为Ea株亲本形成的空斑l右图为Ea株TK缺失突变株形成的空斑null原理： 将病毒悬液作连续的10倍稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂糖，待其出现蚀斑后计数，即可算出每毫升病毒悬液中所含的蚀斑数，即蚀斑形成单位。 用途： ①用于病毒纯化； ②测定病毒悬液中感染病毒的含量。 null（2）蚀斑减数试验 将病毒—正常血清混合物以及病毒—待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒—正常血清组和病毒—待检血清产生的蚀斑数，两者的差数示待检血清的中和能力。以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。 3．交叉保护试验3．交叉保护试验 先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检病毒的种类或型别。其缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。null用途： （1）应用已知病毒鉴定未知病毒 （2）应用已知免疫血清鉴定未知病毒 （3）应用已知病毒鉴定未知血清 （二）血凝和血凝抑制试验（HA和HI）（红细胞凝集和红细胞凝集抑制试验）（二）血凝和血凝抑制试验（HA和HI）（红细胞凝集和红细胞凝集抑制试验）血凝（HA）：病毒能够凝集某些种类动物红细胞的现象。 血凝抑制试验（HI）：病毒的血凝特性被特异性抗体所抑制的现象。null红细胞抑制凝集程度null具有血凝特性的病毒：正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒、细小病毒、肠道病毒、腺病毒 影响HA的因素：①pH ②温度 ③红细胞种类（三）补体结合试验（三）补体结合试验补体：指存在于人和动物新鲜血清中，具有类似酶的活性的一组蛋白质，当存在Ag-Ab复合物或其它激活因子时，可以被激活而表现杀菌及溶菌等，起到补助和加强吞噬细胞和抗体等防御能力的作用，故名补体。null原理： 检验系统：已知Ag(Ab)+ 被检Ab（Ag）+补体 指示系统：绵羊红细胞，溶血素 特异性病毒抗原和相应的抗体结合形成免疫复合物时能结合补体，因此加定量的补体于抗原抗体的反应系统中，补体被结合，不再以游离形式存在，此时，如再加入另一抗原抗体系统（羊红细胞和溶血素），则后者因缺乏游离的补体参与其溶血反应，结果不溶血，称为阳性反应。如被测系统中没有病毒抗原或没有病毒抗体结合，不形成复合物，则加入定量的补体仍以游离形式存在，再加入红细胞和溶血素系统，补体即参与作用而显溶血，为阴性。null病毒抗原 + 抗 体羊红细胞 溶血素+补体+溶 血（阴性）病毒抗原 + 抗体（缺）+补体+羊红细胞 溶血素不溶血（阳性）病毒抗原（缺） + 抗 体+补体+羊红细胞 溶血素溶 血（阴性）（四）凝集试验 （四）凝集试验 1、概念 颗粒性Ag（如细菌、红细胞等）或表面载有Ag或Ab的颗粒性物质在电解质存在下凝集成团的试验。 常用的载体物质：聚苯乙烯乳胶、红细胞、炭素 、脂质体、皂土等null2、凝集试验的分类 1）根据致敏的物质的不同分为： （1）间接凝集试验（被动凝集试验） 将可溶性Ag吸附到载体颗粒表面（即致敏）与相应Ab所发生的凝集反应。 （2）反向间接凝集试验（反向间接血凝试验） 将Ab吸附在载体颗粒表面，与相应Ag所发生的凝集反应。null（3）间接凝集抑制试验（被动凝集抑制试验） 先将被检的抗原与已知的抗体作用后，再与已知抗原致敏的颗粒进行反应。 （4）反向间接凝集抑制试验 先将被检的抗体与已知的抗原作用后，再与已知抗体致敏的颗粒进行反应。null2）根据所用载体物质的不同分为： 红细胞凝集试验(间接血凝试验） 乳胶凝集试验 炭凝集试验 皂土凝集试验 脂质体凝集试验null3）红细胞凝集试验   红细胞作为载体的优点： （1）来源广泛，容易取得。 （2）红细胞表面几乎可以吸附任何一类的Ag或Ab。 如蛋白质、糖蛋白、核蛋白质以及多糖等。 （3）红细胞具有天然的均一性，比其他许多载体都容易规格化和标准化。null缺点：容易破裂，难于保存。但可通过红细胞醛化得以解决，醛化红细胞结合Ag or Ab后，加入适当的保护剂并真空冻干，可长期保存。null4） 乳胶凝集试验 （LAT） 以乳胶作为载体的凝集试验。 PRV、PPV、PRRSV伪狂犬病乳胶凝集试验（LAT）伪狂犬病乳胶凝集试验（LAT）上图：伪狂犬病LAT诊 断试剂盒 下图：LAT检测猪伪狂 犬病血清抗体（五）琼脂扩散试验（免疫沉淀反应、凝集沉淀反应）（五）琼脂扩散试验（免疫沉淀反应、凝集沉淀反应） 可溶性Ag和相应Ab在含有电解质的琼脂凝胶中扩散相遇，特异地结合形成肉眼可见的线状沉淀物。 null琼脂双相扩散的沉淀线判定Ag: 抗原 S1、S2、S3、S4为被检血清 +为阳性血清对照 —为阴性血清对照（六）对流免疫电泳（六）对流免疫电泳原理：Ag和Ab的等电点不同，在pH偏碱的环境中，Ag所带负电荷多，电泳时向正极泳动，Ab所带负电荷少，电泳时向负极移动。如果两者对应且比例适当，即可在相遇处形成一条白色沉淀线。 在琼脂凝胶板的一对或多对孔中，分别滴加Ag和Ab随后通电电泳。 null-+AgAb对流免疫电泳示意图（七）免疫荧光技术（FA）（七）免疫荧光技术（FA） 将抗原或抗体标记上荧光色素，如异硫氰酸荧光素，再进行抗原-抗体反应，由于荧光色素在紫外光或蓝紫光的照射下，激发出可见的荧光，因此出现荧光就说明标记物的存在，同时也反映了抗原或抗体的存在。 对于病毒抗原标记比较困难，常用标记抗体检测未知抗原，又称为荧光抗体技术。null猪瘟病毒感染细胞荧光染色 猪瘟感染猪扁桃体隐窝荧光染色 猪瘟感染猪扁桃体隐窝荧光染色猪瘟、细小病毒混合感染细胞荧光染色猪瘟、细小病毒混合感染细胞荧光染色（八）放射免疫测定技术（八）放射免疫测定技术 用放射性同位素标记已知Ag or Ab，用以检测被检材料中相应的Ab or Ag，随后根据Ag-Ab复合物中的同位素放射性强度进行定性或定量的测定。（九）免疫酶技术（九）免疫酶技术 用酶标记抗体或抗原，用以检测被检材料中的抗原或抗体。结合在免疫复合物上的酶，在遇到相应的底物时，催化无色的底物，使其水解、氧化或还原，生成可溶性或不溶性的有色产物。null※酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA） 以辣根过氧化酶作为标记物，它催化过氧化物（H2O2）分解，产生原子态（O），后者使底物（邻苯二胺）中的供氢体氧化，使其生成有色的氧化型染料。gG-ELISAgG-ELISA{全病毒 抗原{gG蛋白 抗原阳性血清(全病毒)阳性血清(全病毒)阳性血清(gG缺失)阴性血清阳性血清(gG缺失)阴性血清1280 640 320 160 80 40 20 10第二节 病毒病的分子生物学诊断第二节 病毒病的分子生物学诊断一、 概述 常用的分子生物学诊断技术包括：基因组电泳分析、DNA酶切图谱分析、核酸杂交、聚合酶链反应（PCR）等。 分子生物学诊断的特异性取决于核酸序列的特异性。二、分子杂交技术 （核酸杂交检测技术）二、分子杂交技术 （核酸杂交检测技术） 1、概念 利用放射性物质或非放射性物质标记的已知特异性核酸片段作为探针，检测标本中与探针有相同序列的目的核酸。 null2、原理 核酸双螺旋分子在高温和变性剂存在的情况下可以解链成单链分子，在低温时又可以依据碱基互补原则复性形成双链，如果在复性时加入标记的探针分子，探针与待测核酸分子中相同序列互补形成带标记的双链分子，利用放射自显影或其它方法示踪，当样品中存在与探针相同序列的核酸分子时，即显阳性结果。null3、核酸探针 1）概念 经过放射性物质或非放射性物质（地高辛、生物素）标记的已知序列的特异性核苷酸片段。 2）探针的特异性 选择待测病毒核酸的特异性片段。null3）探针的大小： 0.3-3kb左右 太小，标记率不高，影响其敏感性 太大，则易出现非特异性杂交 但用于原位杂交的探针一般选择几十个核苷酸，以减少探针进入细胞时的阻力。null4、分子杂交的主要步骤 主要包括样品处理、预杂交、杂交、测定（放射自显影、底物显色等）等。 1）样品处理：核酸提取、点样、核酸变性 2）预杂交：于含1%脱脂奶粉的预杂交液中65℃预杂交4~6h，目的在于减少非特异性杂交null3）杂交：于含20~80ng/mL探针的杂交液中68℃杂交12~24h 4）漂洗：用含0.1% SDS的SSC于室温或45~65℃中漂洗，以去除未杂交的探针，干燥 5）检测：放射自显影、底物显色、荧光测定null5、几种常用的杂交方法 1）斑点杂交：将病毒核酸点样在硝酸纤维素膜（NC）或尼龙膜上，直接进行杂交 2）转印杂交：主要用于病毒基因组酶切后的分析研究或较复杂样品的检测。即先将样品经凝胶电泳分离后转印至膜上，然后进行杂交。又分为检测DNA的DNA印迹（Southern blot)杂交和检测RNA的RNA印迹（Northern blot)杂交。技术分类技术分类1、Southern分子杂交与标记的DNA 或RNA杂交nullWestern蛋白质杂交技术（Western blot) 经过单项或双向电泳分离的蛋白质被转移到硝酸纤维素膜上，放射性或酶标记的抗体用来检测相应的抗原或蛋白质的存在。null3）原位杂交 主要用于细胞内病毒的检测和定位 是将细胞或组织切片固定于载玻片上，保持细胞的良好形态结构，经蛋白酶K处理以增加细胞膜和核膜的通透性，探针在合适条件下与细胞内的病毒核酸杂交。三、凝胶电泳技术三、凝胶电泳技术 1、原理 核酸和蛋白质等生物大分子在分子量大小和所带电荷方面存在差异，使其在电场中表现为泳动速度的不同，在电介质中形成各自不同的带，而使其分离开来。null 2、分类 根据所用载体不同分为：琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据电泳槽不同分为：圆盘电泳 垂直电泳 水平电泳null3、琼脂糖凝胶电泳 以琼脂糖作载体，常采用水平电泳分离、鉴定核酸。 4、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 以聚丙烯酰胺作为载体，多采用垂直电泳，可用于分离核酸（PAGE）和蛋白质（SDS-PAGE）。null建立的伪狂犬病-细小病毒二联PCR检测方法，可检测临床上这两种病毒的混合感染nullGST在Sf9细胞中的表达三、聚合酶链反应 （polymerase chain reaction，PCR）三、聚合酶链反应 （polymerase chain reaction，PCR） 1、历史 由Kary Mullis 1985年根据自然扩增理论建立 1987完成自动化操作 Kary Mullis 于1993年获得诺贝尔化学奖null2、PCR原理（体外酶促基因扩增） 靶DNA双链分子加热变性后解链形成两条单链，两条单链DNA分别经复性与两条引物互补结合，在四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs)存在和合适的条件下，由DNA聚合酶催化引物由5’ 3’扩增延长，每经过变性、复性、延伸一个循环，模板DNA量增加1倍，新合成的DNA链又可作为下一循环的模板，经过30~50个循环，可使原DNA量增加106~109倍。nullPCR开始的几个循环null 实际操作中，扩增效率往往低于理论值，这是因为DNA引物经多次循环被消耗，在下一次循环时，没有足够的引物与模板退火杂交。此外，经多次高温处理后，Taq DNA聚合酶的活性也会下降。null 3、引物 与欲扩增的目的DNA的两条单链的3’端分别互补的两条寡核苷酸链。长度以15-30nt为宜。null4、PCR的主要步骤 （1）模板的变性 通过加热（90-95℃）使DNA模板双链的氢键断裂，双链解离成单链DNA。 （2）退火 适当降温（42-62℃）使引物与其互补的模板在局部形成杂交链。 （3）延伸 72℃，在DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸底物（dNTPs)及Mg2+存在的条件下，引物延长，新链合成。 null5、常用PCR技术 1）普通PCR 2）巢式PCR（nested PCR) 由两对引物经两组循环完成。第一对引物（外引物）扩增出一条较长的产物；第二对引物以此为模板经二次循环扩增目的产物。较常规PCR更敏感。null3）半巢式PCR（heminested PCR) 使用一对外引物和一条内引物，在同一试管内完成反应。设计的内外引物Tm值相差较大，在开始20个循环时，使用较高的复性温度，此时仅外引物与模板结合，而在后40个循环中，用较低的退火温度，内引物可以与模板结合。其敏感性与巢式PCR相似，但一次完成操作。null4）反转录PCR（reverse transcriptase PCR, RT-PCR):在常规PCR前增加了一步从RNA到cDNA的逆转录过程。 5）多重PCR 用于多型别病毒的分型检测或同时检测几种病毒 试验中同时使用数对不同引物，为了检测方便，不同病毒或型别的目的产物长短要有一定差别。null6）原位PCR 指将固定于载玻片的组织或细胞经蛋白酶K消化后，在不破坏细胞形态的情况下，直接进行PCR，可用于病毒在细胞和组织内的定位检测，PCR产物一般经标记探针杂交来检测。伪 狂 犬 病 PCR 诊 断伪 狂 犬 病 PCR 诊 断1-4：病料中PrV 的扩增产物 M：MarkerM 1 2 3 4nullIVThe amplified product of NS1 gene by RT-PCR 1: Amplified product M: λDNA/EcoRI+HindIII猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的RT-PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的RT-PCR检测 M基因(615bp)N基因(468bp)null思考题 LD50、EID50、TCID50各代表什么？ 在作疾病诊断时，将处理的病料接种敏感细胞后，可以从哪几个方面来判定细胞中是否有病毒增殖？ 采用药物敏感试验鉴定病毒核酸型的原理是什么？ 进行病毒的分离鉴定需要做哪些工作？ 若某猪场送来一份病料要进行病原检测，请你设计一个实验将该工作完成。null什么叫血清中和试验？ 常用的血清学诊断方法有哪些？ 什么是噬斑？其原理是什么？ 什么是核酸探针？核酸杂交的原理是什么？ Southern杂交、Northern杂交和Western杂交各用于检测什么？ PCR的原理是什么？分为哪几步？每一步的作用是什么？ 用于检测核酸和蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳有什么区别？（PAGE、SDS-PAGE）多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备采用家兔免疫制备抗血清，三个月后制得特异性好，高效价的抗血清。血清琼扩效价为1：32。1. CAP-HS-BSA 2. BSA 3. CAP 4. CAP-HS-HAS 5. HAS 6. CAP-HS-HSAnull1F9单克隆抗体的类型鉴定 中央孔（7）为1F9腹水，外周孔（1-6）分别为羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、 IgM 、IgG的抗体McAb亚类的鉴定杂交瘤细胞染色体SP2/0细胞染色体氯霉素单克隆抗体制备与鉴定null4）探针的制备： （1）双链DNA探针 应用于制备DNA病毒探针。双链DNA病毒基因可直接经酶切后克隆特定片段，对于单链DNA病毒则首先合成互补的双链DNA，然后酶切、克隆，制备探针。 （2）cDNA探针 制备RNA探针时需先逆转录合成cDNA，然后克隆特异片段制备探针。null（3）RNA探针 可通过直接将克隆的病毒基因经体外转录和标记制备。 优点：RNA探针的特异性更高，因为RNA/RNA或RNA/DNA较DNA/DNA杂交体稳定。 缺点：RNA探针本身不如DNA探针稳定，容易被RNA酶降解。 （4）寡核苷酸探针 人工合成特异性病毒DNA片段