双峰驼诱导排卵机理的研究

双峰驼诱导排卵机理的研究 .Ⅱ . 双峰驼诱导排卵因子的靶器官及代谢动力学 潘光武1，谢庆阁1，才学鹏1，汪 静2，邓敬兰2，刘湘涛1，潘元青3，陈北亨4 （1中国农业科学院兰州兽医研究所，兰州 730046；2第四军医大学西京医院，西安 710032； 3兰州医学院，兰州 730010；4甘肃农业大学，兰州 730070） 摘要：应用同位素示踪技术，将公驼精清内的诱导排卵活性蛋白（OIP）经125 I标记后输入母驼阴道。示踪结果 证明，OIP经阴道前端主动吸收，很快进入血液循环，其代谢动力学属于一级吸收二室开放模型，吸收速度常数（ka） 为 0 . 067·min- 1，吸收半衰期 10 . 24 min，于 23 min达峰浓度（Cmax）5 . 15µg·ml - 1，清除半衰期（t1 / 2 k）较长为 72 . 6 h；从 DEAE-DE52柱上洗脱的活性蛋白吸收后，不经过脊髓和卵巢反馈通路，而是经血液循环直达脑髅内的靶器官 垂体，从而引起母驼释放促黄体素（LH），至峰值出现，诱导母驼排卵。 关键词：双峰驼；诱导排卵因子；靶器官 Study on OvuIation Inducing Mechanism in Bactrian CameI Ⅱ Target Organ of OvuIation Inducing Factor（OIF）and Its MetaboIic Dynamics in Bactrian CameI PAN Guang-wu1，XIE Qing-ge1，CAI Xue-peng1，WANG Jing2，DENG Jing-lan2， LIU Xiang-tao1，PAN Yuan-qing3，CHEN Bei-heng4 （1 Lanzhou Veterinary-Medicine Research Institute，China Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730046； 2 Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi’an 710032；3 Lanzhou Medical College， Lanzhou 730010；4 Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070） Abstract：The main site for active absorption of OIF is situated in the anterior vagina after insemination of ovulation inducing bioactive protein（OIP）from seminal plasma in male camel which was iodinated with 125 I of isotope. OIP is assimilated quickly into the blood circulation and its metabolic dynamic pattern belongs to the first order absorption and 2 compartment open model，absorbent rate constant（ka）was 0 . 067·min- 1，ab- sorbent period of the half life（t1 / 2 ka）was 10 . 24 min，calculated peak concentration 5 . 15µg·ml - 1 appeared at 23 min after administration of OIP，Elimination of the half life period（T1 / 2 k）needs a long time of 72 . 6 h . OIP eluted on DEAE-DE52 column is directly reached to target gland pituitary in the crania via the blood circulation after insemination and absorption instead of regulation by the cerebro-spinal fluid system or ovaries feedback mechanism，Thus resulting in a preovulation peak of LH in female camel. Key words：Bactrian camel；Ovulation inducing factor；Target organ 收稿日期：2002-06-10 基金项目：国家自然科学基金资助项目（39270534，39670539）；兰州兽医研究所所长基金资助项目 作者简介：潘光武（1944-），男，甘肃兰州人，研究员，主要从事双峰驼生殖生理学研究工作。Tel：0931-8344298；Fax：0931-8340977 双峰驼是群居在荒漠草原的优良抗逆物种，繁 殖特性则属于精液诱导排卵的哺乳动物［1］。将公 驼精液经阴道输入或肌肉注射，均可诱导母驼排卵。 在肌肉注射公驼精清 4 h后，母驼外周血浆出现 LH 排卵峰值，达到 2 . 03 ± 0 . 71 ng·ml- 1，为肌肉注射 前 LH 基础水平的 2 . 64 倍，并在肌注后 36 ～ 48 h 中国农业科学 2003，36（1）：105 - 110 Scientia Agricultura Sinica 诱发母驼排卵，因此推测公驼精清内存在一种类似 促黄体素（LH）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）或促黄 体素释放激素（LHRH）活性的生物物质，暂称为诱 导排卵因子（ovulation-inducing factor，OIF）［2］。OIF 在公驼精清介质内相对稳定、耐热、对 pH的变化不 敏感［3］。近年来笔者应用生化方法，在离子交换纤 维素 DE52柱上洗脱出一个分子量为 19 442 u的活 性组分 L2，属碱性蛋白，继而将该组分在高效液相 色谱（HPLC）的排阻型填料 Diol-1000 柱上分离出 一个分子量 18 604 u的活性组分 L2-2，属酸性蛋白。 这 2个组分均可诱导母驼和小鼠排卵或超排卵［3］。 最终在反相 HPLC 的 ODS 柱上纯化出分子量为 8 251 . 51 u的 OIF纯品，为一单键多肽；纯化的 OIF 表现特有的生物学活性，当遇到空气和湿热环境，活 性位序呈现瞬间降解并释放大量 NH3 的特性，而固 定位序却相对稳定，降解较慢［4］。根据提纯 OIF 的 进程及其生化结构和特性，笔者推测公驼精清内的 OIF可能由几层性质不同的蛋白质所包裹，最外是 一层分子量为 20 804 u的粘蛋白，其内依次是碱性 蛋白、酸性蛋白［5］，这种特殊的结构已被最近的试 验所证实［6］。根据 OIF 的生化结构和肌注精清后 母驼外周血浆中各种激素的变化，笔者推测，母驼排 卵前 LH的释放可能是经过体液途径完成的，与由 神经刺激诱导排卵的兔和猫完全不同。为验证这种 推测，笔者试用从 DEAE-DE52柱上分离的活性组分 L2 进行 Na125 I标记，用同位素示踪技术证实 OIF进 入母驼体内的吸收部位和靶器官，从而阐明了双峰 驼的诱导排卵机理，为繁殖生物学增加了新的内容。 1 材料与方法 1 .1 测试母驼和对照 成年健康母驼 1 峰，7 岁，购自甘肃民勤县，体 重 180 kg，系苏尼驼后裔。连续直肠检查 3 d，未发 现卵巢上有小卵泡和黄体，判定未发情；专人放牧和 饲养，每日补饲玉米 3 ～ 4 kg。对照母驼 2峰，6 ～ 7 岁，为阿拉善驼品种，在屠宰地取器官样品作比较。 1 .2 诱导排卵蛋白（OIP）的制备 按文献［4］的方法取公驼精清 9 ml，分 2 次在 DE52（whatman）柱上，依梯度用 0 . 01 mol·L - 1、0 . 03 mol·L - 1和 0 . 06 mol·L - 1（pH 6 . 8 PBS）洗脱，重点 收集第二组分（L2）洗脱液，透析脱盐，即为 OIP 的 活性蛋白，冻干备用。 1 .3 活性组分 L2 的同位素碘标记 按 Mather报道的方法［7］，称取活性组分 L2 冻 干物 3 mg，依次加入125 I 20 mci 0 . 5 ml和氧化剂溴 代琥珀酰亚胺（NBS；sigma）0 . 6 mg反应 1 min，然 后用 4%BSA终止反应并立即在 SephadexG25柱上， 用 0 . 02 mol·L - 1（pH 7 . 4）PBS 洗脱，制备淋洗曲 线，取第 1峰 7 ～ 9管即 L2 标记物用于测试。 1 .4 母驼卵泡发育的检查、处理及血样制备 母驼发情后，每日检查并卵泡发育情况。 连续采血 3 d，每天 1次，作为母驼体内同位素的自 然本底（对照）；当右侧卵泡成熟后阴道输入125 I 标 记的活性组分 L2 3 ml。连续 3 h 从颈静脉采血 90 管，每管 4 ～ 6 ml，分离血清，冻存备测，验证精清中 的活性蛋白是否经血液吸收。 1 .5 母驼处理前后脊髓液的采取与制备 采用伏卧前肢保定法固定发情母驼，在母驼后 峰下 6 . 5 cm处，用手触及第五及第六腰椎间隙，使 用长 16 . 5 cm的 10 号针头，斜角刺入椎间隙，缓慢 向下刺入约 7 cm 左右，轻微上下移动，即可见清亮 透明的脊髓液涌出；如母驼变换体位时其压力不足， 可用 5 ml玻璃注射器抽取，在输入125 I 标活性蛋白 前后共采 6次，每次约 3 ～ 4 ml，冻存备用。 1 .6 受试母驼屠宰组织器官的取样和测定 受试母驼处理后 70 h在荒漠腹地屠宰、深埋之 前，按生殖内分泌学轴系（ovarian-hypothalamus-pi- tuitary axis，OA），从头部的下丘脑、垂体、视神经（对 照）处取样，将样品立即放入含有 20%驼血清的组 织培养液内（兰州兽医研究所病毒室配制）；剖开腹 部，取卵巢、卵泡液（0 . 5 cm 以上卵泡）、输卵管、子 宫、子宫颈、阴道等样品，小瓶分装冻存备测。各样 品经 - 20℃冻存 2 d，装冰瓶。血清、脊髓液样品则 分装每管 1 ml，用γ-计数器（Cap-Ria 16γ-Counter 美国 Capintec公司制造）测取样品的放射强度即每 分计数（cpm值），自动记录打印结果；其它样品称重 后计数方法基本同上。 1 .7 OIP的吸收动力学模型的确定与计算 血液中 OIP 浓度数据用电子计算机经非线性 最小二乘法进行曲线拟合，并算出相应 OIP血液动 力学一级参数［8］。统计学处理按常规方法进行。 2 结果与 2 .1 最佳量的确定和标记结果 应用 NBS 碘标法所标125 I-OIP 的淋洗曲线见 图 1。使用少量的 NBS，使标记率下降，从而减少对 样品中 OIP活性的影响和对垂体的辐射。经计算： 601 中 国 农 业 科 学 36卷 第 7 ～ 9 标记管的 cpm 值为 41 981 × 104，每 1 次 cpm值约等于 0 . 0357 ng；标记率为 59%；放射性比 强度为 39 . 3 mci·mg - 1，半衰期为 59 . 3 d，体外稳定 性约为 72 h。用 20 mci剂量按上方法标记的125 I- OIP，能使输入母驼体内的 OIP示踪痕迹清晰可辨； 但体外稳定期即标记物“脱碘”必须重视。因时空上 所存在的差距，故需精心控制试验方法和时间，严格 执行，在 40 h内完成首次试验。 图 1 NBS法碘标诱导排卵活性蛋白在 Sephadax-G25柱的 淋洗 Fig . 1 Iodination of OIP eluted on sephadax-G25 column by method of NBS 2 .2 OIP蛋白在血液中的浓度 自然交配中，公驼精液进入阴道后，有一个暂短 的时滞，约 2 min，这可能是精液液化过程必需的最 长时间；然后进入血液，呈波浪式吸收，于第 27、35 分钟出现 2个吸收峰值，见图 2。这 2次冲击波，很 可能就是引起 4 h后的 LH峰的生化反应能量。表 2所列为活性蛋白输入阴道后浓度变化规律的测试 数据，其 OIP浓度变化的最佳数学模型属一级吸收 二室开放模型［7］，经计算得出的参数见表 1。 图 2 双峰驼诱导排卵活性蛋白阴道输入后血浆浓度与时 间曲线 Fig . 2 Curve change between peripheral serum concentration of OIP and times after insemination in the femal camel 表 1 母驼阴道输入活性蛋白（0 . 857 ng·kg - 1）的血液代谢动力学参数 Table 1 Dynamic parameter of bioprotein absoluded by blood circulation in famel camel 参数 Parameter to（min） ka （min - 1） t1 / 2ka （min） tm （min） Cmax （µg·ml - 1） k （min） t1 / 2k （h） 参数值 Value of parameter 0（2） 0 . 067 10 . 24 23 5 . 15 19 . 0 72 . 6 由表 1可以看出，发情母驼阴道输入 1 . 5 mg碘 标活性蛋白后，吸收速率常数为 0 . 067·m- 1，几乎 没有时滞，立即进入血液，推测与阴道粘膜存在特异 受体转运有关，为主动吸收；加之交配时，催产素有 节律的释放，阴道与子宫粘膜的活动性增加，加快了 这一主动吸收过程，其吸收半衰期为 10 . 24 min，于 第 23分钟达到 Cmax 5 . 15µg·ml - 1，然后以较快的 速率下降，分布半衰期为 19 min，而清除项半衰期 很长，近 72 . 6 h，这是否与该碱性蛋白在体外相对稳 定，在体内与受体结合为复合物有关，尚待讨论。笔 者选用经 DEAE-DE52洗脱的活性组分 L2 供碘标记 用，是运用 OIF的生化结构和生物学特性知识进行 的一次成功尝试。 2 .3 OIP在脊髓液中的浓度 阴道输入前抽取 2 次脊髓液样品，OIP 的浓度 测定值均低于血液浓度的本底值，为 3 . 2 ～ 4 . 9 ng· ml- 1，而在输入后第 16分钟，浓度略增为 11 . 4 ng· ml- 1；第 81分钟，所测值为 13 . 2 ng·ml- 1，而第 5 ～ 6次（3 ～ 4 h）采集样品浓度明显增高，测值为 69 . 3 ～ 89 . 2 ng·ml- 1，脊髓液中已存在活性蛋 白，它是如何进入脊髓液的，有待进一步研究。 2 .4 诱导排卵因子的靶器官 母驼于处理后 70 h屠宰，按生殖内分泌学的核 心学说下丘脑、垂体、性腺轴系（OA）采样，分析 OIF的靶器官（表 2）。 根据取样的计数和浓度，明显看出 OIF 的靶器 官是垂体。其它组织与器官的 OIP浓度，似与供血 量有关。 7011期 潘光武等：双峰驼诱导排卵机理的研究 .Ⅱ .双峰驼诱导排卵因子的靶器官及代谢动力学 表 2 诱导排卵因子（OIF）的靶器官及样品对照 Table 2 The target organ of OIF and control samples 器官和部位 Tisues and site 意义 Significant 样品计数 γ-cpm of sample 相对浓度 Relative concentration （ng·ml- 1，ng·g - 1） 备注 Remarks 下丘脑 Hypothalamus 轴系 OA 92 . 00 3 . 284 视神经 Optic chiasma 对照 Control 130 . 00 4 . 641 垂体 Pituitary 轴系 OA 1 908 . 00 68 . 133 垂体培养液 Culturel fluid 轴系 OA 37 . 80 1 . 349 卵巢 Ovary 轴系 OA 1 162 . 50 41 . 490 双侧平均数 Mean in both sites 卵泡液 Follicular fluid 轴系 OA 418 . 00 14 . 922 红体 Corpus hemarrhagica 对照 Control 474 . 00 16 . 920 输卵管 Ovuduct 对照 Control 479 . 00 17 . 100 双侧平均数 Mean in both sites 肋间肌 Musles between costa 对照 Control 483 . 00 17 . 243 血清对照 Serum control 对照 Control 170 . 80 6 . 098 平均数 Mean 双峰驼的垂体位置在解剖学上与其它家畜或动 物不同，在颅底蝶骨处无垂体窝，用利器凿开骨质疏 松的蝶骨可见在脑膜下视神经交叉后约 2 . 2 cm 处 有一个直径为 2 . 5 cm，边缘薄、中央厚的青紫色圆 形纽扣状物，柄极短；该圆形扣状物紧贴在丘脑之 上；将此器官从柄处剪断，放入组织培养液 40 min 后，这一扣状物恢复为解剖学中描述的垂体，呈扁圆 形。该母驼垂体重 1 . 932 g，在其下部存在一个约 0 .4 cm × 1 . 2 cm的垂体腔；垂体前、后部可辨认，其 cpm值分别为 1 856 和 1 961 或体内相对含量为 66 . 25 ng·g - 1和 70 . 00 ng·g - 1，差异不显著。 2 .5 OIP的吸收部位 经碘标的 OIP约 3 ml，加入适量精清混匀后输 入母驼阴道前端于第 70 小时屠宰，深埋之前，在生 殖系统从内向外取样，确定活性蛋白的吸收部位，所 测结果见表 3。 表 3 活性蛋白在母驼生殖器官中的分布 Table 3 The Distribution of bioprotein absorbed by various tissues or organs genitalia in femal camel 组织和部位 Tissues and site 样品计数 γ-cpm of samples 相对浓度（ng·g - 1） Relative concentration 阴道 Vagina 阴道深部距宫颈外口 15 cm处组织Ⅰ 15 945 569 . 3 Vagina anterior tissues site 15 cm to orificium ext . cervix 阴道深部距宫颈外口 10 cm处组织Ⅱ 8 132 290 . 3 Vagina anterior tissues site 10 cm to orificium ext . cervix 阴道穹窿部距宫颈外口 5 cm处 16 246 579 . 9 Vagina fornix site 5 cm to orificium ext . cervix 子宫颈 Cervix 子宫颈外口 Orificium ext . cervix 2 470 . 0 88 . 2 子宫颈管中部 Middle cervix canal 276 . 0 9 . 8 子宫颈管内口 Orificium int . cervix 163 . 0 5 . 08 子宫 Uterus 子宫内膜Ⅰ距宫颈内口 5 cm处 524 . 0 18 . 7 Uterus mucosa membraneⅠsite 5 cm to orificium int . cervix 子宫内膜 II距宫颈内口 8 cm处 449 . 0 16 . 0 Uterus mucosa membraneII site 8 cm to orificium int . cervix 子宫角 Uterine horn 右子宫角 Right uterine horn 831 . 0 29 . 6 左子宫角 Left uterine horn 169 . 0 6 . 0 输卵管 Ovuduct 右输卵管 Right ovuduct 603 . 0 21 . 5 左输卵管 Left ovuduct 355 . 0 12 . 7 卵巢 Ovarian 右卵巢 Right ovarian 1 352 . 0 49 . 33 左卵巢 Left ovarian 997 . 0 35 . 59 801 中 国 农 业 科 学 36卷 表 3数据表明，阴道输入 OIP蛋白的主动吸收 部位在阴道前端网格状区，吸收区域有间隔存在，这 可能又与阴道内的环状皱襞基部受体数量有关。随 着交配时阴道和子宫壁的节律收缩、部分精液中的 OIP随精液通过子宫颈进入子宫，从上述数据分析， 子宫颈管无主动吸收功能，而子宫体后部仍有部分 主动吸收功能，居次要位置；OIP似乎与精子趋化性 一致，表现为右侧的子宫角和输卵管以及卵巢的浓 度均高于左侧，这也与右侧充血或血液供应充分有 关。 3 讨论 3 .1 由公驼分泌的雄性激素 OIF去启动并调控母 驼的排卵，这在哺乳动物的生殖生理中尚属首例。 本项研究限于人力与资金仅作 1 例同位素示踪，从 宏观上证明了公驼精清内的 OIF 是在阴道主动吸 收，经血液循环，穿过血脑屏障，途径下丘脑到达垂 体的；大量 OIF的涌入和积累介导垂体释放 LH 峰 诱导母驼排卵，这种特殊的排卵机理与下丘脑调节 是否有关，尚待讨论。从哺乳动物脑部的解剖学特 征分析，GnRH类似物的输送能穿过血脑屏障中少 数未被胶质细胞的致密鞘所遮蔽的血管网状联络结 构进入下丘脑，继而到达垂体。垂体与下丘脑、脑及 下行血管间的 7个不同通道可能是一些脑活性肽顺 流而下或逆流而上的微循环系统，参与垂体—下丘 脑的短负反馈调节［10］。 3 .2 受试母驼垂体的解剖学特征 （1）双峰驼的垂体位于脑膜之下，视交叉后或 下方约 2 ～ 2 . 5 cm处，观察受试及对照母驼，均发现 在颅底蝶骨不存在垂体窝。（2）对照母驼 2例的垂 体形态均呈粟状、色深黄，每粒净重分别为 0 . 716 g 和 0 . 963 g，体积较小；而受试母驼垂体呈圆形纽扣 状、青紫色、垂体重 1 . 932 g，体积较大。比较结果说 明，受试母驼的垂体形态和色泽异常，可能是由于处 于某种生理应激状态，也可能是接受 OIF 信息后的 分泌形态，上述推测，需再做病理切片，组织化学分 析后，作初步结论。 3 .3 试验结果表明，阴道输入 OIP后，吸收过程不 同于化学浓度和渗透压改变而引起的扩散或吸收， 因为阴道是由数层粘膜和肌肉组成的外生殖器官。 从吸收模式上看，在第 27、35 分钟，阴道 OIP 浓度 相对降低，但血清中却出现了 2 次 OIP 峰值，不能 用渗透压作解释，而可能是阴道粘膜上的受体以及 上皮细胞间转运蛋白的综合作用引起的，而转运泵 的调节与控制可能与驼发情时激素调节有关，此时， 雌二醇浓度很高，为 28 . 98 ± 6 . 97 pg·ml- 1，而 LH 含量很低，平均为 0 . 77 ± 0 . 45 ng·ml- 1，FSH 浓度 逐渐上升，为 4 . 42 ± 1 . 96 ng·ml- 1。OIF 是具有 GnRH活性的多肽，进入垂体后，即引起 LH的升高 和 FSH 的分泌，以及外周血浆雌二醇下降，为 OIF 在体内的分布提供新的信息与环境。 将活性蛋白 3 mg溶于碘标氧化反应液终体积 为 3 ml，其后在 sephadexG25柱淋洗，其碘标记产物 的终浓度很低，清亮明澈，能否被母驼体内受体识 别，不容忽视。为确保示踪测试成功，根据 NBS 法 碘标原理，淋洗第 1峰的碘标活性蛋白带有正电荷， 笔者所做等电聚焦电泳（ IEF）的结果显示，自然降 解的公驼精清中至少有 5 种蛋白带负电荷，并随降 解时间增加而浓度变高。根据上述事实，笔者在低 温下，加入适量自然降解的公驼精液，使酸、碱活性 蛋白以离子键的结合方式回归到精清之中，这一有 益的尝试似乎对本次试验是有帮助的。 3 .4 脊髓液的穿刺因驼峰的位置和其脊柱的特点 而受到阻碍，在无先例参考的情况下，笔者在活体上 摸索出抽样的体位和部位，但很遗憾，仅取样 6 份， 其中最后 2 份样品说明 OIF 进入脊髓液，浓度达 69 . 3 ～ 89 . 2 ng·ml- 1，该结果可从有关 GnRH类似 物能渗透到脊髓液中并在第三脑室底部的室管膜细 胞（tanycytes）摄取的报道中得到启示［11］；已知，纯 化和半纯化的 OIF具有 GnRH活性，其内 OIF的固 定位序的氨基酸残基是否可能蕴藏着更多的调控信 息，需进一步探讨。 3 .5 目前养驼学领域中已涉及起源进化、品种资 源、生产性能及躯体局部解剖学等，但脑解剖学仍无 学者涉足，因此有关 OIF在下丘脑-垂体间的联系和 调节也只能参阅现有资料做解释。从母驼局部解剖 学看，母驼垂体位于颅内，其柄很短，使垂体与下丘 脑更为贴近，下丘脑属间脑，围绕着第三脑室之底， 在驼视交叉后约 2 ～ 2 . 3 cm 处；下丘脑腹部有微血 管，通过界限不明的正中隆起毛细血管，汇集到垂体 前叶血管窦网状结构的门脉循环进入垂体。哺乳动 物的下丘脑有众多核群，支配体温、平衡、睡眠、损 伤、应激等生理功能，据笔者长期饲养驼群的观察， 双峰驼的智能可与乘马并论，是反应灵敏的家畜。 综上所述，并从测出的数据来看，OIF是经过下丘脑 而积累在靶器官垂体的，下丘脑并未参与调节母驼 排卵。 9011期 潘光武等：双峰驼诱导排卵机理的研究 .Ⅱ .双峰驼诱导排卵因子的靶器官及代谢动力学 References ［ 1］ 陈北亨，康承伦，员志贤，葛荣欣 . 骆驼的繁殖生理（第 2报）， 骆驼的性活动 . 畜牧兽医学报，1980，11（2）：65 - 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