来源于骨髓、外周血与脐带血的间充质干细胞生物学特性比较

{；：死震基础医学 -¨目纰 织 jm !研 究 ’j怖』术康 复 彩 73 誉 彩 4 5 助‘ 2009 — 1 1 — 05 出版 J ournalofC linicalR ehabilitative T issue E ngm eefingR esearch N ovem ber5 ， 2009 V 0 1． 13 ， N o ． 4 5 来源于骨髓、 外周血与脐带血的间充质干细胞生物学特性比较术 黄友章’， 沈建 良’， 寓立 众’， 尹 文杰 ’， 刘 毅 ’， 成 海。， 郑培浩’， 岑 坚 ’ C om parison ofbio logicalcharacteristics ofm esenchym alstem cells derived fro m bone m arrow ， peripheralblood and cord blood H uangY ou- zhang ’ ， S hen J ian— liang ’ ， G ong L i? zhong ’ ， Y in W en- jie’， L iu Y i’， C heng H al。． Z heng P ei． hao’． C en J ian’ ’D epartm entof H em atology, ‘D epartm entofB Iood T ransfusion ． Navy G eneralH ospitalof C hinese P L A ． B eijing 1 0004 8 C hina H uangY ou— zhang， A ssociate chief technician。 D epartm entof H em atology, Navy G eneraI H ospitalof C hinese P L A ， B eijing 10004 8 C hina huangyouzhang08@ yahoo corn cn S upported by：the S cient砺c R esearch P lan ofM inistryof H ealthandNavy L ogistics D epartm ent． No 200828203 ‘ R eceived：2009 — 06- 09 A ccepted：2009 — 09- 01 解 放 军 海 军 总 医 院 ， ’ 血 液 科 ， 。 输 血 科 ， 北 京市 1 0004 8 黄友 章 ， 男 ， 195 6 年 生 ， 湖 南省长 沙 市 人 ， 汉 族 ， 1992 年 中 国 科 技 大 学 毕 业 ， 副 主 任 技 师 ， 主要 从 事血 液 学 方 面 的 研 究 。 huangyO uznang 08@ yahoo． C O m C n 海 军 后 勤 部 卫 生 部 科 研 计 划 课 题 (200828203)’ ?}‘罔 分娄 呼：R 394 2 文献 标识 码：B 文 章编 号：1673 - 8225 (2009)4 5-08966- 05 收 稿 日期 ：2009 ． 06- 09 修 回 日期 ：2009 — 09 - 01 f200906090'4 ， Z S ‘ Q ) 8966 A bstract B A C K G R O U N D ：M esenchym alstem cells (M S C s)existin hum an tissues P resently， cellsource is single；culture m ethodhas greatdiffe rences；obtained results are notconsistent T hus， itcannotverfythatisolated andcultured cells are jdenticaJ cells． w hich is difficultco com pare ． O B J E C T IV E ：T o com pare the biologicalfeatures ofM S C s derived form bone m arrow (B M )， perpheralblood (P B )andcord blood (C B )underin vitro culture conditions． D E S IG N ， T IM E A N D S E T T IN G ：T he cytologicalin vitro controlledstudyw as perfo rm ed atthe D epartm entofH em atology。 N avy G eneralH ospitalofC hinese P L A from J une 2007 to D ecem be r2008． M A T E R IA L S ：A totalof10 donors ofhem opoietic stem celltransplantatio n atthe D epartm entofH em atology N avyG eneral H ospitalofC hinese P L A w ere selected． M B and P B cells w ere obtainedfrom the sam e donor， and cellvolum es w ere respectively 20 m L and 2 m L _C B cells (30 m L )w ere obtainedfrom healthyprim ipara atthe D epartm entofO bstetrics， N avy G enerafH ospitalof C hinese P L A ． M E T H O D S ： M S C s w ere obtainedfrO m B M ， P B and C B by P ercolIdensitygradient+ adherence m ethod． andthen incubated in D M E M ／F 12 m edium containing 10％ fetaIbovine serum W hen 80％ 90％ confluency cells w ere digested in trypsin． E D T A and m ade into 5 × 10。／L celIsuspension as P 0 A bove— describedoperation w as perform ed as P 1 andthe restm ay be deduced by analogyas P 2 一 P s． M A lN 0 U T C O M E M E A S U R E S ：T he follow ing param eters w ere m easured：cellgrow thm orphology；results ofW right． G iem sa staining；results ofcytochem istry：celI proliferation am ount：cellsurface m arkers usingflow cytom etry ． R E S U L T S ：T im e ofadherence． tim e to 50％ confluencyandtim e to 80％ confluencyofB M S C s w ere earliercom arpedw iththe P B M S C s and U C M S C s． A dherentcells from B M grew in w hirpool— like type ． w hile C B and P B did nolat5 7 days M ajorityof aderentcells from B M w ere fibroblast— like cells． and sm alIparts w ere endothelioidcells． A derenlcells frO m P B and C B atthe fifth generation contained m ore endothelioidcells and m ononuclear and m acrophage— like cells besides fibroblast— like cells． P A S stain， S udan blackB stain， alkaline phosphatase (A K P )stainingofadherentcells from B M ， P B andC B w ere negative from P 1 Io P 5 C om paredw ith P 0 cells， num berofB M M S C s lillP 5 w as significantlym ore in P B M S C s and U C M S C s (P ( 0． 05 ) P ositive rates of C D 29 ， C D 4 4 ． C D 90， C D 7 1 ， C D l05 ， C D l66 and H L A — A B C w ere 55 9％ 一 92 ． 8％ atP 0 to P 5 ， bul ≤ 6％ foIlow ing B M M S C s w ere incubated：19 17％ 33 ．4 ％ alP 0 to P 5 ， but ≤ 1 0％ follow ingP B M S C s w ere incubated；35 ．4 ％ 93 _2％ alP 0 to P 5 ， bul ≤ 20％ follow ingC B M S C s w ere incubated． P ositive rates ofC D 34 ． C D 4 5 and H L A — D R w ere low in B M - ． P B — andC B — M S C s． P ositive rates O fC D l4 andC D 3 1 w ere low in B M M S C s；12 1 ％ 283％ in P B M S C s， and8． 1 ％ 21 3％ in C B M S C s C O N C L U S IO N ：M S C s can be attainedfrO m B M ， P B andC B Q uantities ofM S C s form B M are the highest． w ithsingle com ponent． foIlow ed by C B M S C s and P B M S C s． w ith m ultiple com ponents H uangY Z ， S hen J L 。 G ongL Z ， Y in W J ， L iu Y ， C hengH ， Z hengP H ， C en J ． C om parison ofbiologicalcharacteristics ofm esenchym a stem cells derivedfrom bone m arrow ． peripheralblood andcord blood． Z hongguo Z ． uzhiG ongchengY anjiu yu L inchuang K angfu 2009 ；1 3(4 5 )：8966- 8970 ． [http：／／w w w ． crterca http：／／en zglckf． com 】 摘 要 背景 ： 问充质 干 细胞存在 于人体多种组 织 ， 目前研 究报道 所用细胞来源 单 一 ， 培养方法 差异大 ， 得 出的结果不 一 致 ， 彳i能证 明分离 、 培养出的细胞 是相 同的细胞 ， 难 以 比较 。 目的 ： 课 题 提 出在体外培养条件 F 可 对 同 一 ‘ 个体来源 的骨髓 、 外周血 来源 间充质干 细胞 及不 同个体脐 带血 来源 间充质 = F 细胞 的生物学特性进行 比较的理 论假设 。 设计 、 时间及 地点 ： 细胞学体外对照 观 察 ， 于 2007 — 06／2008— 12 在解 放 军海军总 医 院血 液科完成 。 材料 ： 解 放 军海 军总 医 院血 液科造 血 干 细 胞 移 植供者 10 例 ， 取 同 一 供者 的骨髓 、 外 周 血 细 胞 ， 细 胞 体积 分 别为 20 m L 与 2 m L 。 解放 军海 军总 医院产科 10 例健康初产 妇脐带血 细 胞 ， 细胞体积 为 30 m L 。 方 法 ： 采用 P ercoll密 度梯度 + 贴壁 法分离骨髓 、 外 周 血 、 脐带血 来源 的问充质 干 细 胞 ， 加入 含体积 分数为 10％胎牛血 清的 D M E M IF l2 培养基 。 当细胞 生长汇合至 80％ - 90％ 时胰蛋 白酶 一 E D T A 消化 ， 制成 5 × 108r 细胞悬 液 ， 计为 P 0 。 蘑 复上述 操 作 ， 即为 P 1 ， 依此 类推 P 2一 P 5。 主要 观 察指标 ： 细 胞 生 长形 态观 察 ， 细胞瑞 氏 吉姆萨染包结果 ， 细胞化学染色结 果 ， 细 胞增殖 数量 ， 流式细 胞仪检测细胞 表 面标记 。 结果 ： ①骨髓 间充质干 细胞 贴壁时问 、 汇 合至 50％ 时间 、 汇 合至 80％ 时问均早于外周 血 、 脐带血 间充质干细胞 ； 骨髓问充 质 干 细胞培养 5 - 7 d时呈 漩涡状 生 长 ， 而外周 InL、 脐带血 问充质干 细胞无此 生长 特性 。 ②初始培养和传代培养后 ， 骨髓间充 质 干 细胞多为成纤维样细胞 ， 仪有少量 内皮样细胞 ； 而传至第 5 代的外周血 、 脐带血 间充质干 细胞除育成纤维样细胞外 ， 还 有较多的内皮样细胞和单核 一 巨噬样细胞 。 ③ P ，一 P 5 骨髓 、 外周血 及 脐带血 来源 间充质干 细胞 P A S 染包 、 碱性磷酸酶染色 、 苏丹 黑 B 染色均呈 阴性 。 ④与 P 0 细胞 比较 ， 传代培养至 P 5 后骨髓问充质干 细胞增殖数量 明 显多于外周血 、 脐带血 间充质干 细胞(P < 0． 05)。 @ C D 29 ， C D 4 4 ， C D 90， C D 71 ， C D l05 ， C D l66 和 H L A - A B C 阳性率 ， 骨髓 间充质干 细胞接种后 ≤ 6％ ， 户O ． B ox 1200, S henyang 110004 kf233 85083@ sina． com 黄友 誊． 等 ． 求源 1i骨髓 、 外商 妞 与晴带血 的阃 充骚于 缩瞻生物学特性 比较 《亘f疋7易；i?～ ∞ 积 ． 。凹 P 0一 P 5 为 55 ． 9％ ~ 92 ． 8％ ； ~l- Jtd血 问充质 f= 细 胞接种后 ≤ 10％ ， P 0～ P 5 为 19 _7％ - 33 ． 4 ％ ； 脐带血 问充质 干纬1胞接利一后 ≤ 20％ ， P 0一 P 5 为 35 ． 4 ％ - 93 ．2％ 。 C D 34 ， C D 4 5 和 H L A - D R 刖性牢 ， 3 种米源 的间充质1I细 胞均 极低 。 C D l4 ， C D 3 1 阳性率 ， 骨 髓 问充质 = F：细胞 极低 ， 外周 血 间充质千 细 胞 为 12 ． 1％ - 28． 3％ ， 脐带 血 问充质干 细胞 为 8． 1％ - 21 ． 3％ 。 结论 ： 结果 显示和体外培养条件 F ， 肯髓 、 外周 血 和脐带血 均能较好地 形 成问充质干 细胞 ， 以骨髓来源 的问充质 千 细胞含 量最高 ， 成分 单 一 ， 而 脐带 血 和外周 血 含 量 次之 ， 细 胞成 分 多 。 关键词 ： 骨髓 ； 外周血 ； 脐 带血 ； 问充 质干细 胞 doi：10 ． 3969／j． issn ． 1673． 8225 ． 2009 ．4 5 ． 03 1 黄 友审 ， 沈 建 良， 宫立 众 ， p 文 杰 ， 刘毅 ， 成 海 ， 郑培浩 ， 岑坚 ． 来源 于 骨髓 、 外 周血 与脐带 m上的 问充 质干 细 胞 ￡E物 学特性 比较【J 】_中 }1日组 织 工 程研 究 。j临床康复 ， 2009 ， 13(4 5)：8966— 8970． 【http：H w w w ． cR er． org http：／／cn ． zglckf． com 】 0 引言 具有 自我 更 新和 多 向分化 潜 能 的 间 充质 干 细 胞 来 源 于 中胚层 ， 在骨膜 、 肌 肉 、 外周 血 以及 全 身结缔组织 等多处均有存在 ， 在细胞 移植及 组 织损伤修复工 程 中有 重要价值 【1q J 。 尽 管 目前有较 多关于骨髓 、 外周 血 、 脐 带 血 问充质干 细胞 的报道 ， 但 因研 究方 向 、 培养 条件不 同 ， 导致得出的结果 、 结论差异较大 【4 ．⋯ ， 尚未见 从 同 一 个体 来源 的骨髓 、 外周 血 、 脐带血 中在相 同条件下进行 问充 质干 细胞培养的 比较性报道 。 实验取 同 ‘ ‘ 个体来源 的骨髓 、 外 周 血 及 不 同个体脐 带血 细胞 ， 在体外采用 间充质干 细胞培养法 ， 动态观 察 并 比较它们 在问充质于细胞方面所表现 的基 本特性 。 1 材料和 方法 设计 ： 细胞 学体外对 照 观 察 。 时间及 地 点 ： 于2007 — 06／2008— 12在解放军海 军总 医 院血 液科完成 。 材料 ： 解放 军海军总医 院血 液科造 血 千 细胞移植供 者 10例 ， 取 同 一 供者 的骨髓 、 外 周血 (经 G — C S F 动 员 ， B xterC S 3000一 P lus分 离机收集)细胞 ， 细胞体积分别 为 20 m L 与2 m L 。 解放军海军总医 院产科 10例健康初产妇 脐带血 细胞 ， 细胞 体积 为30 m L 。 实验试剂 与仪 器 ： 实验试 剂 与仪 器 P ercoll分 离液 胎牛 血清 D M E M ／F 12 培养液 P A S 染色 试剂盒 、 苏丹 黑 B 染色试 剂盒 、 碱性磷酸酶'染色试剂盒 E pics X L - A D 25 17 流式细胞仪 来 源 P harm acia 公司 S tem cell公 司 G ibco B R L 公 司 上 海太 阳 ，卜物技术 仃限公 司 B eckm an C oulter 实验方法 ： 单个核细胞 的分离 ： 骨髓 、 外剧 血 、 脐带血 细胞适 当 稀释后 ， 经密度为073 g／cm 。 P ercoll分离液分离 ， 收集单 个核细胞 ， 用含体积分数为10％ 胎牛血 清 的D M E M ／F 12 |S S N 1673 — 8225 C N 21 ． 1 5397R coO E N ：Z L K H A H 洗涤后 ， 制 备成骨髓 单个核细胞 、 外刷血 单个核细胞和 脐带血 单个核细胞悬液 ， 调整细胞浓度备用 。 间充 质 干 细 胞 初 始 培 养 ： 取 1 X 10。 L 1 骨 髓 单 个核 绌 胞 、 外 周 血 单 个核细 胞 或脐 带 血 单 个核细胞 ， 加 入 含 体积 分 数 为 10％胎 牛 血 清 的 D M E M ／F 12培 养 液 ， 分 别 置 于 25 cm 。培养瓶 内 ， 5 m L／瓶(细胞 密度2x l05／cm 。)， 或24 孔培养板 内 ， 1 m U 孔 ， 于37 ℃ 、 体积分数为5 ％ 的C 0 2 中培养36 h后 第 1 次换液 ， 换液时用含体积 分数 为 1 0％ 胎 牛血 清 的 D M E M ／F 12反 复洗涤 ， 彻底去 除培养瓶 或培 养板 内非 贴 壁 细 胞 ， 于 37 ℃ 、 体积 分 数 为5 ％ 的 C 0 2下培养 ， 以后每周半量换液1次 。 当细胞 生长 汇 合至 80％ - 90％ 时 ， 2． 5 g／L 胰蛋 白酶 一 O ． 2 g／L E D T A 消化液消 化 ， 去除消化液 ， 制成5 x 10。 L 。 细胞悬 液 ， 计 为P 0 。 间充质干 细胞传代培养 ： 取 P 0细胞 5 m L ， 按5 x 10。 L “ 接种于25 cm 。培养瓶 内 ， 或取 1 m L 接种于24 4 L培养板 内 ， 或取2 m L 接种于 加载玻片 的6；fL培养板 内培养 ， 待 细 胞 生长汇 合至 80％ - 9 0％ 时 ， 胰 酶 一 E D -r_A 消化液消化 ， 用 含 体 积 分 数 为 10％ 胎 牛 血 清 的 D M E M ／F 12培 养 液将 细胞制成5 x 10。 一 细胞悬 液 ， 此 间充质干 细胞 为P ，； 将 所 有P 1细 胞重 复上 述 操 作 ， 即为P 2 ； 依此 类推 。 细胞形 态观 察 ： 从细胞接种至 培养瓶或培养板 内之 曰 起到培养结束 ， 每 日在倒置 显 微镜下 观察 。 细胞瑞 氏 一 吉姆萨染色 ： 取 上述各时段培养的64 L培养 板 内“ 爬 片细胞 ”玻 片 ， 行瑞 氏 一 吉姆萨 染色 ， 10x1 00显 微镜下按 “ 血 细胞形 态标准 ” 划分细胞 形态 。 细胞 化 学染色 ： 取 I二述 各时段培养 的6孔培养板 内“ 爬 片细胞 ” 玻片 ， 行 P A S 染色 、 苏丹 黑 B 染色 、 碱 性磷酸酶 染色 ， 观 察 阳性细 胞 和 阳性 反应 程度 ， 计算阳性率和秋 分 。 细胞计数 ： 从 P 0细胞传代起 ， 开始行细胞计数 ， 计数 细胞传至 P 5后 结束 ， 传代细胞足计5 x 10。 L - 1的P o细胞传至 P 5 后 细 胞 增 殖 的量 。 增 殖 倍 数 = 验 时细 胞 数／5 x 10。 L 一 ’ (接种时细胞数)。 流式细 胞仪检测 ： 取j-述 各时段培养 的细胞 ， 流式细 胞仪检测 细胞表面标志 表达 。 统计 学分析 ： 由第 一 、 二 作者采用 S P S S 10． 0统计 包 ， 计量资料用x+ s表示 ， 组 间差异 采用配 对 t检验 ， 当 P < 0． 05 时为差异有 显著性意义 。 8967 27易2 w w 砒 c尺rE 尺．。田 黄友章 ， 等 ． 来源 于骨髓 、 钋两缸 s聩带血 的阗充质于细胞生物学特性眈较 2 结果 2 ． 1 细 胞 形 态观 察 接种后 ： 骨髓 单个核细 胞 、 外周 血 单个核细 胞 和 脐 带血 单个核细胞 分散透 亮 ， 体积不大 ， 呈球形或类球形 ， 无伪足 。 初始培养 ： 骨髓 、 外周血 、 脐带血 问充质干细胞的贴壁 时间分别为3 d， 4 d， 4 d。 骨髓 间充 质千 细胞汇 合 至5 0％ 时间为 一 b_ J k灭 ， 外 周血 、 脐带血 间充 质干 细 胞均为 10- 13 d。 骨髓问充质干 细胞汇 合至 80％ 时 间为 12- 14 d， 外周 皿 、 脐带血 问 充 质 于细 胞均 为 18- 20 d。 传代培养 ： P o细胞接种历 ， 4 h内有细 胞贴壁 ， 24 h内完全 贴壁 并仲展 生长 ， 2 d内生 长缓慢 ， 2 d后细胞大量 扩增 ， 逐 渐铺满培养瓶或孑L的底 面 。 来源 于骨髓 的问充质干 细 胞 ， 5 - 7 d时呈 漩涡状 生 长 。 来源 于 外 周 衄 、 脐带血 的间 充质十 细咆 ， 7- 9 d仍无漩涡状 生长 。 2． 2 细 胞 瑞 氏 一 吉姆 萨染 色观 察 接种后 ： 骨髓单个核细胞 内主 要 为淋 巴 细 胞 ， 原 、 早 、 中性中幼粒细胞 ， 中 幼红细胞 ， 偶见原 、 早幼红 细胞和单核细胞 。 外 周 血 单个核细 胞和 脐 带血 单个核细胞 内主 要 为淋 巴 细 胞 、 单核细 胞 ， 未见其他细 胞 。 初始培养18d后 ： 骨髓来源 间充质干 细胞 以成纤维样细胞为主 ， 其次是 内皮样细胞 、 单核 一 巨噬样细胞 和脂肪细胞 。 外 周虹 来源 问充质千 细 胞 以 申． 核 一 巨噬样细胞 、 内皮样细胞为多 ． 成纤维样细胞较少 。 脐带血 来源 问充质干 细 胞 以成纤维样细胞 、 内皮样细胞 、 单核 一 巨 噬样细胞为多 ， 见表1 。 传代培养 ： P ，与P 5骨髓来源 间充质千 细 胞形态无变化 。 外周血 来源 间充质千 细 胞 随着传代次数的增加 ， 成纤维样细 胞和 内 皮样细胞增多 ， 而 单核 一 巨噬样 细 胞减 少 。 脐带血 来源 间充质干 细胞与外 闫血 来源 间充质干 细 胞相似 ， 见表2 。 表 1 T able l 初始培养 18d 不 刚来源 的间充 质十 细胞形 态学 比较 C om parison ofcellm orphologyof18dprim aryculture cells frO m bone m arrow ． peripheralblood and cord blood (k s， n= 10， ％ ) 。P < 0 ． 05 ． V S ． bone m arrow 8968 ┏ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ┓┃表 2 传代培养 P 1 与 P 5 不 同来源 的间充质干 细胞 形态学 比较 ┃┃T able 2 C om parison ofce llm orphologyofP 1 一 P s culture cells ┃┃from bone m arrow 。 peripheralbloodandcordblood ┃┃} (妞 s， n= 10， ％) ┃ ┣ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ┫┃【 ┃┃[ P ， ┃┃i ┃┣━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ┫ ┃； ce“appearance B one m a／T O W P er~D heraI blood cord blood ┃┣ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ┫ ┃F ibroblast- like cells 95 ． 3 + 5 ， 9 7 ． 1±3 ． 0 4 8．6士4 ．8 ┃┃E ndothetioidce lls 3 ．2~2．2 27 8~4 ．9 32 ． 6+ 4 ． 1 ┃ ┃ M acrophage— like ce lls ? 60 5 + 8． 5 16 ． 2+ 7 6 ┃┣ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ┫ ┃P 5 ┃┣━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━┫ ┃ cellappearance B O ne m arrow P er~D he raIblood cO rdblood ┃┣━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ┫ ┃F ibroblast． 1ike ce lls 96． 2+ 6 ． 9 29 ． 7 -+ 10． 9。 65 ．4 ~7 2。 ┃ ┃ E ndothelioidcells 2 6~1 5 52 2~89。 25 ． 8+ 7 3。 ┃┃M acrophage— like ce lls 一 15 7~6 ． 6。 8． 7+ 6． 6。 ┃ ┣━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━┫ ┃ 。P < 0 05 ． V S P ， ┃┗━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━┛2 ． 3 细 胞 增 殖 量 与 P 0细胞 比较 ， 传代培养至 P 5后骨髓 、 外周 血 及 脐 带血 来源 间充质 干 细 胞 数量 分别增殖(62 ． 2+ 3 ． 8)， (33 ．6+ 2 ． 1)， (39 ． 5 + 2． 3)倍 ， 差异有显 著性意义(P < 0 ． 05)， 见 图1 。a)E卜_ P 1 P 2 P 3 P 4 P 5F igure 1 C om parison ofproliferation ofm esenchym alstemcells from bone m arrow (B M )， peripheralblood (P B )and cord blood (C B )图 1 传代培养 P 1 - p5 不 同来源 问充质十 细胞增 殖 靖 的 比较2 ．4 细 胞 化 学染 色接种后和初始培养 ： 骨髓来源 问充质干 细胞 P A S 染色 后 阳性细胞 占(2 ． 2+ 1 ． 8)％ ， 强度 为 + ； 碱性磷酸酶染色 利 苏丹黑 B 染色后呈 阴性 。 外剧血 及脐带血 来源 问充质 干 细胞上 述3种染色均呈 阴性 。 传代培养 ： P ，- 9 5 '骨髓 、 外周血 及 脐带血 来源 间充质 干 细胞上 述 3种染色均呈 阴性 。 2 ． 5 不 同来源 间充质干 细 胞表面 抗 原 的表达 骨髓 来源 间充质干细胞 ： 接种后细胞 C D 29 ， C D 4 4 ， C D 90， C D 71 ， C D l05 ， C D l66和 H L A ． A B C FH 性率<- 6％ 。 P 0- p5 阳性率为55 ． 9％ - 92． 8％ 。 与P 0比较 ， P 5 阳性率明 P 0 ． B ox 1200, S henyang 110004 cn ． zglckfcom 黄 友章 ． 等． 来源 于骨髓 、 外 商 毂 s脐 带 血 的润 充质于 细 瞻 生物学特性 比较 2死零 W W W ． C R T E R ． org 显 增高f尸 < 0． 05 >； ‘j接利，后 比较 ， P 0 ， P 3 ， P s阳性率 明显 增 高(P < 0 ． 05)。 接种后 、 P 0～ P 5细 胞C D 34 ， C D 4 5 ， C D l4 ， C D 3 1 ~D H L A — D R I；[I性率均≤5 ％ 。 外周血 来源 间充质干细 胞 ： 接种后 细胞 C D 29 ， C D 4 4 ， C D 90 ， C D 71 ， C D l05 ， C D l66和 H L A ． A B C 阳 性 率 s 1 0％ 。 P 0一 P 5 阳性率为 19 ． 7％ - 33 ． 4 ％ 。 与 P 0比较 ， P 5 1；H 性率明显 增 高(P < 0 ． 05)； 与接种 后 比较 ， P 0- P 5 阳性率 明显 增 rn ‘ ． 1 (P < 0 ． 05 )。 接种后 、 P 0一 P 5 细l胞 C D 34 ， C D 4 5 和 H L A — D R f5Jj性 率均s4 ％ 。 接 种后 细胞 C D l4 ， C D 3 1 阳 性 率s10％ ， P 0分 别升 至 (38． 1±5 ． 1 )％ 和 (4 2 ． 3 + 4 ． 4 )％ ， P 5 又分别降至 (12 ． 1±3 ． 2)％51- I(28． 3 + 6 ． 2)％ 。 脐带血 来源 间充质干 细胞 ： 接种后细胞C D 29 ， C D 4 4 ， C D 90 ， C D 71 ， C D l05 ， C D l66和 H L A - A B C 阳 性 率 s 20％ 。 P o~ P 5 阳性率 为3 5 ． 4 ％ - 93 ． 2％ 。 与P o比较 ， P 5 阳 性率 明显 增 高(P < 0 ． 05 )； Lj接种后 比较 ， P o— P 5 阳性率 明显 增高(P < 0 ． 05)。 接种后 、 P 0- p5细胞 C D 34 ， C D 4 5 和 H L A — D R ⋯性 率均≤4 ％ 。 接种后 细胞 C D l4 ， C D 3 1 阳 性率s8％ ， P 0分别升至 (16 ． 1±4 ． 6)％ 4~H (3 1 ． 3 + 5 ． 1 )％ ， P 5 又 分别 降至(8． 1±4 ． 6)％ 和 (21 ． 3 + 5 ． 8)％ 。 不 同米源 问充质 干 细 胞 表 面 抗 原 表 达 的 比 较 见 表 3 。 4 。 ┏ ━━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━┓ ┃ 表 3 接种后 与传代培养 P o细 胞表 面抗 原表达 的 比较 ┃┃ T able 3 C om parison ofcellsurface m akers ofbone m arrow ． ┃┃ peripheralblood， cordbloodcells follow ingincubation ┃ ┃ andatP 0 (矗 s， n= 10， ％) ┃┣ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ┫┃ C ellsu内 ce M ononuclear cells ┃┣ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ┫ ┃ a州 gen B O ne m arrow P eriD heraI blood cordblood ┃┣ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ┫┃ C D 29 2． 2+ 1 ． 9 0． 1±0 ． 1 1 1 ． 6：1：4 8 ┃ ┃ C D 90 3 2+ 2． 2 0． 8~2 9 1 4 ． 6~4 1 ┃ ┃ C D 4 4 5 ． 7+ 3 ． 6 87+ 6 ．6 5 5 + 4 ． 6 ┃ ┃ C D 71 4 ．4 + 2． 8 1 8+ 1 ． 1 182+ 8． 3 ┃ ┃ C D l05 2． 8+ 0 3 0． 5~0． 3 0 9~0 ． 8 ┃ ┃ C D l66 3 9~2． 8 0．6~0． 1 16 4 + 4 ． 3 ┃┃ H L A -A B C 6 2+ 1 ．6 5 ． 3~1 ． 2 5 ． 0+ 4 2 ┃┃ C D 34 1 ． 9~0． 8 1 ． 2~0 7 1 ． 6+ 0． 5 ┃┃ C D 4 5 1 2+ 0． 3 0． 8+ 0 ． 1 1 ． 1±0 3 ┃┃ H L A - D R 3 ． 8+ 0． 5 3 ． 5~0 ． 2 3 6~0 ． 5 ┃ ┃ C D l4 4 ． 1±1 3 88+ 5 ． 3 7 2~3 5 ┃┃ C D 3 1 3 ． 2+ 1 ． 3 6 ． 3 + 2 3 4 ． 1 ±1 9 ┃ ┣━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━┫ ┃ C ellsu向 ce P 0 ┃ ┣━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━┫ ┃ a嘣 ge几 B O ne m arrow P eriD heraI blood cO rdblood ┃┣ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ┫ ┃ C D 29 89 2~6 ． 9 19 ． 7~10 ．9 35 ． 4 ~7 ． 2 ┃ ┃ C D 90 82 ． 6+ 7 ． 5 22 ． 2+ 8． 9 35 ． 8~7 ． 3 ┃ ┃ C D 4 4 582+ 7 ．6 30 ． 8~9 9 3 6 2~8 1 ┃┃ C D 71 70 ． 2+ 8． 8 28． 2~10 ．4 782~12 ． 5 ┃┃ C D l05 78．4 + 6． 6 33 ．4 + 6 3 4 3 ． 5~9 4 ┃ ┃ C D l66 55 ． 9~8． 2 25 2~4 ．3 5 1 ． 3~5 1 ┃ ┃ H L A _A B C 59 ． 1±9 ． 2 5 8． 9 + 8． 1 5 5 ． 0~7 2 ┃┃ C D 34 0 9~0． 7 0． 3~0． 2 0． 4 ~0 ． 3 ┃┃ C D 4 5 0．6~0． 1 0． 4 ~0 1 0 5~0 ． 1 ┃ ┃ H LA — D R 3 ．6~0 3 3 0~0．5 3 8±0． 6 ┃ ┃ C D l4 2．4 ~1 ． 2 38． 1 ±5 1 16 ． 1±4 ． 6 ┃ ┃ C D 3 1 2 9 + 1 ．4 4 2 3~4 ．4 31 ． 3~5 1 ┃ ┣ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━┫ ┃ ┃┗ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ┛ |S sN 1 673 — 8225 C N 21 - 1 539fR coD E N ：Z L K H A H ┏━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ┓ ┃ 表 4 传代培 养 P 1 【JjP 5 细 胞 表断抗 原表达 的 比较 ┃┃ T able 3 C om parison ofcellsurface m akers ofbone m arrow ， ┃ ┃ peripheralbloodandcord bloodcells atP I P s ┃ ┃ (x+ s， n= 10， ％ ) ┃┣━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ┫ ┃ C eII su向 ce P 1 ┃┣━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ┫ ┃ a嘣 ge 兀 B O ne m arrow P eriD heraIblood C ordblood ┃┣━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ┫ ┃ C D 29 9 1 ． 1±7 ． 6 29 ． 5~9 ． 7 4 5 ． 5~8． 3 ┃┃ C 0 90 88． 6~9 ． 5 286+ 4 ．8 4 7 ． 4 ~6 ． 6 ┃ ┃ C D 4 4 5 7 ． 2~5 ． 6 35 ． 6~7． 9 4 5 ． 8±7 ． 1 ┃ ┃ C 0 7 1 75 ． 2~8． 8 282+ 10 ． 4 82． 2+ 1 2． 5 ┃ ┃ C D l05 82。 3 + 7 ．2 38． 9~5 ． 6 50 2+ 5 ．6 ┃ ┃ C D l66 63 ． 5 + 8．2 39 ．4 ~5 7 52 2~7 ． 5 ┃ ┃ H L A ． A B C 67 ． 3 + 8．2 65 ． 8~7 2 680~9 ． 2 ┃ ┃ C D 34 0 3~0 ． 2 0． 2+ 0 ． 1 0 2+ 0． 1 ┃ ┃ C D 4 5 0 5~0 ． 4 0．2~0． 1 0 2+ 0． 1 ┃┃ H L A ． D R 3 3~0 6 3 ． 9~0 5 3 ．8+ 0． 7 ┃┃ C D l4 1 ． 1±0 3 3 1 9~5 ． 1 11 2+ 3 ． 5 ┃ ┃ C D 3 1 3 2~1 3 4 3 ． 4 ~5 1 30 ．2~5 ． 9 ┃┣ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ┫┃C ellsurface P 5 ┃ ┣━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ┫ ┃antigen B O ne m arralw P eriD heraIblood C O rdblood ┃ ┣ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━┫ ┃ C D 29 92． 8~8． 9 32 ． 5~4 ． 6 5 8． 7~8． 2 ┃ ┃C D 90 9 1 ． 3~10 ．3 33 ． 9~4 ． 9 60 ． 5~83 ┃┃C D 4 4 66 ． 7~2 3 4 8． 7~6 ． 6 52 ． 2~9 ． 3 ┃┃C D 71 84 ．4 ~12 8 32 ． 8~9 ． 1 93 ．2~14 ． 6 ┃ ┃C D l05 90．4 + 8． 7 4 5 ． 9 + 7 ． 1 65 7~86 ┃┃C D l66 85 ． 1±9 5 55 ， 6~8． 3 76， 4 ~9 ． 1 ┃┃H L A - A B C 86 ． 5~7 6 88． 9 + 8 1 85 0+ 9 ． 2 ┃ ┃C D 34 0 2+ 0 1 0 0． 2~0． 2 ┃ ┃ C D 4 5 0． 3~0 2 0 2~0 ． 1 0 ．2+ 0． 1 ┃ ┃H L A ． D R 3 8~0 5 3 ． 7~0．6 3 ． 7+ 0． 6 ┃ ┃ C D l4 0 ． 3 + 0 2 12 ． 1±3 ．2 8． 1±4 ． 6 ┃┃C D 3 1 2 ． 9 + 1 ．4 283~6 ．2 21 3 + 5 ． 8 ┃ ┣━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━┫ ┃ ┃┗ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ━━━ ━ ━━ ━ ━━ ━ ┛3 讨论3 ． 1 间 充质 干 细 胞 的培 养和 传 代 『白J 充质干 细胞 的培养和传代影 响 因素诸 岁 卜 ¨ J ， 首先涉 及 到 的是细 胞 分离液 ， 因为不 同 比重 分离液分离得到不 同密度 范围的单个核细胞 。 实验采用 1 ． 073 g／cm 。密度梯度 离心 结合全 量换液狭得 的贴壁 细胞 ， 问充质干 细胞纯度 高 ， 呈 均 一 性 。其 次是培养体 系 ， 问充质干 细胞 的培养体系有专职 培养体 系(如 M esencuh T M 培养 体 系)乖1含体积 分 数 为 10％胎牛血 清 的 D M E M ／F 12培养体系等 ， 尽管认 为专职 培养体 系适 合 问充质干 细胞 生长 ， 但培养体系成 分未公开 ，难 以 比较与分析 ， 所 以普遍采用 含体积分数为 10％胎牛血 清的 D M E M IF l2作为问充质干 细胞 的培养体系 。 再次是接种 的细胞密度 ， 细胞密度对 培养细胞 的生长速度和分化状态影 响明显 ， 尤其是初始培养 的人体细胞 。 实验在初始培养时采用2x 105／cm 。密度接种细胞 ， 36 h全量换液 ， 去除全 部非贴壁细胞 ； 传代培养时用 1 x 105／cm 。密度接种细胞 使其扩增 ， 消化 时用2． 5 g／L 胰 蛋 白酶并尽量缩短作用 时间 ， 减少对 细胞 的刺激 。 8969 27易疋w 州 cR 职 硼 黄友章 ． 等 ． 来源 I『骨髓 、 钋嗣电 s磷带血 的翘充疆于细瞻生物学特性 比较 3 ． 2 间充质 干 细 胞 的生 物 学特性 目前 尚未发现 问充 质干细胞特异 的生物学特性 ， 一 般认为培养时细胞生长 达到适 当密度时呈 漩 涡状贴壁 生长或平行排列 ， 形态学 似 “ 成 纤维样细 胞 ” 样(胞 浆丰富 ，核染色质 网状 ， 核仁 明 显 )； P A S 、 碱性磷酸酶染色和 苏丹黑 B 染色均表现 为阴 性 ； 高表达 C D 29 ， C D 4 4 ， C D 7 1 ， C D 90 ， C D l05 ， C D l20a， C D l24 ．~1J C D l66等 ， 而 不表达 C D l4 ， C D 3 1 ， C D 34 和 C D 4 5等细胞表面抗原【1Ⅲ ‘ Ⅲ j 。 实验结果表 明 ， 符 合间充质干 细胞特性者 以骨髓来源最高 ， 脐带血 次之 ， 外周血 最低 ， 同时发现 脐带血 ~NJ ,b周血 来源 间充质干 细 胞 含有较 多的 内皮样细胞 和 单核 一 巨噬样细胞 ， 也说 明 不 同来源 的问充质干 细胞具有不 同的生物学性质 ， 包括 免疫表型 、 增 殖和 分化 能力 。 3 ． 3 间充质 干 细 胞 的应 用 种子细胞 的选择 是造 血 干 细 胞 移植及 组织 工 程最基 本 、 关键 的环 节之 ， 理 想 的 种子细胞应具 备取材容易 、 体外培养 时增殖 能力强 、 能 稳定表达 细胞表 型 、 植入 体 内后 能继续发挥 日的细胞 的 作用 。 问充质干 细胞 的生物学功能有 ： ①组织工 程 中的 种子细胞 。 ②基 因治疗 的靶细胞 。 ③支持造 血 。 ④抑制 免疫 。 所 以 目前 问充质干 细 胞在 治疗研 究 中主 要 应 用 于 移 植(局 部或 系统移植)、 结合干 细胞 的基 因治疗和 组 织 工 程 领 域 。 研 究者 一 致 认 为 问充质 干 细 胞 在骨髓 有 核 细胞 中含量 约 为 1／1 0。 ， 脐 带血 中的间充质干 细 胞含 量丰 富r。7 - 21 ] , 也有研 究认 为并不 是每份脐带血 都能培养 出间充质干 细胞 ， 外周 血 含量 很少 。 实验 结果提 示 ： 骨 髓是可 靠 的问充质干 细胞来源 ， 体外具有很 强的增殖 能 力 ， 可 以大量扩增和 长 期培养 ， 传代稳定 ， 且 长 时问保 持其未分化状态 ； 脐带血 和 经动 员剂动员后外周 血 中含 有较 多或 一 定数量 的间充质干 细胞 ， 同时也含有 一 定量 的单核 一