PCR技术在目的基因定点突变方面的应用

PCR技术在基因定点突变方面的应用 中文摘要 利用重叠延伸PCR定点突变技术，改变DNA序列碱基，实现单一位点 双位点及多位点突变的目标，以及PCR定点突变的改进技术，是研究基因的调控机理和表达产物蛋白质的功能和蛋白质、基因工程中经常使用的重要研究技术之一。 关键词 重叠延伸PCR；定点突变；双位点突变；大引物PCR 前言 定点突变( site directed mutagenesis，SDM) 技术可以根据需要在已知DNA 序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。目前常用定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR 介导的定点突变及盒式突变[1]。其中PCR定点突变通过聚合酶链式反应向目的DNA片段中引入所需变化,包括单位点、双位点及多位点突变[2],用得比较广泛的突变技术是重叠延伸PCR 法(overlap extension PCR)。PCR的定点突变技术具有突变效率高、操作简单、耗时短、成本低廉等优点，运用广泛、灵活。不仅能实现基因定点突变，还能实现大片段的插入及删除，使得在基因功能研究中，对基因进行突变，以研究其功能和结构的改变变得更为实用。 一、重叠延伸PCR定点突变 1. 重叠延伸PCR单位点定点突变(三轮PCR) 此法是通过3个PCR反应[3]来完成的（如图1）。以目的基因为：用正向侧引物F和突变引物Rm进行PCR1扩增，产物含突变位点及其上游片段；用反向侧引物R和突变引物物Fm进行PCR2扩增，产物含突变位点及其下游片段，PCR1和PCR2分别进行，产物回收纯化后等比混合作为模板，用正、反向侧引物F1和F2进行PCR3扩增,在此反应退火过程中,具有3’末端互补序列的异源DNA产生链间退火并各自提供3’羟基作为引物沿另一DNA链延伸，产物即为引入了目的突变的片段[4]。例如中南大学生殖与干细胞工程研究所戴灿、苗聪秀、卢光琇等人[5]以插入人CDCA8 基因正常启动子片段的基因质粒pGL3-269为模板，采用重叠延伸PCR定点突变技术快速准确地将CDCA8启动子上的一个NFY结合位点成功突变。 图1 重叠延伸PCR 定点突变图 (黑点为突变位点) 此法要求两个突变引物在相同位置的碱基发生改变 两突变引物反向互补配对，长度一般在20bp-30bp间。 可以在所设计引物5’端加入合适的限制性内切酶位 点,为PCR扩增产物后续的克隆提供方便。 2、重叠延伸PCR多位点定点突变 以双位点突变为例，可以在单位点定点突变的基础上，以单位点定点突变成功的目的片段为模板，再设计一个突变位点引物对，重复上述操作即可达到目的。即采用多轮重叠延伸PCR能够构建多位点的定点突变[6]。 但是这种重复操作比较耗时费工，效率就降低了。徐景、张跃灵、张 妍、赵宝华、鞠建松等人[7]利用重叠延伸PCR技术构建定点双突变，对嗜酸热脂肪杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)Tc-l2-31的甘露聚糖酶基因AamanA中两个可能的活性位点El51和E23l进行双点突变，有无引物和有引物两步PCR，扩增得全长DNA，改进了重叠延伸PCR多位点定点突变技术。方法是假设目的基因上要突变的位点为E、F两位点，E在F上游，分别在这两位点设计一对反向互补的含有碱基突变的引物记为E1、E2、F1、F2，并设计目的基因上下游引物A、B。（1）以含目的基因的片段为模板，分别以引物对A/E1,E2/F2,F1/B进行PCR，分别获得abc三个DNA片段；（2）利用DNAshuffing[8]小片段延伸扩展获得全长DNA片段原理,以a+b,b+c,a+b+c三种方式组合进行无引物PCR扩增。回收的PCR产物作为后续PCR反应的模板，以A和B为外侧引物，扩增获得全长DNA。这种改良的重叠PCR技术，经济、简便、高效，更具有普遍实用性，在分子生物学领域中具有较高的应用价值。 3、大引物PCR 法,（二轮PCR） 基因点突变分析中应用最广的是大引物PCR 法，是1989 年Kammann[9] 建立的一种方法，即以第1轮PCR中产生的含点突变的产物做引物进行第2轮PCR 反应，三种引物包括目的基因两外侧上下游引物和中间含突变点引物，含突变点引物可与另两种引物之一进行第一轮PCR，所得产物作为大引物加上剩余的另一种引物进行第二轮PCR。 许多研究者对这一方法又进行了改良和优化，如设计具有明显不同Tm 的引物,控制反应温度，省略大引物的纯化步骤，使反应在一个管中进行，高保真酶的使用等[10]，减少了操作步骤，降低了成本，效率很高。 二、结论 　重叠延伸PCR定点突变其优点是操作较简单，突变的成功率较高，成本比使用试剂盒低，普通的分子生物学实验室即可完成。但它亦有缺点:①PCR反应中在引入目的突变的同时也有可能引入其他的随机突变，出现错误掺入的碱基,即错误倾向PCR[11],实际上重叠延伸PCR定点突变可以认为是错误倾向PCR定向优化设计，突变产物克隆后要经测序, 以排除目的突变位点之外的其他随机突变。在PCR操作过程中,使用高保真酶并优化PCR 反应条件,可以减少碱基错配概率；②后续工作较复杂,耗费时间，PCR扩增产物通常需要连接到载体上,然后才能对突变的基因进行转录、转译等方面的研究[12]。 参考文献 [1] 张浩,毛秉智.定点突变技术的研究进展[J].免疫学杂志2000,16(4):108～110　 [2] 曹阳,李冬田,尹冰杨等.重叠延伸PCR方法的建立与应用[J].河北医药, 2005,27(11):803～804 [3] 阳佳位,王淼,程春振,魏召新,陈凤娟.利用重叠延伸PCR定点突变衰退病P23 基因[J].西南大学学报(自然科学版),2009,31(12):43～47 [4] 王皓,康现江,王琦.重组PCR技术研究进展和应用[J].中国生物工程杂志, 2007,27(5):153～156 [5] 戴灿,苗聪,卢光琇等人.基于重叠延伸PCR 法的定点突变技术[J].现代生物医学进展,2010,10(3):411～412 [6] 何震宇,李月琴,林元藻.重叠延伸PCR对DNA片段进行定点双突变[J]．氨基酸和生物资源，2007,29(3):78～82 [7] 徐书景,张跃灵,张 妍,赵宝华,鞠建松,马延和.改进重叠延伸PCR技术构建定点双突变[J].中国生物工程杂志,2010，30(10):49～54 [8] Stemmer W P C. Rapid evolution of a protein in vitro by DNAshuffling. Nature,1994,370(4):389～391 [9]Kammann M ,Laufs J , Schell J , et al. Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction ( PCR)[J ] . Nucleic Acids Res , 1989 ,17 (13) :5404～5411. [10] 莫秋华,徐湘民,钟雄霖等.一种改进的大引物PCR定点诱变方法[J ] .中华医学遗传学杂志, 2002, 9(1) :68～71. [11] 徐卉芳,张先恩,张用梅.体外分子定向进化研究进展[J ] .生物化学与生物物理进展,2002,29(4):518～522 [12] J萨姆布鲁克, D W 拉塞尔. 分子克隆实验指南(3版)[M] .黄培堂译. 北京: 科学出版社, 2002: 51～72